Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Biology
Click here for the English version

Biology

Histochemische kleuring van Published: May 13, 2014 doi: 10.3791/51381
Automatic Translation
1,2, 1,2
1Feedstocks Division, Joint Bioenergy Institute, 2Physical Biosciences Division, Lawrence Berkeley National Laboratory

Introduction

De celwand fabriek heeft een overvloed aan informatie binnen de verschillende onderdelen: lignine, cellulose, hemicellulose (xylan, glucuronoxylan, xyloglucan, arabinoxylan, gemengde koppeling glucaan, of glucomannaan), en pectine. Histologische technieken bieden belangrijke visuele aanwijzingen in het bestuderen van verschillen binnen de secundaire celwanden op organisatorisch en cellulair niveau. Verschillende histologische technieken werden ontwikkeld en is te vinden in de literatuur, maar deze technieken kan uitdagend en tijdrovend zijn voor beginners omdat zeer gedetailleerde protocollen met eenvoudige visuele instructies zijn zelden of nooit beschikbaar. Het doel van deze studie is om eenvoudige richtlijnen voor de histologische kleuring technieken bieden om beelden van hoge kwaliteit te verkrijgen.

Snijden de stengel is de eerste stap bij visualisatie van celwanden en celvormen. Hoewel met de hand gesneden secties zijn goedkoop en nemen minder tijd voor te bereiden, gebruik van een vibratome biedt consistentie enlevert beelden van hoge kwaliteit. Met een vibratome kan produceren betere kwaliteit van de gegevens door het genereren van gelijke delen met dezelfde dikte, die helpt om scherpe beelden te produceren en vermindert de kans op het produceren onnauwkeurige verschillen tussen de monsters die eenvoudig worden veroorzaakt door een slechte monstervoorbereiding. Harsen gebruiken om verse exemplaren vast te stellen kan een uitdaging voor beginners en kan nog steeds tijdrovend zijn, zelfs voor experts als een analyse moet snel worden gedaan. Bovendien wordt het onmogelijk om eventuele biologische activiteit te meten met het monster wanneer deze is ingebed in een hars. Een eenvoudige techniek die agarose en een zelfgemaakte mal werkzaam is nuttig voor het inbedden stam weefsels, en het kan ook worden gebruikt in andere toepassingen die dissectie van zacht weefsel. Vergeleken met inbedding specimens hars, heeft deze methode het voordeel dat de weefsels in leven en reducerende monsterbuffer manipulatie. Snijden weefsels via een vibratome is zeer nauwkeurig en genereert homogenlende secties, die, afhankelijk van het doel van de studie, dan kan worden gebruikt met verschillende kleuringen.

De eenvoudigste methoden om lignine en andere aromaten visualiseren in dienst ultraviolet (UV) licht. Excitatie van aromatische gebaseerde moleculen met UV licht is een oude techniek, maar het is nog steeds een van de snelste benaderingen voor visualisatie van lignine. Echter, UV-visualisatie is eigenlijk niet ideaal voor lignine detectie omdat UV-licht andere aromaten zal prikkelen. Lignine bestaat voornamelijk uit drie bouwstenen, de monolignols (hydroxycinnamyl alcoholen: coniferylalcohol, sinapyl alcohol, en p-coumaryl alcohol) 1-3. Phloroglucinol vlek kan aanwijzingen geven de mate van cinnamaldehydes aanwezig in het xyleem, vezels, weefsels en trachea 4. Floroglucinol is een goede indicator van de algemene cinnamaldehydes en kan onderscheid maken tussen cinnamaldehydes en andere aromaten. De sinapyl alcohol monomeren kan worden gedetecteerden gedifferentieerd door het gebruik Maule vlek. Toluïdineblauw O is een polychromatische kleurstof en derhalve is de mogelijkheid om verschillende onderdelen van de celwand vlekken in verschillende kleuren 5,6. Het primaire gebruik van toluïdineblauw O is aan pectine en lignine 5,6 detecteren. Het voordeel van toluïdineblauw O is dat veel elementen van de celwand kan worden gevisualiseerd in een enkele stap. Zowel calcofluor witte en congorood gemakkelijk in gebruik en kunnen worden gebruikt om cellulose te visualiseren. Calcofluor witte vlekken cellulose, callose, en andere niet-gesubstitueerde of gesubstitueerde zwak β-glucanen 6-9, terwijl Congo rood vlekken direct β-(1 → 4)-glucanen en in het bijzonder cellulose 10,11. Het doel van deze studie is om eenvoudige richtlijnen voorzien in het gebruik van de hiervoor genoemde kleuring technieken om beelden van hoge kwaliteit te verkrijgen van A. thaliana stengels.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

1. Stem Embedding

  1. Maak een 7% agarose-oplossing in water (7 g elektroforese-grade agarose in 100 ml gedestilleerd water). De agar autoclaaf gedurende 20 minuten of door de magnetron gedurende 20 minuten bij laagste intensiteit (bijvoorbeeld 10% intensiteit van een 1250 watt magnetron).
  2. Bereid een zelfgemaakte mal voor het inbedden van de stelen met behulp van plastic flesjes.
    1. Met behulp van een scheermesje, afgesneden van de conische bodem van 2 ml met schroefdop microcentrifugebuis (deel A). Met een injectienaald, prik een gat in de buis dop iets groter dan de diameter van de steel worden ingebed. Vervolgens cut 0,5 cm van de bodem van een 0,6 ml microcentrifugebuis (deel B).
    2. Voeg de cut-off van 0,5 cm deel van de 0,6 ml microcentrifugebuis in de voorgesneden 2 ml microcentrifugebuis. Dicht de twee delen met Parafilm (figuur 1). OPMERKING: De onderkant van de buis wordt gesneden om de verwijdering van de ingebedde monster vergemakkelijken nadat de agarose is gestold. Thij gat in de dop zal helpen bij het houden van de stam stabiel als de stam is ingebed in agarose. De schimmel zal dienen om de agarose te houden en houd de stam recht bij het inbedden. De Parafilm houdt de beide delen A en B, totdat de agarose is ingesteld en de steel is ingebed.
    3. Met behulp van een scheermesje, snijd een deel voort uit het gebied van belang, (bijv. midden van de eerste stam internodium). OPMERKING: Idealiter zou de stengel vlak voor inbedding vernietiging te voorkomen door dehydratatie worden gesneden. Alternatief kan de steel tijdelijk opgeslagen in een plaat met een filterpapier bevochtigd met water. Deze plaat kan op ijs tot klaar om te worden ingebed weefsel uitdroging en vervorming te voorkomen worden geplaatst. Opslag van de steel voor een periode langer dan 30 minuten zonder hoge vochtigheid zal de steel te drogen.
  3. Smelt de agarose in de magnetron op lage intensiteit. LET OP: De fles met agarose kan heet zijn. Gebruik een mitt te halen de fles. Laat de gesmolten agarose stand bij kamertemperatuur (tussen 20 ° C en 25 ° C) tot het afkoelt tot ongeveer 50 ° C.
  4. Langzaam pipet 5 ml van de agar in de premade plastic mal om het flesje te vullen. OPMERKING: Zorg ervoor dat er geen luchtbellen in de mallen. Luchtbellen lacunes leiden in de agarose mal en zal niet volledig bedekken de stam steekproef, die uiteindelijk zal leiden tot ongelijke snijden van het monster secties.
    1. Laat de agarose afkoelen 30-60 sec tot halfvaste geworden. Test met een kleine tandenstoker, om ervoor te zorgen dat het kan binnendringen en opstaan, maar niet zweven, in de agarose. OPMERKING: Als de stam wordt geplaatst wanneer de agarose nog warm is zal het monster beschadigen door verschrompeling van de stam, het vernietigen van de cel morfologie.
    2. Plaats de steel in deze agarose-vial. Zorg ervoor dat de steel blijft recht. Plaats de geperforeerde dop zodanig dat het uiteinde van de steel wordt gehouden door de kap. Draai niet aan de schroefdop. Soms meer dan een stam (van een enkele soort) kan embe zijndded in een enkele flacon; maar in dat specifieke geval geen gebruik maken van de dop. OPMERKING: Als de schroefdop is ingeschakeld, zal de stam krijgen twisted.
  5. Laat het flesje bij kamertemperatuur of bij 4 ° C gedurende 10-30 min, totdat het stolt.
  6. Verwijder de mal door het voorzichtig uit de buis te schuiven. Open de Parafilm. Duw de onderkant van deel B van de mal voorzichtig met duim om de gestolde agarose bevrijden van deel A op een glazen objectglaasje.
  7. Snij de agarose ingebed stam in drie ongeveer gelijke stukken van 1,2 cm. Knip het deel van de stengel die niet in de agarose en gooi deze weg.
    1. Bewaar deze stukken van agarose met de embedded stengels in luchtdichte 2 ml microcentrifugebuizen in een donkere doos bij 4 ° C tot gebruik sectie. Ook bewaart de buizen bij 4 ° C gedurende maximaal een week. OPMERKING: Opslag is mogelijk, maar de onderzoeker moet zich bewust zijn dat de ingebedde stengels zijn nog in leven en, afhankelijk van het experiment, Artefacten zou kunnen worden ingevoerd.

2. Stem Sectioning

  1. LET OP: Lees de vibratome zorgvuldig en volg alle veiligheidsinstructies.
  2. Zorg ervoor dat het monster schijf schoon en volledig droog (vrij van vaste of vloeibare). Maak de objectplaatje met een scheermesje om eventuele lijmresten van eerdere experimenten te verwijderen en wassen met water. Dan droog met een papieren handdoek. OPMERKING: Dit zal ervoor zorgen dat de lijm werkt goed en bindt aan de agarose specimen. Als deze stap niet goed wordt uitgevoerd, is het mogelijk dat het monster niet kan voldoen aan de schijf en zal later leiden tot het monster af de schijf valt tijdens het snijden.
    1. Gebruik zacht papier doekjes om eventueel vocht uit de agarose blok met de exemplaren te verwijderen.
    2. Breng een druppeltje weefselhechtmiddel op de objectplaatje. Streak uit de lijm het gebied in het midden van de plaat bedekken met de punt van de lijm fles. Snel plaatsde agarose blok zodat de specimens ofwel loodrecht op of parallel aan de plaat transversale en longitudinale doorsneden, respectievelijk. Laat de lijm het monster vast aan de objectplaatje bij kamertemperatuur of bij 4 ° C gedurende 10-30 minuten. OPMERKING: Dit is een tijd-gevoelige stap.
  3. Bevestig de objectplaatje op zijn plaats op de buffer lade of trog. Het blok / s agarose met de onderdelen dient tegelijk met het scheermesje. Vul het bufferbak met gedestilleerd water bij kamertemperatuur totdat de monsters volledig ondergedompeld.
  4. Snijd een scheermesje in de helft en dan snijd de uiteinden met een stevige schaar, zodat het blad vlak blijft. Bevestig de helft van de voorgesneden scheermesje op de meshouder.
    1. Stel de hoek op de meshouder tot 84 °, de snelheid tot 0,90 mm / sec (positie 8 op de vibratome) en de frequentie tot 50 Hz (positie 5 op de vibratome). Maak doorsneden van 100 urn dik. Gebruik continue modus. NOTE: Deze dikte is geselecteerd om te verzekeren dat het weefsel de verschillende zuur en base behandelingen gebruikt in sommige van de kleuringsprotocollen kan weerstaan. Stel het venster voor het snijden en laat 15-20 minuten op een continue wijze voor de vibratome sectie een agarose blok van ongeveer 1,2 cm.
  5. Verzamel de secties met een wegwerp plastic pipet tijdens het snijden in de buffer lade. Als alternatief kan de secties worden overgedragen van de buffer lade in een glazen beker en vervolgens naar een duidelijke Petri plaat. Transfer paar secties om de 2,0 ml microcentrifugebuizen. Opmerking: De monsters zijn verzameld uit een Petri schaal omdat het gemakkelijker is om de onderwerpen op een heldere achtergrond zien, en omdat de bufferbak kan worden klaar voor het volgende monster.
  6. De secties kunnen worden opgeslagen in een 50 ml buis of verzameld en opgeslagen in 1,5 tot 2 ml microcentrifuge buizen bij 4 ° C gedurende 30 tot 60 minuten. OPMERKING: Het opslaan van de secties voor langere perioden zullen resulteren in een slechte beeldkwaliteit.

    3. Microscoop en Camera Setting for Imaging

    1. Pas de Koehler verlichting op de microscoop. Kies een doel. Focus op het model eerste. Breng de lichtintensiteit aan de helft of minder. Sluit het velddiafragma (FD) en diafragma (AP) of brengen de laagst mogelijke stand op die doelstelling.
      1. Hoe hoger de vergroting, hoe groter de ring zal zijn. Gebruik de condensor focalisatieknop om het veld iris zich zo sterk mogelijk te maken.
      2. Langzaam breng het beeld van het veld iris (zeshoekige kleine ring) naar het centrum via de condensor-centrering knoppen (pin-vormige schroeven rondom de condensor). Verhoog langzaam het membraan (FD), zodanig dat het veld iris de rand bereikt. Stoppen met het verhogen van de FD net na het veld iris de rand is verstreken.
      3. Verhoog langzaam het diafragma (AP) om het contrast aan te passen. Pas de lichtsterkte naar behoefte. OPMERKING: Koehler verlichting moet worden aangepast voor elke oOEL, elke experimentele dag. Noteer de nummers verkregen na correctie voor de dag. Deze nummers zullen worden hergebruikt elke keer dat de doelstellingen heen en weer worden geschakeld voor die bepaalde dag.
    2. Stel het diafragma, de intensiteit, belichtingstijd, gain, en filters zoals beschreven in Tabel 1. Deze informatie mag alleen worden gebruikt als een gids.
    3. Gebruik een hoge resolutie digitale camera met een groot formaat interline CCD-chip zonder mechanische sluiter om de fluorescentie beelden vast te leggen; en een hoge-resolutie, high-speed camera voor bright-field beelden.
    4. Verwerk de dia met standaardsoftware. Laad de software. Klik op "Acquire" en "Set camera / board 'en selecteer de camera te gebruiken. Klik op "OK." Klik op "Ophalen" gevolgd door "tabblad Kleur." Under "tab Color," kies "Bayer methode" gevolgd door "Gemiddeld vier." Voeg de voorgestelde versterking (rood, groen, blauw) weerm. Tabel 1. Selecteer het tabblad "Set opslaan" en klik op de map waar afbeeldingen moeten worden opgeslagen. Stel "Sluitertijd" van de suggesties in Tabel 1. Stel "Binning" op "1" en "Leef binning" op "1." Focus op het gebied van belang en klik op "Opslaan levend."
    5. De beelden op de camera software zijn in de "TIF" formaat. Analyseer de afbeeldingen voor orthopedie van de celtypen. Maken gebruik van standaard software voor downstreamgebruik van presentatie en publicatie.

    4. Ultraviolet en bright-field imaging

    1. Gebruik een pipet 1 ml met pipet tip gesneden zodat de delen gemakkelijk kan worden gepipetteerd uit. Voorzichtig pipet secties in de punt en op een microscoopglaasje. Bedek de secties met een dekglas. Let op de secties onder UV-licht of bright-field verlichting.

    5. Phloroglucinol-HCl (Wiesner) kleuring 12

    1. Los 0,3 g floroglucinol in 10 ml absolute ethanol met 3% phloroglucinol te bereiden. Meng een deel geconcentreerd HCl (37 N) twee volumes 3% floroglucinol in ethanol; deze oplossing floroglucinol-HCl (Ph-HCl) of Wiesner vlek. OPMERKING: Deze oplossing is vers gemaakt worden op de dag van de kleuring en kan niet worden opgeslagen, omdat de oplossing zal na verloop van tijd en de vlekken komen te vervallen. LET OP: HCl is zeer corrosief, dus heel voorzichtig tijdens het hanteren van de Ph-HCl vlek.
    2. Transfer stengeldelen een 2,0 ml microcentrifugebuis. Voeg 1 ml van de Ph-HCl oplossing voor de buis met de secties en dop onmiddellijk omdat het HCl in de Ph-HCl vlek is zeer corrosief. Beweeg de buis om te verzekeren dat alle onderdelen zijn gekleurd. Een alternatief voor deze stap is het dopje open te houden zodat de Ph-HCl-oplossing op en neer kan worden gepipetteerd, bij voorkeur zonder de secgen. OPMERKING: Zorg dat u de onderdelen niet te pipet in de pipet tip, als deze die delen kunnen beschadigen.
      1. Gebruik een pipet 1 ml met de pipetpunt gesneden zodanig dat de delen gemakkelijk kunnen worden gepipetteerd zonder schade. Voorzichtig pipet secties in de punt en op een objectglaasje. Bedek de secties met dekglas. Let op de secties onder bright-field verlichting. OPMERKING: De Ph-HCl-oplossing droogt 5-10 minuten, waardoor een verslechtering van de specimens. Daarom is de beeldvorming moet worden voltooid binnen die periode.

    6. MAULE kleuring 13,14

    1. Los 0,2 g kaliumpermanganaat in 40 ml gedestilleerd water tot een 0,5% kaliumpermanganaat oplossing te bereiden. Bewaren in een donkere fles bij kamertemperatuur gedurende maximaal 7 dagen.
      1. Bereid een 3,7% HCl-oplossing door toevoeging van 1 ml geconcentreerd HCl (37 N) 9 ml gedestilleerd water (01:10). Bereid een verse 3,7% HCl-oplossing op dedag van het experiment. Zorg ervoor dat de 37 N HCl stockoplossing wordt gebruikt is niet te oud. Geconcentreerd ammoniumhydroxide-oplossing (14,8 M) moeten worden bewaard bij 4 ° C te voorkomen dat de molariteit van de verzadigde oplossing van af.
    2. Transfer stengeldelen een 2,0 ml microcentrifugebuis. Voeg 1 ml van de 0,5% kaliumpermanganaatoplossing de buis met de secties.
      1. Pipetteer de 0,5% kaliumpermanganaat-oplossing op en neer voorzichtig, bij voorkeur zonder de secties. Incubeer gedurende 2 minuten en herhaal het pipetteren. Laat de microcentrifugebuisje staan ​​totdat alle secties settelen. OPMERKING: Zorg dat u de onderdelen niet te pipet in de pipet tip als voor de afdelingen kan beschadigd raken. Het kan moeilijk zijn om de stengeldelen zien als de oplossing is donker, dus houd de buis met de hoofdstukken over reageerbuis rek en laat ze gedurende 2 minuten.
      2. Met behulp van een pipet 1 ml, trekken uit 700 pi van 0,5% kaliumpermanganaat oplossing.Voeg 700 ul van gedistilleerd water te spoelen kaliumpermanganaatoplossing. Herhaal dit 3-4x of tot de oplossing van water helder blijft.
      3. Gooi het water. Voeg snel 1 ml 3% HCl tot de diepbruine kleur van de secties wordt afgevoerd. Dit kan gebeuren binnen 3-5 min dan 2 wasbeurten van 5 minuten elk vereist. Pipet alle 3% HCl-oplossing en meteen doorgaan naar de volgende stap.
      4. Voeg 1 ml geconcentreerde ammonia. Gebruik een pipet 1 ml met de punt gesneden zodanig dat de delen gemakkelijk kunnen worden gepipetteerd zonder schade. Voorzichtig pipet secties in de punt en op een objectglaasje. Bedek de secties met een dekglaasje. Let op de secties onder bright-field verlichting. LET OP: Omdat ammonium hydroxide is uiterst corrosief, het vereist extra zorg en aandacht om te voorkomen dat corrosie van het stadium van de microscoop of de lens. OPMERKING: De ammoniumhydroxide dampen kan het dekglaasje mist, waardoor het moeilijk is om het monster te observeren. Wees daarom extra voorzichtig voor het toevoegen van het dekglaasje. De oplossing droogt in 5-10 minuten, zodat de beeldvorming moet worden voltooid binnen die periode.

    7. Congo rood kleuring 11,15

    1. Los 0,5 g congo in 100 ml gedestilleerd water tot een 0,5% Congo rood te bereiden.
    2. Transfer stengeldelen een 2,0 ml microcentrifugebuis. Voeg 1 ml van de 0,5% Congo rood-oplossing aan de buis. Pipet voorzichtig de 0,5% congo rode oplossing op en neer zonder verstoring van de secties. OPMERKING: Zorg dat u de secties in de pipet tip omdat dit de secties schade niet te pipet.
      1. Incubeer bij kamertemperatuur gedurende 10 minuten en herhaal het pipetteren. Breng vervolgens nog 3 min incubatie bij kamertemperatuur.
      2. Gebruik een pipet 1 ml te trekken uit 700 pi van 0,5% congo rode oplossing. Voeg 700 ul van gedistilleerd water te spoelen de congo rode oplossing. Herhaal het wassen 3-4x tot het sopis duidelijk.
      3. Gebruik een pipet 1 ml met de punt gesneden zodanig dat de onderdelen gemakkelijk kunnen worden gepipetteerd zonder schade. Voorzichtig pipet secties in de punt en op een objectglaasje, en bedek ze met een dekglaasje. Let op de monsters op de microscoop dia onder blauw licht excitatie met behulp van een filter met een bandpass van 560/40. OPMERKING: Raak de onderdelen in het water op te slaan voor lang voor de microscopische analyse, zoals het water de congo rode uitwasbaar zijn in 10-30 minuten.

    8. Calcofluor Wit kleuring 9

    1. Los op 0,02 g van fluorescerende witmakers 28 (calcofluor wit M2R) in 10 ml gedestilleerd water tot een 0,2% stockoplossing te bereiden. De 0,2%-oplossing kan worden opgeslagen gedurende zes maanden in een donkere fles bij 4 ° C. Bereid een werkende oplossing van 0,02% door verdunning van de 0,2% stockoplossing 10x met gedestilleerd water.
    2. Transfer stengeldelen een 2,0 ml microcentrifugebuis. In de buis 1 ml van 0.02% calcofluor wit oplossing. Pipet voorzichtig de 0,02% calcofluor witte oplossing op en neer. OPMERKING: Zorg dat u de secties in de pipet tip omdat dit de secties schade niet te pipet.
      1. Incubeer bij kamertemperatuur gedurende 5 minuten en herhaal het pipetteren. Incubeer de sectie nog 3 min bij kamertemperatuur geroerd. OPMERKING: Laat de secties om zich te vestigen op de bodem van de buis om het gemakkelijker maken om pipet uit de oplossing zonder beschadiging van de secties.
      2. Gebruik een pipet 1 ml te trekken uit 700 ul van 0,02% calcofluor witte oplossing en voeg 700 ul van gedestilleerd water; wacht 5 min te spoelen de calcofluor witte oplossing. Herhaal het wassen 3-4x. Gebruik een pipet 1 ml met pipet tip cut op zodanige wijze dat de delen gemakkelijk kan worden gepipetteerd uit zonder schade.
      3. Voorzichtig pipet secties in de punt en op een objectglaasje en dek ze af met een dekglaasje. Let op de secties onder UV-licht.

    9. Toluidine Blue O kleuring 16,17

    1. Los op 0,02 g toluïdineblauw O in gedestilleerd water tot 100 ml van een 0,02%-oplossing te bereiden. OPMERKING: De toluïdineblauw O oplossing kan worden bewaard gedurende twee weken in een donkere fles op kamertemperatuur.
    2. Transfer stengeldelen een 2,0 ml microcentrifugebuis. Voeg 1 ml van 0.02% toluïdine blauw O oplossing aan de buis. Pipet voorzichtig de 0,02% toluïdineblauw O oplossing op en neer. Vervolgens incuberen bij kamertemperatuur gedurende 5 minuten en herhaal het pipetteren keer. OPMERKING: Zorg dat u de secties in de pipet tip omdat dit de secties schade niet te pipet. Laat de microcentrifugebuisje stilstaan ​​totdat de secties settelen. Dit kan moeilijk zijn om te zien, als de oplossing is donker, dus houd de buis met de hoofdstukken over reageerbuis rek en laat ze gedurende 2 minuten bij kamertemperatuur.
      1. Gebruik een pipet 1 ml te trekken uit 700 ul van 0,02% toluïdineblauw O oplossing. Voeg 700 ul van gedistilleerd water te spoelen de toluïdineblauw O solution. Herhaal dit 3-4x of tot het waswater oplossing helder is. Gebruik een pipet 1 ml met de pipetpunt gesneden zodanig dat de delen gemakkelijk kunnen worden gepipetteerd zonder ze te beschadigen.
      2. Voorzichtig pipet secties in de punt en op een objectglaasje en dek ze af met een dekglaasje. Let op de secties onder bright-field verlichting.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

Stem Embedding en Snijden:
Het gebruik van de zelfgemaakte plastic mal insluiten stelen in 7% agarose bleek gemakkelijk (figuur 1). De twee delen (A en B; figuur 1) van de embedded flacon systeem maken het eenvoudig om gemakkelijk de steel ingebed in agarose als de agarose plakt niet aan de flacon onderdelen die inert zijn los, waardoor het systeem schoon. De flesjes kan meerdere keren worden hergebruikt jaar. Het gemak van het opslaan van de ingebedde stam maakt de volgende stappen gemakkelijker. Om ergens op te slaan, vergelijkbaar ingebed stengels kunnen worden gegroepeerd (maximaal 3) op een enkele snijden plaat voor het snijden.

Observatie van aromatische koolwaterstoffen volgens UV:
De stengeldelen zijn doorgezonden aan de glasplaatjes in gedestilleerd water geplaatst en geobserveerd onder UV-licht. De aromatische verbindingen, zoals de lignine in de cellen, kan worden gevisualiseerd door de autofluorescentie onder UV licht. Xyleem (XY) en interfascicular vezels (Fi)toonde autofluorescentie onder UV-belichting maar niet in merg (Pi) en cortex of epidermis (Ep) (figuur 2), omdat lignine, een aromatische polymeer wordt afgezet tijdens secundaire celwand biosynthese. In sommige gevallen, wanneer planten accumuleren significante hoeveelheden aromaten in de vacuolen (bijv. anthocyaan), fluorescentie vertoond in corticale cellen (gegevens niet getoond). Stem doorsneden werden geanalyseerd in 5X, 10X, 20X en 40X vergroting (figuur 2 Panelen A, B, C en D - E, respectievelijk) beter te visualiseren celwand aromatische verdeling over de steel.

Observatie van Lignine in de stengeldelen gekleurd met Floroglucinol en Maule Vlekken:
Het xyleem bestaat uit schepen en vezels en interfascicular vezels waren de enige elementen van de stam die werden gekleurd door de lignine vlekken (phloroglucinol en Maule) Met een wild-type stam sectie monster. Floroglucinol vlek reageert met cinnamaldehyde eindgroepen van lignine een roze of fuchsia kleur 4 (figuur 3) te geven. Zoals waargenomen onder UV-belichting, wordt een fuchsia kleuring waargenomen in xyleem en interfascicular vezels, maar afwezig is in merg en cortex of epidermis (figuur 3). Stem doorsneden werden geanalyseerd in 5X, 10X, 20X en 40X vergroting (figuur 3 Panelen A, B, C en D - E, respectievelijk) beter visualiseren floroglucinol vlek verdeling over de steel en differentiëren grote weefsels; xyleem en interfascicular vezels; merg en cortex; en epidermis. Meestal de intensiteit van de kleur correleert met het niveau van lignification op een kwalitatieve manier - behalve wanneer de geanalyseerde transgene mutant of abnormaal is verrijkt in kaneelaldehyde afgeleide eenheden (bijv. cad mutant) <sup> 14. De Maule vlek is specifiek in het opsporen van de syringyl lignine eenheden in xyleem en interfascicular vezels. Rode kleur geeft de aanwezigheid van lignine syringyl eenheden in de lignine elementen (figuur 4) 18. Echter helderder rood kleuring waargenomen in de vezels ten opzichte van het xyleem weefsels die suggereert dat de vezels bevatten een hoger S lignine dat het xyleem is verrijkt in G eenheden. Zoals waargenomen na phloroglucinol kleuring wordt een rode kleuring waargenomen in xyleem en interfascicular vezels, maar afwezig is in merg en cortex of epidermis (figuur 4). Dit correleert ook met de lignine verdeling bekeken onder UV (figuur 2) en laat zien dat syringyl eenheden aanwezig in elke verhout weefsel van deze stam monster. Stem doorsneden werden geanalyseerd in 5X, 10X, 20X en 40X vergroting (figuur 2 Panelen A, B, C, enD - E, respectievelijk) om beter te visualiseren Maule vlek verdeling over de stam en differentiëren van de belangrijkste weefsels: xyleem en interfascicular vezels, merg en cortex, en de opperhuid. Het is belangrijk op te merken dat de hoeveelheid en de verdeling van syringyl eenheden tussen verhoute weefsels variëren met de leeftijd van de steel en kan afwezig zijn in een jonge steel (gegevens niet getoond).

Observatie van stengeldelen gekleurd met Calcofluor Wit en Congo Rode Vlekken:
Calcofluor witte vlekken cellulose, callose, en andere nonsubstituted of zwak vervangen β-glucanen; terwijl congo rode vlekken direct naar β-(1 → 4)-glucanen en in het bijzonder aan cellulose. Stengeldelen gekleurd met calcofluor wit werden waargenomen onder UV-licht 6-9. Congo rood-gekleurde coupes werden waargenomen onder blauw licht excitatie met behulp van een filter met een bandpass van 560/40. Zowel Calcofluor wit en Congo rood gekleurd de epidermis, cortex en merg; this is omdat al deze weefsels bevatten cellulose als belangrijkste polysaccharide polymeer in hun celwanden (Figuur 5 en Figuur 6, respectievelijk). In tegenstelling tot wit, congo rood gekleurde polysachariden beter Calcofluor in het xyleem en interfascicular vezels en lijkt minder beïnvloed door de aanwezigheid van lignine (Figuur 5 en Figuur 6) 10,11. Stem doorsneden werden geanalyseerd in 5X, 10X, 20X en 40X vergroting (panelen A, B, C en DE, respectievelijk figuren 5 en 6) beter visualiseren calcofluor witte en Congo rood kleuring verdelingen over de steel en de grote weefsels (xyleem en interfascicular vezels, merg en cortex, en epidermis).

Observatie van stengeldelen gekleurd met toluïdineblauw O:
Toluïdineblauw O geclassificeerd als een polychromatische kleurstof omdat het reageert met verschillende chemische componenten van cellen anders en resultateneen veelkleurig monster (Figuur 7). De geproduceerde kleuren kunnen gegevens over de aard van de cel en de wanden voorzien. Toluïdineblauw O is een kationische kleurstof die bindt aan negatief geladen groepen 5. Een waterige oplossing van deze kleurstof is blauw, maar verschillende kleur worden gegenereerd wanneer de kleurstof bindt met verschillende anionogene groepen in de cel 6,9. Zo zal een rozeachtige paarse kleuren als de kleurstof reageert met gecarboxyleerde polysachariden zoals pectinezuur; groen, groenachtig blauw of helder blauw met poly-aromatische stoffen zoals lignine en tannines; en paarsachtig of groenachtig blauw met nucleïnezuren. Toluïdineblauw O van stam doorsneden bleek dat xyleem en interfascicular vezels worden verhoute omdat ze tonen een groenachtig blauwe of blauwe kleuring (Figuur 7, Paneel C), wat in overeenstemming is met de UV-en Ph-HCl kleuring waarnemingen (figuur 2 en 3). In tegenstelling, het merg en cortex en epidermis weefsels tonen groenachtig blauw of blauwe kleuring, want hoewel ze niet verhoute, wat pectine polymeren in hun celwanden bevatten ze. Stem doorsneden werden geanalyseerd in 5X, 10X, 20X en 40X vergroting (figuur 7 Panels A, B, C en D - E, respectievelijk) beter visualiseren toluïdineblauw O vlek verdeling over de steel en de belangrijkste weefsels differentiëren .

Figuur 1
. Figuur 1 Homemade mal voor het inbedden van de stengels aan de linkerkant.; bovenkant 2 ml schroefdop microcentrifugebuis (Deel A) en de onderzijde van de 0,6 ml microcentrifugebuis (deel B). Aan de rechterkant; de Parafilm die de twee delen; A en B om de uiteindelijke vorm te vormen.

ntent "fo: keep-together.within-page =" altijd "> Figuur 2
Figuur 2. UV fluorescentie A. thaliana stam doorsneden. Dwarsdoorsneden van een wild-type A. thaliana stengel onder UV-licht fluorescentie die de aanwezigheid van aromatische verbindingen, zoals lignine, alleen in de muren van interfascicular vezels en xyleem cellen (A - E). De posities van de epidermis en de cortex (Ep), interfascicular vezels (Fi), merg (Pi), en xyleem (Xy) zijn aangegeven. Vergrotingen: Paneel A: 5X; Panel B: 10X; Paneel C: 20X; Panelen D en E: 40X. Bar = 100 urn.

Figuur 3
Figuur 3. Floroglucinol-HCl kleuring van A. thaliana stam doorsneden. Floroglucinol-HCl kleuring (roze of fuchsia kleur) van een wild type A. thaliana sectie stam die de normale lignine afzetting op de wanden van interfascicular vezels en xyleem cellen (A - E). De posities van de epidermis en de cortex (Ep), interfascicular vezels (Fi), merg (Pi), en xyleem (Xy) zijn aangegeven. Vergrotingen: Paneel A: 5X; Panel B: 10X; Paneel C: 20X; Panelen D en E: 40X. Bar = 100 urn.

Figuur 4
Figuur 4. Maule kleuring van A. thaliana stam doorsneden. Maule kleuring (rode kleur) van een wild type A. thaliana </ Em> sectie stam waaruit de normale lignine afzetting in de muren van interfascicular vezels en xyleem cellen (A - E). De posities van de epidermis en de cortex (Ep), interfascicular vezels (Fi), merg (Pi), en xyleem (Xy) zijn aangegeven. Vergrotingen: Paneel A: 5X; Panel B: 10X; Paneel C: 20X; Panelen D en E: 40X. Bar = 100 urn.

Figuur 5
Figuur 5. Calcofluor witte kleuring van A. thaliana stam doorsneden. Calcofluor witte kleuring van een wild-type A. thaliana sectie stengel geeft cellulose afzetting in de celwanden van cellen van de epidermis, cortex, merg, interfascicular vezels en xyleem (A - E). De positions van de epidermis en de cortex (Ep), interfascicular vezels (Fi), merg (Pi), en xyleem (Xy) zijn aangegeven. Vergrotingen: Paneel A: 5X; Panel B: 10X; Paneel C: 20X; Panelen D en E: 40X. Bar = 100 urn.

Figuur 6
Figuur 6. Congo rood kleuring van A. thaliana stam doorsneden. Congo rood kleuring van een wild-type A. thaliana sectie stengel geeft cellulose afzetting in de celwanden van cellen van de epidermis, cortex, merg, interfascicular vezels en xyleem (A - E). De posities van de epidermis en de cortex (Ep), interfascicular vezels (Fi), merg (Pi), en xyleem (Xy) zijn aangegeven. Vergrotingen: Paneel A: 5X; Panel B Paneel C: 20X; Panelen D en E: 40X. Bar = 100 urn.

Figuur 7
Figuur 7. Toluïdineblauw O kleuring van A. thaliana stam doorsneden. toluïdineblauw O kleuring van een wild-type A. thaliana sectie stam die de normale lignine afzetting op de wanden van interfascicular vezels en xyleem cellen (A - E). De posities van de epidermis en de cortex (Ep), interfascicular vezels (Fi), merg (Pi), en xyleem (Xy) zijn aangegeven. Vergrotingen: Paneel A: 5X; Panel B: 10X; Paneel C: 20X; Panelen D en E: 40X. Bar = 100 urn.

Tabel 1 Tabel 1. Microscoop en de camera-instellingen voor de beeldvorming. Richtlijnen voor het werken met fluorescentie filters en bright-field imaging. Klik hier om een grotere versie van deze afbeelding te bekijken.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

A. thaliana stengeldelen worden veel gebruikt om de organisatie van de cellen in de secundaire celwand bestuderen en kwalitatief onderzoek van de verschillen tussen wildtype en transgene planten. De meest gebruikte technieken voor het snijden van de exemplaren zijn directe snijdend; of wanneer monsters zijn ingebed in agarose of fixeermiddel kan snijden worden gedaan met een vibratome of microtoom. In tegenstelling tot de hand snijden, de laatste twee mogelijk maken waardoor de kans op het produceren onnauwkeurige verschillen tussen de monsters die eenvoudig worden veroorzaakt door een slechte monsterbereiding door dikteverschillen tussen de monsters en oneffen oppervlakken. Al deze methoden hebben hun voor-en nadelen. We kozen voor inbedding in agarose, gevolgd door snijden met een vibratome, en wel om de volgende redenen: Het gemak van inbedding en tijd in met agarose overbodig uitgebreide verwerking van verse weefsel. Ook onze zelfgemaakte mallen zijn eenvoudig en goedkoop te maken, kan th houdene stam rechte, kan worden gebruikt gedurende vele jaren, en kan helpen bij het gemakkelijk los van specimens zonder het maken van een puinhoop. De beste manier om een ​​hoog percentage agarose op te lossen en krijgen een homogene oplossing (volledige ontbinding van 7 g agarose in 100 ml, zonder de vorming van dikke korrels) is om het autoclaaf of te magnetron op de laagste intensiteit. Het is belangrijk de stengel gesneden verse, of als alternatief op te slaan in een plaat op ijs geplaatst met een filterpapier bevochtigd met water weefseldehydratatie en vervorming te voorkomen. Opslag van de steel voor een periode langer dan 30 minuten zonder hoge vochtigheid zal de steel te drogen. De temperatuur van de agarose vlak voor de steel is ingebed moet rond de 50 ° C. Het is cruciaal om te controleren op de aanwezigheid van luchtbellen nadat de agarose is in het flesje gegoten, omdat luchtbellen veroorzaken gaten in de matrijs en daarmee de snijbeweging ongelijkmatig zijn. Luchtbellen kunnen snel verwijderd worden door het plaatsen van de oplossing onder vacuüm voorafgaande gietenhet. De steel moet de agarose geplaatst wanneer deze nog zacht en niet warmer dan 50 ° C. De warmte zal het monster beschadigen door verschrompeling van de stam en de morfologie van de cel te vernietigen. Als de agarose te koud de stengel niet doordringen door de agarose en inbedding is niet mogelijk. Na agarose inbedding kan stengel monsters opgeslagen bij 4 ° C tot een week.

Gebruik van een vibratome in plaats van met de hand snijden opbrengsten precies gesneden specimens en een betere beeldkwaliteit. Alle veiligheidsinstructies moeten zorgvuldig worden gelezen en gevolgd tijdens het gebruik van een vibratome. Het is belangrijk om ervoor te zorgen dat het specimen schijf schoon en droog, zodat het weefsel lijm met het model sterk zijn plaats te houden, zodat het niet af te vallen tijdens het snijden. De dikte van de monsters wordt medegedeeld aan de ruwe zuur en base behandelingen tijdens kleuringen weerstaan. Het scheermesje in de vibratome moet volledig vlak zijn zodat de sectie gesneden evenly. Snijden duurt ongeveer 20 minuten per monster; om tijd te besparen, kan soortgelijke exemplaren worden gesegmenteerd in groepen op een enkel exemplaar plaat. Tijdens het snijden, worden de secties overgebracht van de buffer lade in een kleine petrischaal op de afdelingen beter te zien op een heldere achtergrond te maken en naar de buffer lade voor de volgende monster te bevrijden. Secties kunnen direct worden gebruikt voor stroomafwaartse kleuringen of opgeslagen voor later gebruik. Aliquoting de stengeldelen 2,0 ml microcentrifuge buisjes helpt bij de priming voor kleuringen. Het maken van de juiste aanpassingen en instellingen op de camera en microscoop zijn zeer kritisch voor het bereiken van hoge kwaliteit afbeeldingen. Instellen Kohler verlichting is een van de belangrijkste stappen bij het gebruik van de microscoop. De aanpassingen voor diafragma en lichtintensiteit, zoals beschreven in de paragraaf werkwijzen zijn alleen bedoeld als richtlijn. Zij moeten worden aangepast afhankelijk van de microscoop en de camera gebruikt. We gebruikten een hoge-resolutiedigitale camera met een groot formaat interline ccd-chip en geen mechanische sluiter voor UV beeldvorming, calcofluor wit, en Congo rood kleuring; en een hoge resolutie en high-speed kleurencamera voor bright-field beelden van Maule, floroglucinol en toluïdineblauw O kleuring. Beelden werden geanalyseerd, verwerkt en geassembleerd met standaard imaging software.

Floroglucinol is de meest gebruikte vlek voor lignine bepaling; Het is niet een echte lignine vlek het vlekken alleen kaneelaldehyde eindgroepen. De phloroglucinol vlek, ook wel bekend als Weisner vlek, levert een karakteristieke cherry roze of fuchsia kleur in het xyleem en interfascicular vezels waar deze aldehyde groepen aanwezig 4 zijn. De intensiteit van de roze kleur varieert met de omvang van lignification. Hoewel subtiele verschillen zijn moeilijker te observeren, is het gemakkelijk om verschillen tussen wildtype en mutante stengeldelen dat variaties in de lignine 19 zijn plek. Ook EASy verschillen tussen jongere (in de richting van de stam apex) en oudere (steel base) weefsels, observeren omdat lignification niveaus tussen dergelijke weefsels variëren. Meestal in wild-type stam, epidermis schors en merg niet cinnamaldehydes bevatten (dus laat je niet gekleurd), tenzij er een buitenbaarmoederlijke lignification 20. Maule vlek, anderzijds, specifiek naar syringyl lignine eenheden kunnen worden gebruikt om verschillende lignine verrijkingen in S of G apparaten (bv. vezels versus xyleem weefsel) 14,18 differentiëren. De kaliumpermanganaat en zoutzuur handelen op de syringyl kern van de S-eenheid in de lignine een methoxycatechol te vormen en vervolgens naar methoxy-o-chinon volgende reactie met ammonium hydroxide. De Maule vlek is een goede indicator voor het differentiëren van mutanten die ontbreken of worden op grote schaal waaruit S eenheden van lignine (bijvoorbeeld in A. thaliana f5h mutanten en algemene gymnosperm planten), Maule geeft geel-bruine kleur instead rood in zowel het xyleem en de sclerenchym 21. Om dezelfde reden kan maule kleuring worden gebruikt angiospermen onderscheiden, die voornamelijk bevatten S lignine uit naaktzadige planten die typisch niet de S 18. Omdat sterk zuur en base worden gebruikt tijdens phloroglucinol en Maule kleuringen respectievelijk, moeten een aantal experimentele stappen die moeten worden uitgevoerd met de nodige voorzichtigheid. Zowel geconcentreerd HCl en ammonia zijn sterk bijtende stoffen; kunnen ze de microscoop podium en de lens verslechteren als de dia's die de Ph-HCl en Maule gekleurd monsters niet goed worden behandeld. Ze kunnen ook opdrogen snel, binnen 5-10 minuten, waardoor exemplaren te verslechteren, zodat de beeldvorming moet snel worden gedaan. Toluïdineblauw O is een polychromatische vlek en vlekken verschillende componenten van de celwand in verschillende kleuren als het reageert met andere chemische bestanddelen van celwanden verschillend, waardoor een gekleurde monster. De gegenereerde kleuren kunnen provide informatie over de aard van de cel. Toluïdineblauw O is ook een kationische kleurstof die bindt aan negatief geladen groepen 5,6. Een waterige oplossing van deze kleurstof is blauw, maar verschillende kleur worden gegenereerd wanneer de kleurstof bindt met verschillende anionogene groepen in de cel. Bijvoorbeeld, de kleuren een roze paars wanneer de kleurstof reageert met gecarboxyleerde polysachariden zoals pectine; groen, groenachtig blauw of helder blauw met aromatische stoffen zoals lignine en tannines; en paarsachtig of groenachtig blauw met nucleïnezuren. De kleuring is gemakkelijk en kan duren voor twee dagen.

Calcofluor witte vlekken cellulose, callose, en andere nonsubstituted of zwak vervangen β-glucanen 6-9, en congo rode vlekken direct naar β-(1 → 4)-glucanen en vooral cellulose 8,10,11. Calcofluor witte vlekken briljant de epidermis, schors en merg maar dat schittering aanzienlijk in xyleem en interfascicular vezels verminderd. Er zijn twee pOGELIJKE verklaringen voor de verminderde fluorescentie van calcofluor wit in zwaar verhoute weefsels; een attributen de aanwezigheid van lignine, wat weer zou verminderen het vermogen van calcofluor witte goed diffunderen door de polysacchariden. Een tweede verklaring wijst op een gedeeltelijke uitdoving van de fluorescentie uitgezonden door de calcofluor witte opgewonden onder UV. In tegenstelling tot calcofluor witte, Congo rood kleuring lijkt minder beïnvloed door de aanwezigheid van lignine. Het kan worden gerelateerd aan het verschil in fluorescentie-eigenschappen tussen calcofluor witte en Congo rood; een betere verspreiding vermogen van Congo rood door de verhoute weefsels dan calcofluor wit; of een klein verschil in polysaccharide bindende eigenschappen 22. Het is belangrijk op te merken dat de secties gekleurd met Congo rood niet te lang voor de beeldvorming moet worden opgeslagen, omdat Congorood de neiging om weg te wassen in water.

Hoewel histochemische kleuring noch kwantitatiefnoch volstrekt overtuigend zijn, kan het openbaren door visuele aanwijzingen een schat aan informatie over belangrijke eigenschappen zoals de integriteit van de weefsels of abnormale celwand depositie en lignification. De kleuring hierboven beschreven technieken zijn gemakkelijk uit te voeren en zijn dan voor kritische elementen in een plantencel wand, zoals lignine en cellulose. Daarentegen wordt immunofluorescentie met specifieke antisera en monoklonale antilichamen die voor detectie van diverse onderdelen van hemicellulose en pectine. Dit rapport is bedoeld om te dienen als een primer voor beginners op het gebied van secundaire celwand kleuring die A. gebruiken thaliana als modelsysteem.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Acknowledgments

Wij zijn dankbaar voor Sabin Russell te bewerken hulp. Dit werk maakte deel uit van de DOE Joint BioEnergy Institute (http://www.jbei.org) ondersteund door het Amerikaanse ministerie van Energie, Office of Science, Bureau van biologische en milieu-onderzoek, door middel van contractonderzoek DE-AC02-05CH11231 tussen Lawrence Berkeley National Laboratory en het Amerikaanse ministerie van Energie.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Agarose EMD MERC2125 CAS Number: 9012-36-6
Phloroglucinol Sigma P 3502 1,3,5-trihydroxybenzene [CAS Number: 108-73-6]
Hydrochloric acid EMD HX0603-75 CAS Number: 7647-01-0
Ammonium hydroxide EMD AX1303-6 CAS Number: 1336-21-6
Toulidine Blue O Sigma T3260 Blutene chloride, Tolonium Chloride [CAS Number 92-31-9] 
Potassium permanganate Sigma 223468 CAS Number 7722-64-7 
Ethanol 190 proof KOPTEC V1401 CAS Number: 64-17-5
Congo Red Sigma  C6277 Disodium 3,3'-[[1,1'-biphenyl]-4,4'-diylbis(azo)]bis(4-aminonaphthalene 1-sulphonate) [CAS Number 573-58-0]
Fluorescent Brightener 28/ Calcofluor White Stain Sigma F3543  4,4'-Bis[[4-[bis(2-hydroxyethyl)amino]-6-anilino-1,3,5-triazin-2-yl]amino]stilbene-2,2'-disulphonic acid [CAS Number 4404-43-7] 
Vibratome Leica Leica Vibrating blade microtome VT1000S http://www.leicabiosystems.com/products/sectioning/vibrating-blade-microtomes/details/product/leica-vt1000-s/
Razor American Safety razor company Item # 60-0139-0000  Stainless Steel Double Edge Blade (Personna Super)
Screw Cap Microcentrifuge Tubes (2 ml) VWR 16466-044
Microcentrifuge Tubes (0.6 ml) Axygen Scientific MCT-060-C
Mitt Bel-Art 380000000 SCIENCEWARE  Hot Hand Protector Mitt
Tissue adhesive Ted Pella Inc 10033 Store at 4 °C or 20 °C for 3 months or longer storage
Microwave Panasonic NN-SD762S PELCO Pro CA 44 Instant tissue adhesive 
Camera with CCD chip with no mechanical shutter  Hamamatsu C4742-95
High speed color camera    QImaging MicroPublisher 5.0 RTV
Camera software   Molecular Devices MetaMorph version 7.7.0.0
Imagining anaylsis  Adobe  Photoshop CS4
Micro Cover Glasses, Square, No. 1 VWR 48366-067 22 x 22 mm (7/8 x 7/8")-Cover glasses are corrosion-resistant and uniformly thick and flat. No. 1 thickness is 0.13 to 0.17 mm.
Frosted Micro Slides, 1 mm VWR 48312-003 75 x 25 mm - 1 mm
Parafilm M Alcan packaging BRNDPM998
TX2 Filter cube Leica 11513851/11513885 Filter used for Congo red analysis with a band-pass of 560/40.

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Boerjan, W., Ralph, J., Baucher, M. Lignin biosynthesis. Annual review of plant biology. 54, 519-546 (2003).
  2. Vanholme, R., Demedts, B., Morreel, K., Ralph, J., Boerjan, W. Lignin biosynthesis and structure. Plant physiology. 153, 895-905 (2010).
  3. Humphreys, J. M., Chapple, C. Rewriting the lignin roadmap. Current opinion in plant biology. 5, 224-229 (2002).
  4. Adler, E. Lignin chemistry—past, present and future. Wood Sci. Technol. 11, 169-218 (1977).
  5. Brien, T. P., Feder, N., McCully, M. E. Polychromatic Staining of Plant Cell Walls by Toluidine Blue. 59, 368-373 (1964).
  6. Mori, B., Bellani, L. M. Differential staining for cellulosic and modified plant cell walls. Biotechnic & histochemistry: official publication of the Biological Stain Commission. 71, 71-72 (1996).
  7. Maeda, H., Ishida, N. Specificity of binding of hexopyranosyl polysaccharides with fluorescent brightener. Journal of biochemistry. 62, 276-278 (1967).
  8. Wood, P. J. Specificity in the interaction of direct dyes with polysaccharides. Carbohydrate Research. 85, 271-287 (1980).
  9. Hughes, J., McCully, M. E. The use of an optical brightener in the study of plant structure. Stain technology. 50, 319-329 (1975).
  10. Verbelen, J. P., Kerstens, S. Polarization confocal microscopy and congo red fluorescence: a simple and rapid method to determine the mean cellulose fibril orientation in plants. Journal of microscopy. 198, 101-107 (2000).
  11. Anderson, C. T., Carroll, A., Akhmetova, L., Somerville, C. Real-time imaging of cellulose reorientation during cell wall expansion in Arabidopsis roots. Plant physiology. 152, 787-796 (2010).
  12. Liljegren, S. Phloroglucinol Stain for Lignin. Cold Spring Harbor Protocols. , (2010).
  13. Nakano, J., Meshitsuka, G., lin, S., Dence, C. The Detection of Lignin Methods in Lignin Chemistry. , Springer-Verlag. Berlin. (1992).
  14. Sibout, R., et al. CINNAMYL ALCOHOL DEHYDROGENASE-C and -D are the primary genes involved in lignin biosynthesis in the floral stem of Arabidopsis. The Plant cell. 17, 2059-2076 (2005).
  15. Teather, R. M., Wood, P. J. Use of Congo red-polysaccharide interactions in enumeration and characterization of cellulolytic bacteria from the bovine rumen. Applied and environmental microbiology. 43, 777-780 (1982).
  16. Yeung, E. A beginner's guide to the study of plant structure. Proceedings of the 19th Workshop/Conference of the Association for Biology Laboratory Education (ABLE. 19, 365-36 (1998).
  17. Turner, S. R., Somerville, C. R. Collapsed xylem phenotype of Arabidopsis identifies mutants deficient in cellulose deposition in the secondary cell wall). The Plant Cell Online. 9, 689-701 (1997).
  18. Iiyama, K., Pant, R. The mechanism of the Mäule colour reaction. Introduction of methylated syringyl nuclei into softwood lignin. Wood Sci. Technol. 22, 167-175 (1988).
  19. Yang, F., et al. Engineering secondary cell wall deposition in plants. Plant biotechnology journal. 11, 325-335 (2013).
  20. Zhong, R., Ripperger, A., Ye, Z. H. Ectopic deposition of lignin in the pith of stems of two Arabidopsis mutants. Plant physiology. 123, 59-70 (2000).
  21. Chapple, C. C., Vogt, T., Ellis, B. E., Somerville, C. R. An Arabidopsis mutant defective in the general phenylpropanoid pathway. The Plant cell. 4, 1413-1424 (1992).
  22. Fagard, M., et al. PROCUSTE1 Encodes a Cellulose Synthase Required for Normal Cell Elongation Specifically in Roots and Dark-Grown Hypocotyls of Arabidopsis. The Plant Cell Online. 12, 2409-2423 (2000).

Tags

Cellular Biology Xylem Vezels Lignine polysacchariden Plant celwand Maule kleuring Floroglucinol Congo rood toluïdineblauw O Calcofluor wit Celwand kleuringen
Histochemische kleuring van<em&gt; Arabidopsis thaliana</em&gt; Secundaire celwand Elements
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Pradhan Mitra, P., Loqué, D.… More

Pradhan Mitra, P., Loqué, D. Histochemical Staining of Arabidopsis thaliana Secondary Cell Wall Elements. J. Vis. Exp. (87), e51381, doi:10.3791/51381 (2014).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter