La tinción histoquímica de<em> Arabidopsis thaliana</em> Celda Secundaria Elements Pared

Summary

Plant cell wall composition varies between tissue types and can include lignin, cellulose, hemicelluloses, and pectin. Various staining techniques have been developed to visualize differences at the cell-type level. This paper is a compilation of commonly used cell wall staining techniques.

Abstract

Arabidopsis thaliana is a model organism commonly used to understand and manipulate various cellular processes in plants, and it has been used extensively in the study of secondary cell wall formation. Secondary cell wall deposition occurs after the primary cell wall is laid down, a process carried out exclusively by specialized cells such as those forming vessel and fiber tissues. Most secondary cell walls are composed of cellulose (40–50%), hemicellulose (25–30%), and lignin (20–30%). Several mutations affecting secondary cell wall biosynthesis have been isolated, and the corresponding mutants may or may not exhibit obvious biochemical composition changes or visual phenotypes since these mutations could be masked by compensatory responses. Staining procedures have historically been used to show differences on a cellular basis. These methods are exclusively visual means of analysis; nevertheless their role in rapid and critical analysis is of great importance. Congo red and calcofluor white are stains used to detect polysaccharides, whereas Mäule and phloroglucinol are commonly used to determine differences in lignin, and toluidine blue O is used to differentially stain polysaccharides and lignin. The seemingly simple techniques of sectioning, staining, and imaging can be a challenge for beginners. Starting with sample preparation using the A. thaliana model, this study details the protocols of a variety of staining methodologies that can be easily implemented for observation of cell and tissue organization in secondary cell walls of plants.

Introduction

La pared celular vegetal tiene una gran cantidad de información dentro de sus diversos componentes: lignina, celulosa, hemicelulosa (xilano, glucuronoxilano, xiloglucano, arabinoxilano, vinculación mixta de glucano, o glucomanano), y pectina. Técnicas histológicas proporcionan importantes pistas visuales en el estudio de las diferencias dentro de las paredes celulares secundarias en los niveles de organización y celulares. Diversas técnicas histológicas fueron desarrollados y se pueden encontrar en la literatura, pero estas técnicas puede ser difícil y requiere mucho tiempo para los principiantes debido a protocolos muy detalladas con instrucciones visuales simples son rara vez disponible. El objetivo de este estudio es proporcionar pautas sencillas para las técnicas de tinción histológica para obtener imágenes de alta calidad.

Seccionar el tejido del tallo es el primer paso en la visualización de las paredes celulares y formas celulares. Aunque las secciones cortadas a mano son baratos y requieren menos tiempo para prepararse, el uso de un vibratome ofrece consistencia yproduce imágenes de alta calidad. El uso de un vibratomo permite producir mejor calidad de los datos mediante la generación de incluso secciones con el mismo espesor, lo que ayuda a producir imágenes nítidas y reduce significativamente el riesgo de producir diferencias inexactas entre las muestras que se causada simplemente por una mala preparación de la muestra. El uso de resinas para fijar especímenes frescos puede ser un desafío para los principiantes y todavía puede llevar mucho tiempo, incluso para los expertos en el análisis que debe hacerse rápidamente. Además, se hace imposible para medir cualquier actividad biológica con la muestra cuando se ha incorporado en una resina. Una técnica simple que emplea agarosa y un molde casero es útil para la incrustación de tejidos del tallo, y también se puede utilizar en otras aplicaciones que requieren la disección de los tejidos blandos. En comparación con la incrustación de especímenes en la resina, este método tiene la ventaja de mantener los tejidos vivos y la reducción de la manipulación de la muestra. Seccionamiento tejidos a través de un vibratomo es altamente preciso y genera homogensecciones unidades organizativas, que, dependiendo del objetivo del estudio, a continuación, se pueden utilizar con varias técnicas de tinción diferentes.

Los métodos más sencillos para visualizar la lignina y otros compuestos aromáticos emplean radiación ultravioleta (UV). La excitación de las moléculas de base de compuestos aromáticos por la luz UV es una técnica antigua, pero sigue siendo uno de los métodos más rápidos para la visualización de la lignina. Sin embargo, la visualización UV en realidad no es ideal para la detección de la lignina, porque la luz UV excitará otros compuestos aromáticos. La lignina se compone principalmente de tres componentes básicos, los monolignoles (alcoholes hidroxicinamil: alcohol coniferil, alcohol sinapílico y alcohol p-cumaril) ^1-3. Mancha Phloroglucinol puede proporcionar pistas sobre la magnitud de cinnamaldehydes presentes en el xilema, fibras y tejidos traqueales ^4. Floroglucinol es un buen indicador de cinnamaldehydes generales y puede diferenciar entre cinnamaldehydes y otros compuestos aromáticos. Los monómeros de alcohol sinapílico se pueden detectary diferenciados por el uso de Maule mancha. Azul de toluidina O es un colorante policromático y por lo tanto tiene la capacidad de manchar diferentes elementos de la pared celular en diferentes colores ^5,6. El principal uso de azul de toluidina O es detectar pectina y ^5,6 lignina. La ventaja de la utilización de azul de toluidina O es que muchos elementos de la pared celular pueden ser visualizados en un solo paso. Tanto calcoflúor blanco y rojo congo son fáciles de trabajar con y se pueden utilizar para visualizar celulosa. Calcofluor manchas blancas de celulosa, callosa, y otros β-glucanos, no sustituidos o sustituidos débilmente ^6-9, mientras que el congo manchas rojas directamente a β-glucanos (1 → 4) y, en particular y celulosa ^10,11. El objetivo de este estudio es proporcionar pautas sencillas para el uso de las técnicas de tinción antes mencionados para obtener imágenes de alta calidad a partir de A. thaliana tallos.

Protocol

1. Stem incrustación Hacer una solución de agarosa al 7% en agua (de 7 g de agarosa de electroforesis-grado en 100 ml de agua destilada). Disolver la agarosa en autoclave durante 20 min o en el microondas durante 20 min a una intensidad más baja (por ejemplo, intensidad de 10% de un horno de microondas 1250 vatios). Preparar un molde hecho en casa para incrustar los tallos usando viales de plástico. El uso de una hoja de afeitar, cortar la parte inferior cónica de un tubo de m…

Representative Results

Stem inclusión y corte: El uso del molde de plástico hecha en casa para incrustar los tallos en 7% de agarosa demostrado ser rápido y fácil (Figura 1). Las dos partes (A y B; Figura 1) del sistema vial incrustado hacen que sea sencillo para liberar fácilmente el vástago incrustado en agarosa, tal como la agarosa no se pegue a las partes de los viales que son inertes, mantener el sistema limpio. Los viales se pueden reutilizar varias veces por año. La conveniencia de almace…

Discussion

Secciones de tallo de A. thaliana se utilizan ampliamente para estudiar la organización de las células en la pared celular secundaria y para examinar cualitativamente las diferencias entre el tipo salvaje y las plantas transgénicas. Las técnicas utilizadas para el corte de las muestras son de corte directo de las manos; o cuando las muestras están incrustados en agarosa o fijador, seccionamiento se puede hacer con un vibratome o microtomo. En contraste con el corte manual, los dos últimos permiten reducir…

Materials

Agarose	EMD	MERC2125	CAS Number: 9012-36-6
Phloroglucinol	Sigma	P 3502	1,3,5-trihydroxybenzene [CAS Number: 108-73-6]
Hydrochloric Acid	EMD	HX0603-75	CAS Number: 7647-01-0
Ammonium hydroxide	EMD	AX1303-6	CAS Number: 1336-21-6
Toulidine Blue O	Sigma	T3260	Blutene chloride, Tolonium Chloride [CAS Number 92-31-9]
Potassium permanganate	Sigma	223468	CAS Number 7722-64-7
Ethanol 190 proof	KOPTEC	V1401	CAS Number: 64-17-5
Congo Red	Sigma	C6277	Disodium 3,3'-[[1,1'-biphenyl]-4,4'-diylbis(azo)]bis(4-aminonaphthalene 1-sulphonate) [CAS Number 573-58-0 ]
Fluorescent Brightener 28/ Calcofluor White Stain	Sigma	F3543	4,4'-Bis[4-[bis(2-hydroxyethyl)amino]-6-anilino-1,3,5-triazin-2-yl]amino]stilbene-2,2'-disulphonic acid [CAS Number 4404-43-7]
Vibratome	Leica	Leica Vibrating blade microtome VT1000S	http://www.leicabiosystems.com/products/sectioning/vibrating-blade-microtomes/details/product/leica-vt1000-s/
Razor	American Safety razor company	Item # 60-0139-0000	Stainless Steel Double Edge Blade (Personna Super)
Screw Cap Microcentrifuge Tubes (2ml)	VWR	16466-044
Microcentrifuge Tubes (0.6ml)	Axygen Scientific	MCT-060-C
Mitt	Bel-Art	380000000	SCIENCEWARE  Hot Hand Protector Mitt
Tissue adhesive	Ted Pella Inc	10033	Store at 4°C or 20°C for 3 months or longer  storage
Microwave	Panasonic	NN-SD762S	PELCO Pro CA 44 Instant tissue adhesive
Camera with CCD chip with no mechanical shutter	Hamamatsu	C4742-95
High speed color camera	QImaging	MicroPublisher 5.0 RTV
Camera software	Molecular Devices	MetaMorph version 7.7.0.0
Imagining anaylsis	Adobe	Photoshop CS4
Micro Cover Glasses, Square, No.1	VWR	48366-067	22 x 22 mm (7/8 x 7/8")-Cover glasses are corrosion-resistant and uniformly thick and flat. No. 1 thickness is 0.13 to 0.17mm.
Frosted Micro Slides, 1mm	VWR	48312-003	75 x 25 mm- 1mm
TX2 Filter cube	Leica	11513851/11513885	Filter used for Congo red analysis with a band-pass of 560/40.
Parafilm M	Alcan packaging	BRNDPM998