Introduction
Plantecellevæggen rummer et væld af oplysninger i sine forskellige komponenter: lignin, cellulose, hemicellulose (xylan, glucuronoxylan, xyloglucan, arabinoxylan, blandet kobling glucan eller glucomannan), og pektin. Histologiske teknikker giver vigtige visuelle referencer i at studere forskellene inden for de sekundære cellevægge på organisatoriske og cellulære niveauer. Forskellige histologiske teknikker blev udviklet og kan findes i litteraturen, men disse teknikker kan være udfordrende og tidskrævende for begyndere, da meget detaljerede protokoller med simple visuelle instruktioner er sjældent om nogensinde tilgængelige. Målet med denne undersøgelse er at give enkle retningslinjer for histologiske farvningsteknikker at opnå billeder af høj kvalitet.
Sektionering stilken væv er det første skridt i visualisering af cellevægge og celle figurer. Selvom hånd-cut sektioner er billig og tage mindre tid til at forberede, brug af en vibratome giver konsistens oggiver billeder i høj kvalitet. Ved hjælp af en vibratome tillader at producere en bedre datakvalitet ved at generere endda sektioner med samme tykkelse, som hjælper med at producere skarpe billeder og reducerer risikoen for at producere unøjagtige forskelle mellem prøver, der ville simpelthen forårsaget af en dårlig prøveforberedelse. Brug harpiks til at fastsætte friske prøver kan være en udfordring for begyndere og kan stadig være tidskrævende selv for eksperter, når en analyse skal gøres hurtigt. Desuden bliver det muligt at måle enhver biologisk aktivitet med prøven, når den er indlejret i en harpiks. En simpel teknik, der anvender agarose og en hjemmelavet formen er nyttig for indlejring stamceller væv, og det kan også anvendes i andre applikationer, der kræver dissektion af det bløde væv. Sammenlignet med indlejring prøver i harpiks, har denne fremgangsmåde den fordel, at holde væv i live og reducere prøve manipulation. Sektionering væv via en vibratome er meget præcis og genererer homogenskellige sektioner, som, afhængigt af formålet med undersøgelsen, så kan anvendes med flere forskellige farvningsteknikker.
De enkleste metoder til at visualisere lignin og andre aromater ansætte ultraviolet (UV) lys. Excitation af aromatiske molekyler med UV-lys er en gammel teknik, men det er stadig en af de hurtigste metoder til visualisering af lignin. Men UV visualisering faktisk ikke er ideel til lignin detektion, fordi UV-lys vil excitere andre aromater. Lignin består primært af tre byggesten, de monolignols (hydroxycinnamyl alkoholer: coniferyl alkohol, sinapyl alkohol, og p-coumaryl alkohol) 1-3. Phloroglucinol plet kan give et fingerpeg om omfanget af cinnamaldehydes stede i veddet, fibre og luftrør væv 4.. Phloroglucinol er en god indikator for generelle cinnamaldehydes og kan skelne mellem cinnamaldehydes og andre aromater. De sinapyl alkohol monomerer kan påvisesog differentieres ved anvendelse af Maule pletten. Toluidinblåt O er en polykromatisk farvestof og har derfor evnen til at farve forskellige elementer i cellevæggen i forskellige farver 5,6. Den primære anvendelse af toluidinblåt O er at detektere pektin og lignin 5,6. Fordelen ved anvendelse af toluidinblåt O er, at mange elementer af cellevæggen kan visualiseres i et enkelt trin. Både Calcofluor hvid og congorødt er let at arbejde med og kan anvendes til at visualisere cellulose. Calcofluor hvide pletter cellulose, callose, og andre ikke-substituerede eller svagt substituerede β-glucaner 6-9, mens congorødt pletter direkte til β-(1 → 4)-glucaner og især cellulose 10,11. Målet med denne undersøgelse er at give enkle retningslinjer for brugen af de førnævnte farvningsteknikker at opnå billeder af høj kvalitet fra A. thaliana stængler.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1.. Stem Embedding
- Lav en 7% agaroseopløsning i vand (7 g elektroforese-agarose i 100 ml destilleret vand). Opløses agarosen ved autoklavering i 20 minutter eller ved mikrobølgeovn i 20 minutter ved laveste intensitet (f.eks 10% intensiteten af en 1.250 watt mikrobølgeovn).
- Forbered en hjemmelavet støbeform for indlejring stænglerne ved hjælp af plast hætteglas.
- Ved hjælp af et barberblad, afbrød den koniske bund af en 2 ml skruelåg mikrocentrifugerør (del A). Med en kanyle, punktere et hul i hætten er lidt større end diameteren af stammen, der skal indlejres. Dernæst skæres 0,5 cm væk fra bunden af et 0,6 ml mikrocentrifugerør (del B).
- Tilsæt cut-off 0,5 cm del af 0,6 ml mikrocentrifugerør i forskåret 2 ml mikrocentrifugerør. Forsegle de to dele ved hjælp af Parafilm (figur 1). BEMÆRK: Bunden af røret er skåret til at lette fjernelsen af den integrerede prøve efter agarosen er størknet. Than hul i hatten vil hjælpe med at holde stammen stabilt når stilken er indlejret i agarose. Formen vil tjene til at holde agarose og holde stammen lige når indlejring. Den Parafilm vil holde de to dele, A og B, indtil agarosen er indstillet, og stammen er indlejret.
- Ved hjælp af et barberblad, skære et stængelstykke fra området af interesse (f.eks midten af den første stamme mellemled). BEMÆRK: Ideelt set bør stilken skæres lige før indlejring for at undgå ødelæggelse af dehydrering. Alternativt kan stammen lagres midlertidigt i en plade, der indeholder et filtrerpapir befugtet med vand. Denne plade kan placeres på is indtil klar til at blive indlejret for at forhindre væv dehydrering og deformation. Lagring af stilken i perioder længere end 30 min uden høj fugtighed vil forårsage stammen at tørre ud.
- Smelt agarose i mikrobølgeovn ved lav intensitet. ADVARSEL: Den flaske indeholdende agarose kan være varme. Brug en mitt at afhente flasken. Lad de smeltede agarose stand ved stuetemperatur (mellem 20 ° C og 25 ° C), indtil den er afkølet til omkring 50 ° C.
- Langsomt afpipetteres 5 ml agarose i premade plast støber at fylde hætteglasset. BEMÆRK: Sørg for at der ikke er luftbobler i formene. Luftbobler vil forårsage huller i agarose formen og vil ikke fuldstændigt dækker stilken stikprøven, hvilket i sidste ende vil føre til ujævn overskæring af prøven sektioner.
- Lad agarose afkøle i 30 til 60 sek for at blive halvfast stof. Test med en lille tandstikker, og sørg for, at det kan trænge ind og stå op, men ikke flyde i agarose. BEMÆRK: Hvis stængel anbringes, når agarose er stadig varmt, det vil skade prøven ved shriveling stilken, ødelægger cellens morfologi.
- Anbring spindlen i denne agarose-fyldte hætteglas. Sørg for, at stilken forbliver lige. Placer den perforerede hætte på en sådan måde, at spidsen af stilken holdes af hætten. Tænd ikke påskruningshætte. Engang mere end én stamme (en enkelt art) kan embedded i et enkelt hætteglas; men i dette særlige tilfælde, ikke bruge hætten. BEMÆRK: Hvis påskruningshætte drejes, vil stammen få snoet.
- Efterlad hætteglasset ved stuetemperatur eller ved 4 ° C i 10-30 minutter, indtil det størkner.
- Fjern formen ved forsigtigt at skubbe det ud af røret. Åbn Parafilm. Skub bunden af del B i formen forsigtigt med tommelfingeren for at frigive det størknede agarose fra del A på et objektglas.
- Skær agarose embedded stamceller i tre omtrent lige store stykker af 1,2 cm i længden. Klip den del af stammen, der ikke var i agarose og kassér den.
- Opbevar disse stykker af agarose med den integrerede stilke i lufttæt 2 ml mikrocentrifugerør i en mørk boks ved 4 ° C indtil den er klar til afsnit. Alternativt opbevare rørene ved 4 ° C i højst en uge. BEMÆRK: Storage er muligt, men forsøgslederen skal være opmærksom på, at den integrerede stængler er stadig i live, og afhængigt af eksperimentetPotentielt kan indføres artefakter.
2.. Stem Sektionsinddeling
- ADVARSEL: Læs vibratome manual omhyggeligt og følg alle sikkerhedsanvisninger.
- Sørg for, at prøven disken er ren og helt tør (fri for fast eller flydende). Rengør objektpladen med et barberblad for at fjerne enhver resterende lim fra tidligere eksperimenter og vaskes med vand. Så tør med en køkkenrulle. BEMÆRK: Dette vil sikre, at klæbemidlet virker godt og binder til agarose prøven. Hvis dette trin ikke er gjort ordentligt, er det muligt, at prøven ikke kan klæbe til disken og vil senere få prøven til at falde ned fra disken ved skæring.
- Brug blødt papir servietter for at fjerne eventuel fugt fra agarose blok, der indeholder prøver.
- Placer en lille dråbe vævsklæbemiddel på prøven disken. Træk ud klæbemidlet til at dække området i midten af pladen med spidsen af den klæbende flaske. Hurtigt stedagarose blokken, at enhederne enten vinkelret på eller parallelt med pladen for tværgående eller langsgående tværsnit, hhv. Lad limen fastsætte prøven til objektpladen ved stuetemperatur eller ved 4 ° C i 10-30 min. BEMÆRK: Dette er en tidsfølsomme skridt.
- Fastgør objektpladen på plads på buffer bakken eller trug. Blok / s agarose med sektionerne skal være parallelt med barberblad. Fyld buffer bakken med destilleret vand ved stuetemperatur, indtil prøverne er helt neddykket.
- Skær et barberblad i halve og derefter trim enderne med en robust saks, så bladet bliver helt fladt. Sæt den ene halvdel af precut barberblad på knivholder.
- Indstil vinklen på knivholder til 84 °, hastigheden til 0,90 mm / sek (position 8 på vibratome) og frekvens til 50 Hz (position 5 på vibratome). Snit på 100 um tykkelse. Brug kontinuerlig tilstand. NOTE: Denne tykkelse blev valgt for at sikre, at vævet kan modstå de forskellige syre-og base, der benyttes i nogle af de farvningsprotokoller. Indstil vinduet til sektionering og tillade 15-20 min på en kontinuerlig tilstand for vibratome til afsnittet en agarose blok på ca 1,2 cm.
- Saml de dele med en plastikflaske pipette ved skæring i bufferen bakken. Alternativt kan sektionerne overføres fra bufferen bakken i et bægerglas, og derefter til en klar petriskål. Overfør nogle afsnit til de 2,0 ml mikrocentrifugerør. Bemærk: Prøverne er indsamlet fra en petriskål, fordi det er lettere at se afsnittene om en klar baggrund, og fordi buffer bakke kan klargøres til næste prøve.
- Sektionerne kan lagres i et 50 ml rør eller opsamlet og opbevaret i 1,5 til 2 ml mikrocentrifugerør ved 4 ° C i 30 til 60 min. BEMÆRK: Lagring afsnittene i længere perioder, vil resultere i dårlig billedkvalitet.
3.. Mikroskop og kameraets indstillinger til Imaging
- Juster Köhler belysning på mikroskopet. Vælg et mål. Fokus på prøven først. Bring lysintensiteten til halvdelen eller lavere. Luk feltblændet (FD) og blænde (AP) eller bringe det til den lavest mulige indstilling på det pågældende mål.
- Jo højere forstørrelse, jo større ringen vil være. Brug kondensatoren fokuseringsknap at fokusere feltet iris så skarpt som muligt.
- Langsomt bringe billedet af feltet iris (sekskant-formet lille ring) til centret ved hjælp af kondensator-centrering knopper (stiftformede skruer omgiver kondensatoren). Langsomt øge membranen (FD), således at feltet iris når kanten. Stop øge FD lige efter feltet iris har passeret kanten.
- Langsomt øge blænden (AP) til at justere kontrasten. Juster lysintensiteten som krævet. BEMÆRK: Köhler belysning skal justeres for hver oÅL hver forsøgsdag. Bemærk tallene er opnået efter justering for dagen. Disse tal vil blive genbrugt hver gang at målene skiftes frem og tilbage for den pågældende dag.
- Justere blænden, intensitet, eksponeringstid, gain, og filtre som beskrevet i tabel 1. Skal disse oplysninger kun bruges som en vejledning.
- Brug en høj opløsning digitalt kamera med et stort format interline CCD-chip med nogen mekanisk lukker til at fange fluorescens billeder; og en høj opløsning, high-speed kamera til lyse-field billeder.
- PROCES dias ved hjælp af standard software. Indlæse softwaren. Klik på "Acquire" og "Set kamera / bord," og derefter vælge at kameraet skal bruges. Klik på "OK". Klik på "Acquire" efterfulgt af "fanen Farve." Under "fanen Farve", vælg "Bayer-metoden" efterfulgt af "Average fire." Add den foreslåede gevinst (rød, grøn, blå) from Tabel 1.. Vælg fanebladet "Set gem" og klik på den mappe, hvor billederne skal gemmes. Indstil "Exposure" fra forslagene i tabel 1. Sæt "Binning" ved "1" og "Levende Binning" på "1". Fokus på området af interesse, og klik derefter på "Gem leve."
- Output billeder på kameraet software er i "TIF" format. Analyser billeder til histokemi af celletyper. Brug standard computersoftware for downstream-anvendelser af præsentation og offentliggørelse.
4.. Ultraviolet og Bright-field Imaging
- Brug en 1 ml pipette med pipettespidsen skåret så at sektionerne kan pipetteres ud nemt. Forsigtigt pipette sektioner i spidsen og videre til et objektglas. Dæk sektioner med et dækglas. Bemærk de afsnit i UV-lys eller lyse-field belysning.
5.. Phloroglucinol-HCI (Wiesner) Farvning 12
- 0,3 g phloroglucinol opløses i 10 ml absolut ethanol for at forberede en 3% phloroglucinol løsning. Rumfang koncentreret HCI (37 N) til to volumener 3% phloroglucinol i ethanol; denne løsning er phloroglucinol-HCI (Ph-HCI) eller Wiesner pletten. BEMÆRK: Denne løsning er at blive frisk på dagen for farvning og ikke kan lagres, fordi løsningen vil nedbrydes over tid og farvningen bliver ineffektiv. ADVARSEL: HCI er stærkt ætsende, så brug ekstrem forsigtighed under håndtering af Ph-HCI pletten.
- Overførsel stamceller sektioner til et 2,0 ml mikrocentrifugerør. Der tilsættes 1 ml af Ph-HCI-opløsning til røret indeholdende sektionerne og cap det samme, fordi HCI i Ph-HCI pletten er stærkt ætsende. Bevæg røret for at sikre, at alle sektioner er plettet. Et alternativ til dette trin er at holde hætten åben, således at Ph-HCI-opløsning kan pipetteret op og ned, fortrinsvis uden at forstyrre sektioner. BEMÆRK: Vær forsigtig med ikke at pipettere afsnittene i pipettespidsen, da dette kan beskadige disse sektioner.
- Brug en 1 ml pipette med pipettespidsen skåret på en sådan måde, at sektionerne kan pipetteret ud nemt uden skader. Forsigtigt pipette sektioner i spidsen og på et objektglas. Dæk sektioner med dækglas. Bemærk de afsnit under lys-felt belysning. BEMÆRK: Ph-HCl-opløsning tørrer op i 5-10 min, hvilket medfører en forringelse af prøver. Derfor billedbehandling har, som skal udfyldes inden for denne periode.
6.. Maule Farvning 13,14
- 0,2 g kaliumpermanganat opløses i 40 ml destilleret vand til fremstilling af en 0,5% opløsning af kaliumpermanganat. Opbevares i en mørk flaske ved stuetemperatur i op til 7 dage.
- Der fremstilles en 3,7% HCI-opløsning ved tilsætning af 1 ml koncentreret HCI (37 N) til 9 ml destilleret vand (1:10). Forbered en frisk 3,7% HCI løsning pådag af eksperimentet. Sørg for, at 37 N HCI stamopløsning der bruges ikke er for gammel. Koncentreret ammoniumhydroxidopløsning (14,8 M) skal opbevares ved 4 ° C for at forhindre molariteten af mættet opløsning fra faldende.
- Overførsel stamceller sektioner til et 2,0 ml mikrocentrifugerør. Der tilsættes 1 ml af en 0,5% kaliumpermanganatopløsning til røret med sektionerne.
- Pipette 0,5% kaliumpermanganat op og ned forsigtigt, helst uden at forstyrre sektionerne. Inkuber i 2 min og gentag pipettering. Lad mikrocentrifugerør stå, indtil alle sektioner slå sig ned. BEMÆRK: Vær forsigtig med ikke at pipettere afsnittene i pipettespidsen som sektionerne kan blive beskadiget. Det kan være svært at se stængelstykker som løsningen er mørkt, så holder røret med afsnittene om reagensglas rack og give dem mulighed for at bosætte sig i 2 min.
- Ved hjælp af en 1 ml pipette, trække ud 700 pi 0,5% opløsning af kaliumpermanganat.Tilføj 700 pi destilleret vand til at skylle ud af opløsning af kaliumpermanganat. Gentag 3-4x, eller indtil den vandige opløsning forbliver klar.
- Kassér vandet. Hurtigt tilføje 1 ml af 3% HCI, indtil den dybe brune farve udledes fra sektionerne. Dette kan ske inden for 3-5 min eller kan kræve 2 vask på 5 min hver. Pipette ud hele 3% HCI-opløsning og straks gå videre til næste trin.
- Der tilsættes 1 ml koncentreret ammoniumhydroxidopløsning. Brug en 1 ml pipette med spidsen skåret på en sådan måde, at sektionerne kan pipetteret ud nemt uden skader. Forsigtigt pipette sektioner i spidsen og på et objektglas. Dæk sektioner med et dækglas. Bemærk de afsnit under lys-felt belysning. ADVARSEL: Da ammoniumhydroxid er ekstremt ætsende, det kræver ekstra pleje og opmærksomhed for at undgå at forårsage korrosion på scenen af mikroskopet eller objektivet. BEMÆRK: ammoniumhydroxidet dampe kan tåge dækglasset, hvilket gør det vanskeligt at observere prøven. Derfor være ekstra forsigtig, før du tilføjer dækglasset. Løsningen tørrer op i 5-10 min, så den billeddannende skal være afsluttet inden for denne periode.
7.. Congorødt Farvning 11,15
- 0,5 g Opløs congo rødt i 100 ml destilleret vand for at forberede en 0,5% congo rød opløsning.
- Overførsel stamceller sektioner til et 2,0 ml mikrocentrifugerør. Tilsæt 1 ml af 0,5% congorødt løsning på røret. Pipettér forsigtigt på 0,5% congo rød opløsning op og ned uden at forstyrre sektionerne. BEMÆRK: Vær forsigtig med ikke at pipettere afsnittene i pipettespidsen, da dette kan beskadige sektioner.
- Inkuber ved stuetemperatur i 10 minutter og gentage pipettering. Følg op med yderligere 3 minutters inkubation ved stuetemperatur.
- Brug en 1 ml pipette til at trække 700 pi 0,5% congo rød opløsning. Tilføj 700 pi destilleret vand til at skylle ud congo røde løsning. Gentag vask 3-4x indtil vaskeopløsningener klar.
- Brug en 1 ml pipette med spidsen skåret på en sådan måde, at sektionerne kan pipetteret ud nemt uden skader. Pipettere forsigtigt sektioner i spidsen og på et objektglas, og dække dem med dækglas. Overhold prøver på objektglasset under blå lys excitation ved hjælp af et filter med en båndpas på 560/40. BEMÆRK: Må ikke opbevares afsnittene i vand for længe, før den mikroskopiske analyse, da vandet vil vaske ud congo rødt i 10-30 min.
8.. Calcofluor White Farvning 9
- 0,02 g af fluorescerende blegemidler 28 i 10 ml destilleret vand for at forberede en 0,2% stamopløsning Opløs (Calcofluor hvid M2R). 0,2% opløsning kan lagres i seks måneder i en mørk flaske ved 4 ° C. Forbered en brugsopløsning på 0,02% ved at fortynde 0,2% stamopløsning 10x med destilleret vand.
- Overførsel stamceller sektioner til et 2,0 ml mikrocentrifugerør. Tilføj til røret 1 ml af 0,02% calcofluor hvid opløsning. Pipettér forsigtigt den 0,02% Calcofluor hvid løsning op og ned. BEMÆRK: Vær forsigtig med ikke at pipettere afsnittene i pipettespidsen, da dette kan beskadige sektioner.
- Der inkuberes ved stuetemperatur i 5 minutter og gentage pipettering. Inkubér sektion for yderligere 3 minutter ved stuetemperatur. BEMÆRK: Lad afsnittene at afvikle på bunden af røret for at gøre det lettere at pipettere løsningen ud uden at beskadige sektioner.
- Brug en 1 ml pipette til at trække 700 pi 0,02% Calcofluor hvid og der tilsættes 700 ul destilleret vand; Vent 5 minutter at skylle ud Calcofluor hvide løsning. Gentag vask 3-4x. Brug en 1 ml pipette med pipettespidsen skåret på en sådan måde, at sektionerne kan pipetteret ud nemt uden skader.
- Pipettere forsigtigt sektioner i spidsen og på et objektglas og dække dem med et dækglas. Bemærk de afsnit under UV-lys.
9.. Toluidine Blue O Farvning 16,17
- Opløs 0,02 g toluidinblåt O i 100 ml destilleret vand for at forberede en 0,02% opløsning. BEMÆRK: toluidinblåt O-opløsning kan opbevares i to uger i en mørk flaske ved stuetemperatur.
- Overførsel stamceller sektioner til et 2,0 ml mikrocentrifugerør. Tilsæt 1 ml 0,02% toluidinblåt O-opløsning til røret. Pipettér forsigtigt den 0,02% toluidinblåt O løsning op og ned. Derefter inkuberes ved stuetemperatur i 5 minutter og gentage pipettering gang. BEMÆRK: Vær forsigtig med ikke at pipettere afsnittene i pipettespidsen, da dette kan beskadige sektioner. Lad mikrocentrifugerør stå stille indtil sektionerne slå sig ned. Det kan være svært at se, da løsningen er mørkt, så holder det rør, der indeholder afsnittene om reagensglas rack og give dem mulighed for at bosætte sig i 2 minutter ved stuetemperatur.
- Brug en 1 ml pipette til at trække 700 pi 0,02% toluidinblåt O løsning. Tilføj 700 pi destilleret vand til at skylle ud toluidinblåt O solution. Gentag 3-4x eller indtil vaskeopløsningen er klar. Brug en 1 ml pipette med pipettespidsen skåret på en sådan måde, at sektionerne kan pipetteret ud nemt uden at beskadige dem.
- Pipettere forsigtigt sektioner i spidsen og på et objektglas og dække dem med et dækglas. Bemærk de afsnit under lys-felt belysning.
- Juster Köhler belysning på mikroskopet. Vælg et mål. Fokus på prøven først. Bring lysintensiteten til halvdelen eller lavere. Luk feltblændet (FD) og blænde (AP) eller bringe det til den lavest mulige indstilling på det pågældende mål.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Stem Indlejring og Sektionsinddeling:
Brugen af den hjemmelavede plast støber at integrere stænglerne i 7% agarose vist sig at være hurtig og let (figur 1). De to dele (A og B, figur 1) den integrerede hætteglas systemet gør det nemt at nemt slipper stilken indlejret i agarose som agarose ikke klæber til hætteglassets dele, som er inaktiv, holde systemet rent. Hætteglassene kan genbruges flere gange i årevis. Den bekvemmelighed for at lagre den integrerede stilken gør også de næste skridt lettere. For at spare engang, lignende indlejret stængler kan grupperes (op til 3) på en enkelt skæring plade til sektionering.
Observation af aromatiske stoffer under UV:
De stamceller snit blev monteret i destilleret vand på de objektglas og observeret under UV-lys. De aromatiske forbindelser, herunder lignin i cellerne, kan visualiseres ved deres autofluorescens under UV-lys. Xylem (XY) og interfascicular fibre (Fi)viste autofluorescens under UV-belysning, men ikke i marv (Pi), og cortex eller epidermis (Ep) (figur 2), da lignin, en aromatisk polymer, der er aflejret under sekundær celle-biosyntese. I nogle tilfælde, når planter akkumulerer signifikante mængder aromater i deres vakuoler (f.eks anthocyanin) kan observeres fluorescens i corticale celler (data ikke vist). Stem tværsnit blev analyseret under 5X, 10X, 20X og 40X forstørrelse (figur 2 felt A, B, C og D - E, henholdsvis) for bedre at visualisere cellevæg aromatisk fordeling i stilken.
Observation af Lignin i stilken snit farvet med Phloroglucinol og Maule Pletter:
Veddet består af fartøjer og fibre og interfascicular fibre var de eneste elementer af stænglen, som blev farvet med lignin pletter (phloroglucinol og Maule) Under anvendelse af en vildtype stængelstykke prøve. Phloroglucinol pletten reagerer med cinnamaldehyd endegrupper lignin til dannelse af en lyserød eller fuchsia farve 4 (figur 3). Som observeret under UV-belysning, der observeres en fuchsia farve i veddet og interfascicular fibre, men er fraværende i marv og cortex eller epidermis (Figur 3). Stem tværsnit blev analyseret under 5X, 10X, 20X og 40X forstørrelse (figur 3 felt A, B, C og D - E, henholdsvis) for bedre at visualisere phloroglucinol pletten fordeling på stilken og differentiere de vigtigste væv; xylem og interfascicular fibre; marv og cortex; og epidermis. Normalt Farveintensiteten korrelerer med niveauet af lignification på en kvalitativ måde - undtagen når den analyserede mutant eller transgen er unormalt beriget cinnamaldehyd-afledte enheder (fx cad mutant) <sup> 14. Maule pletten er specifik i at opdage de syringyl lignin enheder i veddet og interfascicular fibre. Rødfarvning indikerer tilstedeværelsen af syringyl lignin enheder i lignin-elementer (fig. 4) 18. Dog er der observeret en lysere rød farve i fibrene i forhold til veddet væv, hvilket tyder på, at fibrene indeholder et højere niveau af S lignin mens veddet er mere beriget i G-enheder. Som observeret efter phloroglucinol farvning observeres en rød farve i veddet og interfascicular fibre, men er fraværende i marv og cortex eller epidermis (Figur 4). Det korrelerer også med lignin fordeling observeret under UV (figur 2) og viser, at syringyl enheder er til stede i hvert forveddet væv ordstammen prøve. Stem tværsnit blev analyseret under 5X, 10X, 20X og 40X forstørrelse (figur 2 felt A, B, C ogD - E, henholdsvis) til bedre at visualisere Maule pletten fordeling på tværs af stilken og differentiere de store væv: veddet og interfascicular fibre, sagopalmer og cortex og epidermis. Det er vigtigt at bemærke, at mængden og fordelingen af syringyl enheder mellem forveddede væv variere med alderen af stilken og kan være fraværende i en ung stamme (data ikke vist).
Observation af stængelstykker farves med Calcofluor White og Congorødt Pletter:
Calcofluor hvide pletter cellulose, callose og andre nonsubstituted eller svagt substituerede β-glucaner; henviser congorødt pletter direkte til β-(1 → 4)-glucaner og især cellulose. Stamceller snit farvet med Calcofluor hvid blev observeret under UV-lys 6-9. Congo red-farvede sektioner blev observeret under blåt lys excitation ved hjælp af et filter med et båndpas på 560/40. Både Calcofluor hvid og Congorødt farves epidermis, cortex og marv; ther der, fordi alle disse væv indeholder cellulose som større polysaccharidpolymer i deres cellevægge (figur 5 og figur 6, henholdsvis). I modsætning til Calcofluor hvide congo rødfarvede polysaccharider bedre i veddet og interfascicular fibre og synes mindre påvirket af tilstedeværelsen af lignin (figur 5 og figur 6) 10,11. Stem tværsnit blev analyseret under 5X, 10X, 20X og 40X forstørrelse (felt A, B, C og DE, henholdsvis figur 5 og 6) bedre at visualisere Calcofluor hvide og congorød plet distributioner tværs stilken og større væv (veddet og interfascicular fibre, sagopalmer og cortex, og epidermis).
Observation af stængelstykker farvet med toluidinblåt O:
Toluidinblåt O er klassificeret som en polykromatisk farvestof, fordi det reagerer med forskellige kemiske komponenter i celler forskelligt og resultateren multi-farvede prøven (figur 7). Farverne genererede kan give oplysninger om arten af cellen og dens vægge. Toluidinblåt O er et kationisk farvestof, som binder til negativt ladede grupper 5. En vandig opløsning af dette farvestof blå, men forskellige farver frembringes, når farvestoffet bindes med forskellige anioniske grupper i cellen 6,9. For eksempel vil en rødlig lilla farve vises, når farvestoffet reagerer med carboxylerede polysaccharider, såsom pectinsyre; grøn, grønlig blå eller lyse blå med polyaromatiske stoffer som lignin og tanniner; og lilla eller grønlig blå med nukleinsyrer. Toluidinblåt O i stamceller tværsnit afslørede, at veddet og interfascicular fibre lignified da de viser en grønlig blå eller blå farve (figur 7, panel C), hvilket er i overensstemmelse med det UV-og Ph-HCI farvningsprocedurer observationer (figur 2 og 3). I modsætning hertil marven og cortex og epidermis væv viser grønlig blå eller blå farve, fordi, selv om de ikke lignified de indeholder nogle pektin polymerer i deres cellevægge. Stem tværsnit blev analyseret under 5X, 10X, 20X og 40X forstørrelse (figur 7 Panels A, B, C og D - E, henholdsvis) for bedre at visualisere toluidinblåt O plet fordeling på stilken og at differentiere de store væv .
. Figur 1. Hjemmelavet støbeform for indlejring stilke På venstre side.; toppen af 2 ml skruelåg mikrocentrifugerør (del A) og nederste fra 0,6 ml mikrocentrifugerør (del B). På højre side; Den Parafilm holder de to dele; A og B for at danne den endelige form.
Figur 2. UV Fluorescens A. thaliana stamceller tværsnit. tværsnit af en vild type A. thaliana stilk under UV-lys fluorescens viser tilstedeværelsen af aromatiske forbindelser, herunder lignin, kun i væggene i interfascicular fibre og veddet celler (A - E). Positionerne af epidermis og cortex (EP), interfascicular fibre (fi), marv (Pi) og veddet (XY) er angivet. Forstørrelser: Panel A: 5X, Panel B: 10X; Panel C: 20X; Paneler D og E: 40X. Bar = 100 um.
Fig. 3. Phloroglucinol-HCI farvning af A. thaliana stamceller tværsnit. Phloroglucinol-HCI farvning (pink eller fuchsia farve) i en vild type A. thaliana stængelstykke viser den normale lignin aflejring i væggene af interfascicular fibre og veddet celler (A - E). Positionerne af epidermis og cortex (EP), interfascicular fibre (fi), marv (Pi) og veddet (XY) er angivet. Forstørrelser: Panel A: 5X, Panel B: 10X; Panel C: 20X; Paneler D og E: 40X. Bar = 100 um.
Figur 4.. Maule farvning af A. thaliana stamceller tværsnit. Maule farvning (rød farve) i en vild type A. thaliana </ Em> stængelstykke viser den normale lignin aflejring i væggene af interfascicular fibre og veddet celler (A - E). Positionerne af epidermis og cortex (EP), interfascicular fibre (fi), marv (Pi) og veddet (XY) er angivet. Forstørrelser: Panel A: 5X, Panel B: 10X; Panel C: 20X; Paneler D og E: 40X. Bar = 100 um.
Figur 5. Calcofluor hvid farvning af A. thaliana stamceller tværsnit. Calcofluor hvid farvning af en vild type A. thaliana stængelstykke viser cellulose aflejring i cellevæggene af celler i epidermis, cortex, marv, interfascicular fibre og xylem (A - E). Den posions af epidermis og cortex (Ep), der interfascicular fibre (fi), marv (Pi) og veddet (XY) skal angives. Forstørrelser: Panel A: 5X, Panel B: 10X; Panel C: 20X; Paneler D og E: 40X. Bar = 100 um.
Figur 6. Congo rødfarvning A. thaliana stamceller tværsnit. Congo rød farvning af en vild type A. thaliana stængelstykke viser cellulose aflejring i cellevæggene af celler i epidermis, cortex, marv, interfascicular fibre og xylem (A - E). Positionerne af epidermis og cortex (EP), interfascicular fibre (fi), marv (Pi) og veddet (XY) er angivet. Forstørrelser: Panel A: 5X; Panel B Panel C: 20X; Paneler D og E: 40X. Bar = 100 um.
Figur 7. Toluidinblåt O-farvning af A. thaliana stamceller tværsnit. Toluidinblåt O-farvning af en vild type A. thaliana stængelstykke viser den normale lignin aflejring i væggene af interfascicular fibre og veddet celler (A - E). Positionerne af epidermis og cortex (EP), interfascicular fibre (fi), marv (Pi) og veddet (XY) er angivet. Forstørrelser: Panel A: 5X, Panel B: 10X; Panel C: 20X; Paneler D og E: 40X. Bar = 100 um.
Tabel 1.. Kameraindstillinger Microscope og billeddannelse. Retningslinjer for arbejde med fluorescens filtre og lys-felt billeddannelse. Klik her for at se en større version af dette tal.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
A. thaliana stamceller sektioner er almindeligt anvendt til at undersøge organiseringen af cellerne i den sekundære cellevæg og kvalitativt undersøge forskellene mellem vildtype og transgene planter. De almindeligt anvendte teknikker til skæring er prøverne direkte hånd opskæring; eller når prøver er indlejret i agarose eller fiksativ, kan sektionering gøres med en vibratome eller mikrotom. I modsætning til hånd skæring, tillader de to sidste mindske risikoen for at producere unøjagtige forskelle mellem prøver, der ville simpelthen skyldes en dårlig prøveforberedelse forårsaget af tykkelse forskelle mellem prøver og ujævne overflader. Alle disse metoder har deres fordele og ulemper. Vi valgte indlejring i agarose, efterfulgt af sektionering hjælp af en vibratome, og gjorde det af følgende grunde: Den lette indlejring og tidsforbrug i at bruge agarose eliminerer behovet for omfattende behandling af frisk væv. Også er let og billigt at gøre vores hjemmelavede forme, kan holde the dæmme lige, kan bruges i mange år, og kan hjælpe i let frigivelse af prøver uden at gøre noget rod. Den bedste måde at opløse høj procentdel agarose og få en homogen opløsning (fuld opløsning af 7 g agarose i 100 ml uden at danne chunky granulater) er at autoklaveres det eller til mikrobølgeovn det billigst intensitet. Det er vigtigt at skære stilken væv frisk, eller alternativt at opbevare det i en plade anbragt på is, der indeholder et filtrerpapir fugtet med vand for at undgå væv dehydrering og deformation. Lagring af stilken i perioder længere end 30 min uden høj fugtighed vil forårsage stammen at tørre ud. Temperatur agarose lige før stammen er indlejret bør være omkring 50 ° C. Det er afgørende at kontrollere for tilstedeværelse af luftbobler efter agarose er blevet hældt ind i hætteglasset, da luftbobler medføre huller i formen og dermed sektionering vil være ujævn. Luftbobler kan hurtigt fjernes ved at placere opløsningen under vakuum før hældedet. Stammen skal placeres i agarose når det stadig er blødt og ikke varmere end 50 ° C. Varmen vil ødelægge prøven ved forkrøble stilken og vil ødelægge cellemorfologien. Hvis agarose er for koldt stammen ikke vil trænge gennem agarose og indlejring vil ikke være muligt. Efter agarose indlejring kan stamceller prøverne opbevares ved 4 ° C i op til en uge.
Anvendelse af en vibratome stedet for hånd-sektionering udbytter præcist skåret prøver og bedre billedkvalitet. Alle sikkerhedsanvisninger bør læses omhyggeligt og følges, mens du bruger en vibratome. Det er vigtigt at sikre, at prøven disken er ren og tør at lade vævklæbemidlet at holde prøven kraftigt på plads, så den ikke falder af under skæring. Tykkelsen af prøverne er specificeret til at modstå det barske syre og base behandlinger under farvningsprocedurer. Barberblad anvendt i vibratome skal være helt fladt for at sikre, at sektionen er skåret evhimmelsk. Sektionsinddeling tager cirka 20 minutter per prøve; For at spare tid kan lignende prøverne sektioneret i grupper på en enkelt prøve plade. Under sektionering, er sektionerne overføres fra bufferen bakke i en lille petriskål at gøre afsnittene lettere at se på en klar baggrund og for at befri buffer bakke for de næste prøve. Sektioner umiddelbart kan bruges til downstream farvningsprocedurer eller gemmes til senere brug. Afmåles stilken sektioner til 2,0 ml mikrocentrifugerør hjælper i priming for farvningsprocedurer. Gør korrekte justeringer og indstillinger på kameraet og mikroskop er meget afgørende for at opnå billeder af høj kvalitet. Justering af Kohler belysning er et af de vigtigste trin i brugen af mikroskopet. Justeringer for blænde og lysintensitet, som beskrevet i metodeafsnittet, er kun beregnet som en retningslinje. Det kan være nødvendigt at blive ændret afhængigt af mikroskopet og kameraet udnyttes. Vi brugte en høj opløsningdigitalt kamera med et stort format interline CCD-chip og ingen mekanisk lukker for UV-billedbehandling, Calcofluor hvid og congo rød farvning; og en høj opløsning og høj hastighed farve kamera til lyse-field billeder af Maule, phloroglucinol og toluidinblåt O farvning. Billeder blev analyseret, behandlet og samles ved hjælp af standard imaging software.
Phloroglucinol er den mest almindeligt anvendte pletten for lignin bestemmelse; det er ikke en sand lignin plet, da det pletter kun cinnamaldehyd endegrupper. Den phloroglucinol plet, også kendt som Weisner bejdse, giver en karakteristisk cherry pink eller fuchsia farve i veddet og interfascicular fibre, hvor disse aldehydgrupper er til stede 4. Intensiteten af den rosa farve varierer med omfanget af veddannelse. Selv små forskelle er sværere at observere, er det let at få øje på forskelle mellem vildtype-og mutant stamceller sektioner, der har variationer i deres ligninindhold 19. Det er også EASy at observere forskelle mellem yngre (mod stilken spids) og ældre (stamceller base) væv, fordi lignification niveauer mellem sådanne væv varierer. Normalt i vildtype stamceller, behøver epidermis cortex og marv ikke indeholde cinnamaldehydes (således ikke få farvet), medmindre der er ektopisk lignification 20. Maule plet, på den anden side, er specifik mod syringyl lignin-enheder og kan bruges til at differentiere forskellige lignin berigelser i S eller G-enheder (fx fiber versus veddet væv) 14,18. Kaliumpermanganat og saltsyre lov om syringyl kerne af S enhed i lignin til dannelse af en methoxycatechol og derefter methoxy-o-quinon efter omsætning med ammoniumhydroxid. Maule pletten er en god indikator for differentiering mutanter, der mangler eller er flittigt udtømte i S-enheder af lignin (f.eks A. thaliana f5h mutanter og generelle gymnosperm planter), Maule giver gul-brun farve instead af rødt i både veddet og sclerenchyma 21. Af samme grund kan Maule farvning anvendes til at differentiere dækfrøede, der primært indeholder S lignin fra nøgenfrøede der typisk mangler S enhed 18. Fordi stærk syre og base anvendes under phloroglucinol og Maule farvningsprocedurer henholdsvis skal udføres med forsigtighed nogle eksperimentelle trin. Både koncentreret HCI og ammoniumhydroxid er stærke ætsende; de kan forværres mikroskopbordet og objektivet hvis dias indeholder Ph-HCI og Maule farvede prøver ikke håndteres korrekt. De kan også tørre op hurtigt, inden for 5-10 min, hvilket prøver at forværres, så den billeddannende der skal gøres hurtigt. Toluidinblåt O er en polykromatisk pletten og pletter forskellige komponenter i cellevæggen i forskellige farver, som det reagerer med forskellige kemiske bestanddele af cellevægge forskelligt, der producerer en flerfarvede prøve. Farverne genererede kan provide oplysninger om arten af cellen. Toluidinblåt O er også et kationisk farvestof, som binder til negativt ladede grupper 5,6. En vandig opløsning af dette farvestof blå, men forskellige farver frembringes, når farvestoffet bindes med forskellige anioniske grupper i cellen. For eksempel er farverne en rosa lilla, når farvestoffet reagerer med carboxylerede polysaccharider, såsom pectin; grøn, grønlig blå eller lyse blå med aromatiske stoffer såsom lignin og tanniner; og lilla eller grønlig blå med nukleinsyrer. Farvningen er let og kan vare i to dage.
Calcofluor hvide pletter cellulose, callose og andre nonsubstituted eller svagt substituerede β-glucaner 6-9 og congorødt pletter direkte til β-(1 → 4)-glucaner og især cellulose 8,10,11. Calcofluor hvide pletter glimrende overhuden, cortex og marv men at genialitet er reduceret betydeligt i veddet og interfascicular fibre. Der er to possible forklaringer på den reducerede fluorescens Calcofluor hvid i stærkt forveddede væv; man tilskriver den til tilstedeværelsen af lignin, der til gengæld ville reducere muligheden for Calcofluor hvidt at diffundere ordentligt gennem polysacchariderne. En anden forklaring peger på en delvis standsning af fluorescens, der udsendes af Calcofluor hvide spændt under UV. I modsætning til Calcofluor hvide, Congo Red-farvning synes mindre påvirket af tilstedeværelsen af lignin. Det kan være relateret til forskellen i fluorescens egenskaber mellem Calcofluor hvid og congorødt; en bedre diffusion evne congorødt gennem forveddede væv end Calcofluor hvid; eller en lille forskel i polysaccharid bindende egenskaber 22. Det er vigtigt at bemærke, at de sektioner farves med congorødt ikke bør opbevares for længe, før billeddannelse, fordi congorødt tendens til at blive skyllet væk i vand.
Selv histokemisk farvning er hverken kvantitativtheller ikke absolut afgørende, kan det afsløre gennem visuelle referencer et væld af oplysninger om vigtige egenskaber såsom integriteten af væv eller unormal cellevæg deposition og lignification. Farvningen ovenfor beskrevne teknikker er nemme at udføre og er gældende for kritiske elementer i en plantecelle væg, såsom lignin og cellulose. Derimod er immunfluorescens under anvendelse af specifikke antisera og monoklonale antistoffer, der kræves til påvisning af forskellige komponenter af hemicellulose og pectin. Denne rapport er beregnet til at fungere som en primer for begyndere inden for sekundære cellevæg farvning, der bruger A. thaliana som deres model system.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Acknowledgments
Vi er taknemmelige for Sabin Russell til redigering assistance. Dette arbejde var en del af DOE Joint BioEnergy Institute (http://www.jbei.org), støttet af det amerikanske Department of Energy, Office of Science, Kontoret for Biologiske og Miljøforskning gennem kontrakt DE-AC02-05CH11231 mellem Lawrence Berkeley National Laboratory og US Department of Energy.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Agarose | EMD | MERC2125 | CAS Number: 9012-36-6 |
| Phloroglucinol | Sigma | P 3502 | 1,3,5-trihydroxybenzene [CAS Number: 108-73-6] |
| Hydrochloric acid | EMD | HX0603-75 | CAS Number: 7647-01-0 |
| Ammonium hydroxide | EMD | AX1303-6 | CAS Number: 1336-21-6 |
| Toulidine Blue O | Sigma | T3260 | Blutene chloride, Tolonium Chloride [CAS Number 92-31-9] |
| Potassium permanganate | Sigma | 223468 | CAS Number 7722-64-7 |
| Ethanol 190 proof | KOPTEC | V1401 | CAS Number: 64-17-5 |
| Congo Red | Sigma | C6277 | Disodium 3,3'-[[1,1'-biphenyl]-4,4'-diylbis(azo)]bis(4-aminonaphthalene 1-sulphonate) [CAS Number 573-58-0] |
| Fluorescent Brightener 28/ Calcofluor White Stain | Sigma | F3543 | 4,4'-Bis[[4-[bis(2-hydroxyethyl)amino]-6-anilino-1,3,5-triazin-2-yl]amino]stilbene-2,2'-disulphonic acid [CAS Number 4404-43-7] |
| Vibratome | Leica | Leica Vibrating blade microtome VT1000S | http://www.leicabiosystems.com/products/sectioning/vibrating-blade-microtomes/details/product/leica-vt1000-s/ |
| Razor | American Safety razor company | Item # 60-0139-0000 | Stainless Steel Double Edge Blade (Personna Super) |
| Screw Cap Microcentrifuge Tubes (2 ml) | VWR | 16466-044 | |
| Microcentrifuge Tubes (0.6 ml) | Axygen Scientific | MCT-060-C | |
| Mitt | Bel-Art | 380000000 | SCIENCEWARE Hot Hand Protector Mitt |
| Tissue adhesive | Ted Pella Inc | 10033 | Store at 4 °C or 20 °C for 3 months or longer storage |
| Microwave | Panasonic | NN-SD762S | PELCO Pro CA 44 Instant tissue adhesive |
| Camera with CCD chip with no mechanical shutter | Hamamatsu | C4742-95 | |
| High speed color camera | QImaging | MicroPublisher 5.0 RTV | |
| Camera software | Molecular Devices | MetaMorph version 7.7.0.0 | |
| Imagining anaylsis | Adobe | Photoshop CS4 | |
| Micro Cover Glasses, Square, No. 1 | VWR | 48366-067 | 22 x 22 mm (7/8 x 7/8")-Cover glasses are corrosion-resistant and uniformly thick and flat. No. 1 thickness is 0.13 to 0.17 mm. |
| Frosted Micro Slides, 1 mm | VWR | 48312-003 | 75 x 25 mm - 1 mm |
| Parafilm M | Alcan packaging | BRNDPM998 | |
| TX2 Filter cube | Leica | 11513851/11513885 | Filter used for Congo red analysis with a band-pass of 560/40. |
References
- Boerjan, W., Ralph, J., Baucher, M. Lignin biosynthesis. Annual review of plant biology. 54, 519-546 (2003).
- Vanholme, R., Demedts, B., Morreel, K., Ralph, J., Boerjan, W. Lignin biosynthesis and structure. Plant physiology. 153, 895-905 (2010).
- Humphreys, J. M., Chapple, C. Rewriting the lignin roadmap. Current opinion in plant biology. 5, 224-229 (2002).
- Adler, E. Lignin chemistry—past, present and future. Wood Sci. Technol. 11, 169-218 (1977).
- Brien, T. P., Feder, N., McCully, M. E. Polychromatic Staining of Plant Cell Walls by Toluidine Blue. 59, 368-373 (1964).
- Mori, B., Bellani, L. M. Differential staining for cellulosic and modified plant cell walls. Biotechnic & histochemistry: official publication of the Biological Stain Commission. 71, 71-72 (1996).
- Maeda, H., Ishida, N. Specificity of binding of hexopyranosyl polysaccharides with fluorescent brightener. Journal of biochemistry. 62, 276-278 (1967).
- Wood, P. J. Specificity in the interaction of direct dyes with polysaccharides. Carbohydrate Research. 85, 271-287 (1980).
- Hughes, J., McCully, M. E. The use of an optical brightener in the study of plant structure. Stain technology. 50, 319-329 (1975).
- Verbelen, J. P., Kerstens, S. Polarization confocal microscopy and congo red fluorescence: a simple and rapid method to determine the mean cellulose fibril orientation in plants. Journal of microscopy. 198, 101-107 (2000).
- Anderson, C. T., Carroll, A., Akhmetova, L., Somerville, C. Real-time imaging of cellulose reorientation during cell wall expansion in Arabidopsis roots. Plant physiology. 152, 787-796 (2010).
- Liljegren, S. Phloroglucinol Stain for Lignin. Cold Spring Harbor Protocols. , (2010).
- Nakano, J., Meshitsuka, G., lin, S., Dence, C. The Detection of Lignin Methods in Lignin Chemistry. , Springer-Verlag. Berlin. (1992).
- Sibout, R., et al. CINNAMYL ALCOHOL DEHYDROGENASE-C and -D are the primary genes involved in lignin biosynthesis in the floral stem of Arabidopsis. The Plant cell. 17, 2059-2076 (2005).
- Teather, R. M., Wood, P. J. Use of Congo red-polysaccharide interactions in enumeration and characterization of cellulolytic bacteria from the bovine rumen. Applied and environmental microbiology. 43, 777-780 (1982).
- Yeung, E. A beginner's guide to the study of plant structure. Proceedings of the 19th Workshop/Conference of the Association for Biology Laboratory Education (ABLE. 19, 365-36 (1998).
- Turner, S. R., Somerville, C. R. Collapsed xylem phenotype of Arabidopsis identifies mutants deficient in cellulose deposition in the secondary cell wall). The Plant Cell Online. 9, 689-701 (1997).
- Iiyama, K., Pant, R. The mechanism of the Mäule colour reaction. Introduction of methylated syringyl nuclei into softwood lignin. Wood Sci. Technol. 22, 167-175 (1988).
- Yang, F., et al. Engineering secondary cell wall deposition in plants. Plant biotechnology journal. 11, 325-335 (2013).
- Zhong, R., Ripperger, A., Ye, Z. H. Ectopic deposition of lignin in the pith of stems of two Arabidopsis mutants. Plant physiology. 123, 59-70 (2000).
- Chapple, C. C., Vogt, T., Ellis, B. E., Somerville, C. R. An Arabidopsis mutant defective in the general phenylpropanoid pathway. The Plant cell. 4, 1413-1424 (1992).
- Fagard, M., et al. PROCUSTE1 Encodes a Cellulose Synthase Required for Normal Cell Elongation Specifically in Roots and Dark-Grown Hypocotyls of Arabidopsis. The Plant Cell Online. 12, 2409-2423 (2000).
