A continuación, presentamos nuestro método establecido para reprogramar las células somáticas humanas en transgenes libre iPSCs humanas con virus Sendai, que muestra resultados consistentes y una mayor eficiencia.
Hace unos años, la creación de células madre pluripotentes inducidas humanas (iPSCs) marcó el comienzo de una nueva era en la biomedicina. Los usos potenciales de iPSCs humanos incluyen el modelado patogénesis de enfermedades genéticas humanas, la terapia celular autóloga después de la corrección de genes, y la detección de drogas personalizada, proporcionando una fuente de células relevantes y los síntomas específicos del paciente. Sin embargo, hay varios obstáculos que superar, como la eliminación del factor de reprogramación transgén expresión restante después de la producción iPSCs humanos. Más importante aún, la expresión transgénica residual en iPSCs humanas indiferenciadas podría obstaculizar diferenciaciones adecuadas y confundir a la interpretación de los fenotipos in vitro relevantes enfermedad. Con este motivo, se han desarrollado-la integración libre y / o iPSCs humanos transgenes gratis con varios métodos, como el adenovirus, el sistema piggyBac, minicircle vector, vectores episomales, entrega directa de proteínas y ARNm sintetizado. Sin embargo, la eficiencia de reprogramming utilizando métodos de integración libre es bastante bajo en la mayoría de los casos.
A continuación, presentamos un método para aislar iPSCs humanos mediante el uso de Sendai-virus (virus RNA) sistema de reprogramación en base. Este método de reprogramación muestra resultados consistentes y de alta eficiencia en forma rentable.
Las células madre embrionarias (hESCs) tienen una capacidad de auto-renovación in vitro y tienen la pluripotencia, lo que podría ser potencialmente útil para el modelado de la enfermedad, para la detección de drogas, y para el desarrollo de terapias basadas en células para tratar lesiones de la enfermedad y del tejido. Sin embargo, hESCs tienen una limitación para la terapia de reemplazo de la célula debido a las barreras inmunológicas, oncológicas y éticas, y para estudiar los genes relacionados con la enfermedad, hESCs específicos de la enfermedad pueden ser aislados a través de pre-implantación diagnóstico genético (PGD) se acerca, pero sigue siendo un reto técnico y las donaciones de embriones son bastante raros. Estos problemas están relacionados con el progreso en la biología de células madre, lo que ha llevado al desarrollo de células madre pluripotentes inducidas (hiPSCs).
IPSCs humanos se reprograman genéticamente a partir de células somáticas adultas humanas y albergan características madre pluripotentes similares a células similares a hESCs, que los convierte en una fuente útil para la medicina regenerativa, como ddescubrimiento alfombra, el modelado de la enfermedad y la terapia celular en forma específica para cada paciente 1,2.
Hasta ahora, hay varios métodos para generar iPSCs humanos, incluyendo mediada por virus (retrovirus y adenovirus) 3, no el virus mediada (sistema de BAC y vectores de transfección) 4 transducciones de genes, y del sistema de administración de proteínas 5-7.
Aunque una entrega de genes mediada por virus puede garantizar un cierto nivel de eficiencia, vectores virales podrían dejar huella genética, debido a que se integran en los cromosomas del hospedador para expresar genes de reprogramación de una manera incontrolada. Incluso cuando la integración viral de factores de transcripción puede activar o inactivar genes de acogida 8, que puede causar una aberración genética inesperado y el riesgo de 5,9 tumorigénesis. Por otra parte, se informó de la introducción directa de proteínas o ARN en las células somáticas, pero tienen algunas desventajas tales como, transf repetida mano de obra intensivaexión, y el bajo nivel de la reprogramación de 7,10. Incluso episomal y no la integración de adenovirus, virus adeno-asociados, y vectores plasmídicos son todavía relativamente menos eficiente 11. Por estas razones, es plausible para elegir métodos de reprogramación no-integración con alta eficacia de generación de IPSC y un menor número de anomalías genéticas. En este estudio, utilizamos una reprogramación basada Sendai-virus. Este método es conocido por ser no integrado en el genoma huésped y produce consistentemente iPSCs humanos sin integraciones transgén.
La reprogramación de las células somáticas humanas con hiPSCs sostiene promesas sin precedentes en la biología básica, la medicina personal, y el trasplante 12. Anteriormente, las generaciones IPSC humanos necesarios virus de ADN que tiene riesgo de integración en el genoma huésped, que puede crear mutaciones genéticas indeseables que limitan otras aplicaciones clínicas tales como el desarrollo de medicamentos y terapias de trasplante 13. Con este motivo, se ha informado de muchos estudios…
The authors have nothing to disclose.
Nos gustaría dar las gracias a los miembros del laboratorio Lee valiosa para los debates sobre el manuscrito. El trabajo en el laboratorio de Lee fue apoyado por becas de Robertson Investigator Award de la Fundación de Células Madre de Nueva York y de Maryland Stem Cell Research Fund (TEDCO).
CytoTune-iPS Reprogramming Kit | invitrogen | A1378002 | |
CF-6,MEFs, neomycin-resistant, mitomycin C treated | Global stem | GSC-6105M | 5X105/6cm or 12.5X105/24 well plate |
Trypsin EDTA 0.25% Trypsin with EDTA 4Na 1X | invitrogen | 25200114 | |
DMEM/F-12 medium | invitrogen | 11330-032 | |
24-well Cell Culture Plate, flat-bottom with lid | BD | 353935 | |
Y-27632 | TOCRIS | 1254 | 10 uM (Stock: 10 mM) |
basic fibroblast growth factor | LIFE TECHNOLOGIES | PHG0263 | 10 ng (Stock : 100 ug) |
Knock-out serum replacement | Gibco | 10828028 | |
Dulbecco's Modified Eagle Medium (D-MEM, DMEM) (1X), liquid (high glucose) | invitrogen | 11965118 | |
Fetal bovine serum | Thermo Scientific Fermentas | SH30071.03 | |
L-Glutamine-200 mM (100X), liquid | GIBCO | 25030-081 | 1/100 |
MEM Non-Essential Amino Acids Solution, 100X | LIFE TECHNOLOGIES | 11140050 | 1/100 |
2-Mercaptoethanol (1,000X), liquid | GIBCO | 21985023 | 1/1000 |
Hausser Phase Contrast Hemacytometers | Hausser Scientific | 02-671-54 | |
EmbryoMax 0.1% Gelatin Solution | Millipore | ES-006-B | |
SSEA-4 | DSHB | MC-813-70 | 1/200 |
anti-Tra-1-81 | cell signaling | 4745S | 1/200 |
mouse monoclonal Oct4 antibody | Santa Cruz | SC-5279 | 1/1000 |
Nanog | R&D | AF1997 | 1/1000 |
Alexa Flouor 488 goat anti-mouse | invitrogen | 948492 | 1/2000 |
DPBS (Dulbecco's Phosphate-Buffered Saline), 1X without calcium & magnesium | cellgro | 21-031-CV | |
QuantiTect Reverse Transcription Kit | QIAGEN | 205313 | |
PCR Master Mix [2X] | Thermo Scientific Fermentas | K0171 | |
Trizol | invitrogen | 15596018 | |
picking hood | NuAire | NU-301 | |
dissecting scope | Nikon | SMZ745 |