Her presenterer vi våre etablert metode for å omprogrammere humane somatiske celler i transgene-free menneskelige iPSCs med Sendai virus, som viser konsistent utfall og forbedret effektivitet.
For noen år siden, etablering av menneskeskapte pluripotent stamceller (iPSCs) innledet en ny æra i biomedisin. Potensielle anvendelser av humane iPSCs inkluderer modellering patogenesen av genetiske sykdommer, autolog celle behandling etter gen korreksjon, og tilpasset medikamentscreening ved å gi en kilde for pasientspesifikke og symptom relevante celler. Imidlertid er det flere hindringer å overvinne, som eliminerer resterende omprogrammering faktor transgen ekspresjon etter menneske iPSCs produksjon. Enda viktigere, kan resttransgene uttrykk i udifferensierte menneskelige iPSCs hemme riktig differensiering og villede tolkningen av sykdoms relevant in vitro fenotyper. Med denne grunn har integrering-fri og / eller i transgene-fritt menneskelig iPSCs blitt utviklet ved hjelp av flere metoder, slik som adenovirus, den piggyBac system, minicircle vektor, episomal vektor, direkte protein levering og syntetisert mRNA. Men effektiviteten av reprogramming bruker integrasjonsfrie metoder er ganske lav i de fleste tilfeller.
Her presenterer vi en metode for å isolere menneskelige iPSCs ved hjelp av Sendai-virus (RNA-virus) basert omprogrammering system. Dette omprogrammering metoden viser konsistente resultater og høy effektivitet i kostnadseffektiv måte.
Humane embryonale stamceller (hESCs) har en evne til selv-fornyes in vitro og har pluripotency, som kan være potensielt nyttige for sykdom modellering, for drug screening, og for å utvikle cellebaserte terapier for å behandle sykdommen og vev skader. Men hESCs har en begrensning for celle erstatning terapi på grunn av immunologiske, onkologiske og etiske barrierer, og å studere sykdomsrelaterte gener, kan sykdomsspesifikke hESCs isoleres gjennom pre-implantasjon genetisk diagnose (PGD) nærmer seg, men det er fortsatt teknisk utfordrende og embryo donasjoner er ganske sjelden. Disse problemene er knyttet til fremdriften i stamcellebiologi, noe som har ført til utvikling av induserte pluripotente stamceller (hiPSCs).
Menneskelige iPSCs er genetisk omprogrammeres fra menneskelige voksne somatiske celler og havnen pluripotent stamcelle-lignende funksjoner som ligner på hESCs, noe som gjør dem en nyttig kilde for regenerativ medisin som drug oppdagelse, sykdom modellering og celleterapi i pasient-spesifikk måte 1,2.
Til nå, er det flere metoder for å generere humane iPSCs, inkludert virus-mediert (retrovirus og adenovirus) 3, ikke-virus-mediert (BAC system og vektorer transfeksjon) 4 gen transductions, og protein leveringssystemet 5-7.
Selv om en leveranse av virus-mediert gener kan sikre en viss grad av effektivitet, kunne virale vektorer forlate genetisk fotavtrykk, fordi de integrere i verts kromosomer å uttrykke omprogrammering gener på en ukontrollert måte. Selv når viral integrering av transkripsjonsfaktorer kan aktivere eller deaktivere verts gener 8, kan det føre til en uventet genetisk avvik og risiko for tumorigenesis 5,9. På den annen side ble den direkte innføring av proteiner eller RNA inn i somatiske celler rapportert, men har noen ulemper slik som arbeidskrevende, gjentas transfEL, og lavt nivå av omprogrammering 7,10. Selv episomal og ikke-integrere adenovirus, adeno-assosiert virus, og plasmidvektorer som fremdeles forholdsvis mindre effektive 11. For disse grunner, er det plausibelt å velge ikke-integrasjon omprogrammering metoder med høy effekt av iPSC generasjon og færre genetiske avvik. I denne studien bruker vi en Sendai-virus basert omprogrammering. Denne metoden er kjent for å være ikke-integrert i vertsgenomet og konsekvent produserer menneskelige iPSCs uten transgene integrasjoner.
Omprogrammering menneskelige somatiske celler til hiPSCs innehar enestående løftene i grunnleggende biologi, personlig medisin, og transplantasjon 12. Tidligere menneskelige iPSC generasjoner kreves DNA virus som har integrasjon risiko i verten genomet, noe som kan skape uønskede genetiske mutasjoner som begrenser ytterligere kliniske applikasjoner som narkotika utvikling og transplantasjon terapi 13. Med denne grunn har mange studier blitt rapportert å generere vektor-og transgene-fritt system…
The authors have nothing to disclose.
Vi vil gjerne takke medlemmene av Lee lab for verdifulle diskusjoner om manuskriptet. Arbeid i Lee lab ble støttet med tilskudd fra Robertson Investigator Award of New York Stem Cell Foundation og fra Maryland Stem Cell Research Fund (TEDCO).
CytoTune-iPS Reprogramming Kit | invitrogen | A1378002 | |
CF-6,MEFs, neomycin-resistant, mitomycin C treated | Global stem | GSC-6105M | 5X105/6cm or 12.5X105/24 well plate |
Trypsin EDTA 0.25% Trypsin with EDTA 4Na 1X | invitrogen | 25200114 | |
DMEM/F-12 medium | invitrogen | 11330-032 | |
24-well Cell Culture Plate, flat-bottom with lid | BD | 353935 | |
Y-27632 | TOCRIS | 1254 | 10 uM (Stock: 10 mM) |
basic fibroblast growth factor | LIFE TECHNOLOGIES | PHG0263 | 10 ng (Stock : 100 ug) |
Knock-out serum replacement | Gibco | 10828028 | |
Dulbecco's Modified Eagle Medium (D-MEM, DMEM) (1X), liquid (high glucose) | invitrogen | 11965118 | |
Fetal bovine serum | Thermo Scientific Fermentas | SH30071.03 | |
L-Glutamine-200 mM (100X), liquid | GIBCO | 25030-081 | 1/100 |
MEM Non-Essential Amino Acids Solution, 100X | LIFE TECHNOLOGIES | 11140050 | 1/100 |
2-Mercaptoethanol (1,000X), liquid | GIBCO | 21985023 | 1/1000 |
Hausser Phase Contrast Hemacytometers | Hausser Scientific | 02-671-54 | |
EmbryoMax 0.1% Gelatin Solution | Millipore | ES-006-B | |
SSEA-4 | DSHB | MC-813-70 | 1/200 |
anti-Tra-1-81 | cell signaling | 4745S | 1/200 |
mouse monoclonal Oct4 antibody | Santa Cruz | SC-5279 | 1/1000 |
Nanog | R&D | AF1997 | 1/1000 |
Alexa Flouor 488 goat anti-mouse | invitrogen | 948492 | 1/2000 |
DPBS (Dulbecco's Phosphate-Buffered Saline), 1X without calcium & magnesium | cellgro | 21-031-CV | |
QuantiTect Reverse Transcription Kit | QIAGEN | 205313 | |
PCR Master Mix [2X] | Thermo Scientific Fermentas | K0171 | |
Trizol | invitrogen | 15596018 | |
picking hood | NuAire | NU-301 | |
dissecting scope | Nikon | SMZ745 |