Lineage-omprogrammering af pericyt-afledte Celler af Voksen Menneskelige hjerne til Inducerede Neuroner
Summary
Målretning hjerne-resident celler til direkte afstamning-omprogrammering giver nye perspektiver for hjernen reparation. Her beskriver vi en protokol om, hvordan man forbereder kulturer beriget med hjerne-resident pericytes fra voksent menneske hjernebarken og konvertere disse til inducerede neuroner ved retrovirusmedieret udtryk for transskriptionsfaktorerne Sox2 og Ascl1.
Abstract
Direkte afstamning-omprogrammering af ikke-neuronale celler i inducerede neuroner (INS), kan give indsigt i de molekylære mekanismer, der ligger neurogenesis og muliggøre nye strategier for in vitro-modellering eller reparation af syge hjerne. Identifikation hjerne-resident non-neuronale celletyper kan underkastes direkte omdannelse til iNs kunne åbne mulighed for at iværksætte en sådan tilgang in situ, dvs inden for den beskadigede hjernevæv. Her beskriver vi en protokol udviklet i forsøg på at identificere celler fra den voksne humane hjerne, som opfylder denne forudsætning. Denne protokol omfatter: (1) dyrkning af humane celler fra den cerebrale cortex opnået fra voksne humane hjerne biopsier; (2) in vitro ekspansion (ca. kræve 2-4 uger), og karakterisering af kulturen ved immunocytokemi og flowcytometri; (3) tilsætning af fluorescens-aktiveret cellesortering (FACS) under anvendelse af anti-PDGF-receptor-β og anti-CD146-antistoffer;(4) retrovirus-medieret transduktion med neurogen transskriptionsfaktorerne Sox2 og ascl1; (5) og endelig karakterisering af de resulterende pericyt-afledte inducerede neuroner (PdiNs) efter immuncytokemi (14 dage til 8 uger efter retroviral transduktion). På dette stadium, kan iNs probes for deres elektriske egenskaber ved patch-clamp optagelse. Denne protokol giver en meget reproducerbar procedure for in vitro afstamning konvertering af hjerne-resident pericytes i funktionelle menneskelige ins.
Introduction
I modsætning til omprogrammering af somatiske celler i induceret pluripotente stamceller (iPSCs), som igen er udstyret med en overflod af differentiering potentialer direkte omprogrammering sigter til lige omdannelse af en specifik celletype til en anden. Med hensyn til deres anvendelse i forbindelse med sygdom modellering og potentielle cellebaserede behandlingsformer af begge omprogrammering tilgange har særlige fordele og ulemper. Omprogrammering ind iPSCs (I) giver en næsten uendelig kilde af celler; (Ii) giver mulighed for genteknologi; (Iii) forlener med en næsten ubegrænset potentiale differentiering. Men de store ulemper ved iPSCs medføre risiko for tumorgenicitet af udifferentierede celler (teratom dannelse in vivo), og behovet for ex vivo dyrkning og efterfølgende transplantation, hvis disse celler skal anvendes til cellebaserede behandlingsformer. Omvendt er direkte afstamning-omprogrammering begrænset af lavere udbytte af de ønskede cellersom korrelerer direkte med antallet af de målrettede celler start befolkning, men har den fordel, at afstamning-omprogrammeret celler synes ikke at udvise nogen tumorigen risiko ved transplantation 1,2; desuden kan direkte omprogrammering selv opnås in situ, dvs inden for orgel, hvor disse celler ville være påkrævet, så man undgår behovet for transplantation.
Med dette i tankerne, har vores laboratorium forfulgt muligheden for slægt-omprogrammering hjerne-resident celler i iNs som en ny tilgang til cellebaserede behandlingsformer af neurodegenerative sygdomme. Brain-resident celler, der kan være potentielt betragtes som cellulære mål for linjespecifikt omprogrammering omfatte forskellige typer af macroglia (astrocytter, NG2 celler og oligodendrocytter), mikroglia og mikrokar-associerede celler (endotelceller og pericytter). Vi har grundigt undersøgt in vitro omprogrammering potentiale astroglia af cerebral cortex af tidlig postnatal mus 3-5. På jagt efter tilsvarende egnede cellekilder til direkte afstamning-omprogrammering i den voksne menneskelige hjerne, stødte vi på en celle befolkning, der med held kan omprogrammeres i Ins og udstille kendetegnende for pericytes. Her beskriver vi en protokol, hvordan at høste disse celler fra voksne humane hjerne biopsier, udvide og berige disse celler in vitro, og endelig held omprogrammere en væsentlig del af disse in vitro-ekspanderede celler (i størrelsesordenen 25-30%) i ins. Omprogrammering kan opnås ved samtidig retrovirus-medieret co-ekspression af to transskriptionsfaktorer, Sox2 og ascl1. Disse PdiNs fandtes at erhverve evne til gentagen handling potentiel fyring og tjene som synaptiske mål for andre neuroner, der angiver deres evne til at integrere sig i neurale netværk. Vores protokol giver en enkel procedure til isolering og afstamning konvertering af voksne menneskelige hjerne pericytes i ins. </p>
Protocol
Representative Results
Discussion
Den nuværende protokol beskriver in vitro ekspansion og berigelse af pericyt-afledte celler efter isolering fra voksent menneske hjernebarken og den efterfølgende omdannelse til iNs ved retrovirusmedieret udtryk for neurogene transskriptionsfaktorerne Sox2 og Ascl1. En sådan protokol giver et eksperimentelt in vitro-system til at studere slægt-konvertering af hjerne-resident celler til neuroner og potentielt også glia, med det mål for øje at i sidste ende omsætte denne direkte tilgang omregning…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Vi er taknemmelige for Dr. Magdalena Götz for hendes input under udviklingen af denne protokol. Vi takker Dr. Marius Wernig (Stanford University) for generøst at give os med Sox2 kodende sekvens. Vi er også meget taknemmelige til Dr. Alexandra Lepier for virus produktion. Dette arbejde blev støttet af tilskud fra Deutsche Forschungsgemeinschaft (BE 4182/2-2) og BMBF (01GN1009A) til BB, og det bayerske stat, Ministeriet for Videnskab, forskning og kunst til MK og BBCS modtaget støtte fra binationalt SYSTHER- INREMOS Virtual Institute (tysk og slovensk forbundsministerierne for Uddannelse og Forskning) og DFG (SFB 824).
Materials
| anti-CD140b-PE | BD Biosciences | 558821 | use 1:100 |
| anti-CD146-FITC | AbD Serotec | MCA2141FT | use 1:100 |
| anti-CD13-FITC | AbD Serotec | MVA1270A488T | use 1:100 |
| anti-CD34-APC | BD Biosciences | 560940 | use 1:100 |
| anti-PDGFRβ | Cell Signaling | 3169S | use 1:200 |
| anti-CD146 | Abcam | Ab75769 | use 1:400 |
| anti-NG2 | Millipore | AB5320 | use 1:400 |
| anti-SMA | Sigma-Aldrich | A2547 | use 1:400 |
| anti-βIII-tubulin | Sigma-Aldrich | T8660 | use 1:400 |
| anti-MAP2 | Sigma-Aldrich | M4403 | use 1:200 |
| anti-GFAP | Sigma-Aldrich | G3893 | use 1:600 |
| anti-GFP | Aves Labs | GFP 10-20 | use 1:1000 |
| anti-RFP | Chromotek | 5F8 | use 1:500 |
| anti-S100β | Sigma-Aldrich | S2532 | use 1:300 |
| anti-NeuN | Millipore | MAB377 | use 1:200 |
| anti-GABA | Sigma-Aldrich | A2052 | use 1:500 |
| anti-Calretinin | Millipore | AB5054 | use 1:500 |
| anti-vGluT1 | SYnaptic SYstems | 135511 | use 1:1000 |
| Rat IgG1 isotype control FITC | AbD Serotec | 11-4301-81 | use 1:100 |
| Rat IgG1 isotype control PE | AbD Serotec | 12-4301-81 | use 1:100 |
| Rat IgG1 isotype control APC | AbD Serotec | 17-4301-81 | use 1:100 |
| TrypLE | Invitrogen | 12605-010 | |
| DMEM, high glucose, GlutaMAX | Invitrogen | 61965 | |
| B27 serum-free supplement | Invitrogen | 17504044 | |
| fetal calf serum | Invitrogen | 10106-169 | perform heat inactivation by incubation at 56 °C for 30 min |
| Penicillin-Streptomycin | Invitrogen | 15140122 | |
| HBSS (Hanks Balanced Salt Solution) | Invitrogen | 24020-091 | |
| Dulbecco's PBS without CaCl2 and MgCl2 (D-PBS, 1×; Invitrogen, cat. no. 14190) | Invitrogen | 14190 | |
| HEPES | Sigma-Aldrich | H3375 | |
| Poly-D-lysine hydrobromide (PDL) | Sigma-Aldrich | P0899 | |
| PFA (paraformaldehyde) | Sigma-Aldrich | P1648 | |
| Bovine serum albumin | Sigma-Aldrich | A9418 | |
| Triton X-100 | Sigma-Aldrich | T9284 | |
| DAPI (4′,6-Diamidin-2-phenylindole) dilactate | Sigma-Aldrich | 042M4005 | |
| Aqua-Poly/Mount | Polysciences | 18606-20 | |
| Polypropylene round-bottom tubes | BD Biosciences | 352063 | |
| Polystyrene round-bottom tubes with cell-strainer cap | BD Biosciences | 352235 | |
| 24-well plates | Orange Scientific | 5530305 | |
| 75 cm2 culture flasks | Greiner Bio-One | 658175 | |
| 25 cm2 culture flasks | Greiner Bio-One | 690175 | |
| Disposable pipettes 10 ml | Sarstedt | ######### | |
| Glass Pasteur pipettes (150 mm) | Fisherbrand | FB50251 | |
| Glass coverslips 12 mm diameter | Menzel | CB00120RA1 | |
| Surgical disposable scalpels | B. Braun | 5518083 | |
| Tissue culture dishes | Greiner Bio-One | 633180 | |
| Conical tubes 15ml | BD Biosciences | 352095 | |
| Laminar flow hood | |||
| Centrifuge and swing-out rotor with adapters for 15 ml and 50 ml tubes | Hettich Lab Technology | 1406 | |
| Flow cytometry cell sorter: FACSAria l with FACSDiva software | BD Biosciences | ||
| Humified cell culture incubator | Eppendorf Galaxy 170R | ||
| Wather bath at 37 °C | |||
| FACSFlow sheath fluid | BD Biosciences | 342003 | |
| Epifluorescence microscope BX61 | Olympus | ||
| Confocal microscope LSM710 | Zeiss |
References
- Caiazzo, M., et al. Direct generation of functional dopaminergic neurons from mouse and human fibroblasts. Nature. 476, 224-227 (2011).
- Kim, J., et al. Functional integration of dopaminergic neurons directly converted from mouse fibroblasts. Cell stem cell. 9, 413-419 (2011).
- Duan, B., et al. Interactions between water deficit, ABA, and provenances in Picea asperata. Journal of experimental botany. 58, 3025-3036 (2007).
- Heinrich, C., et al. Directing astroglia from the cerebral cortex into subtype specific functional neurons. PLoS Biol. 8, (2010).
- Heinrich, C., et al. Generation of subtype-specific neurons from postnatal astroglia of the mouse cerebral cortex. Nat Protoc. 6, 214-228 (2011).
- Gavrilescu, L. C., Van Etten, R. A. Production of replication-defective retrovirus by transient transfection of 293T cells. J Vis Exp. , (2007).
- Karow, M., et al. Reprogramming of pericyte-derived cells of the adult human brain into induced neuronal cells. Cell stem cell. 11, 471-476 (2012).
- Ortega, F., et al. Using an adherent cell culture of the mouse subependymal zone to study the behavior of adult neural stem cells on a single-cell level. Nat Protoc. 6, 1847-1859 (2011).
- Ladewig, J., et al. Small molecules enable highly efficient neuronal conversion of human fibroblasts. Nat Methods. 9, 575-578 (2012).
- Espuny-Camacho, I., et al. Pyramidal neurons derived from human pluripotent stem cells integrate efficiently into mouse brain circuits in vivo. Neuron. 77, 440-456 (2013).
- Davila, J., Chanda, S., Ang, C. E., Sudhof, T. C., Wernig, M. Acute reduction in oxygen tension enhances the induction of neurons from human fibroblasts. J Neurosci Methods. 216, 104-109 (2013).
- Vierbuchen, T., et al. Direct conversion of fibroblasts to functional neurons by defined factors. Nature. 463, 1035-1041 (2010).
- Pfisterer, U., et al. Direct conversion of human fibroblasts to dopaminergic neurons. Proc Natl Acad Sci USA. 108, 10343-10348 (2011).
- Lu, J., et al. Generation of Integration-free and Region-Specific Neural Progenitors from Primate Fibroblasts. Cell Rep. 3, 1580-1591 (2013).
- Yang, N., Ng, Y. H., Pang, Z. P., Sudhof, T. C., Wernig, M. Induced neuronal cells: how to make and define a neuron. Cell Stem Cell. 9, 517-525 (2011).
- Pang, Z. P., et al. Induction of human neuronal cells by defined transcription factors. Nature. 476, 220-223 (2011).
- Yoo, A. S., et al. MicroRNA-mediated conversion of human fibroblasts to neurons. Nature. 476, 228-231 (2011).
- Son, E. Y., et al. Conversion of mouse and human fibroblasts into functional spinal motor neurons. Cell Stem Cell. 9, 205-218 (2011).
- Lujan, E., Chanda, S., Ahlenius, H., Sudhof, T. C., Wernig, M. Direct conversion of mouse fibroblasts to self-renewing, tripotent neural precursor cells. Proc Natl Acad Sci USA. 109, 2527-2532 (2012).
- Thier, M., et al. Direct conversion of fibroblasts into stably expandable neural stem cells. Cell Stem Cell. 10, 473-479 (2012).
- Yang, N., et al. Generation of oligodendroglial cells by direct lineage conversion. Nat Biotechnol. 31, 434-439 (2013).
- Najm, F. J., et al. Transcription factor-mediated reprogramming of fibroblasts to expandable, myelinogenic oligodendrocyte progenitor cells. Nat Biotechnol. 31, 426-433 (2013).
