Summary

Lineage-перепрограммирование перицитов клеток, полученных из взрослых мозга человека в индуцированные нейронов

Published: May 12, 2014
doi:

Summary

Ориентация мозга резидентом клетки для прямого Lineage-перепрограммирования открывает новые перспективы для ремонта мозга. Здесь мы опишем протокол о том, как подготовить культур, обогащенных для мозга резидентом перицитами от взрослого головного мозга человека и преобразовать их в индуцированные нейронов ретровируса-опосредованной экспрессии факторов транскрипции Sox2 и Ascl1.

Abstract

Прямая линия-перепрограммирование не-нервных клеток в индуцированные нейронов (INS) может дать ответ на молекулярных механизмов, лежащих в основе нейрогенез и включить новые стратегии для моделирования в пробирке или ремонта больной мозг. Определение мозга-нерезидентные нейронные типы клеток, поддающиеся прямого преобразования в INS может позволить для запуска такой подход на месте, то есть в течение поврежденной ткани головного мозга. Здесь мы опишем протокол, разработанный в попытке идентификации клеток, полученных из взрослого человеческого мозга, что выполнить это помещение. Этот протокол включает в себя: (1) культивирование клеток человека из коры головного мозга, полученных из взрослых биопсии головного мозга человека; (2) расширение в пробирке (приблизительно требуя 2-4 недели) и характеристика культуры по иммуноцитохимии и проточной цитометрии; (3) обогащение с помощью флуоресцентной активированный сортировки клеток (FACS) с использованием анти-PDGF рецептор-β и анти-CD146 антитела;(4) ретровирус-опосредованного трансдукции с нейрогенной факторов транскрипции Sox2 и ascl1; (5) и, наконец, характеристика полученных перицитами полученных индуцированных нейронов (PdiNs) по иммуноцитохимии (14 дней до 8 недель после ретровирусную трансдукции). На данном этапе, модули могут быть проверены их электрических свойств по записи патч-зажим. Этот протокол обеспечивает высокую воспроизводимость порядок в пробирке клонов преобразования мозга резидентом перицитами на функциональные человека INS.

Introduction

В отличие от перепрограммирования соматических клеток в индуцированные плюрипотентные стволовые клетки (ИПСК), которые в свою очередь, наделенных множеством дифференциальным потенциалом, прямой перепрограммирование стремится к прямой конвертации одного конкретного типа клеток в другой. В отношении их применения в контексте моделирования болезней и потенциальных клеточной терапии, оба подхода перепрограммирования имеют свои преимущества и недостатки. Перепрограммирование в ИПСК (I) обеспечивает практически бесконечный источник клеток; (II) позволяет генной инженерии; (III) наделяет почти неограниченным потенциалом дифференцировки. Тем не менее, основные недостатки ИПСК влекут за собой риск туморогенность из недифференцированных клеток (образование тератомы в естественных условиях) и необходимости экс естественных условиях выращивания и последующей трансплантации, если эти клетки будут использоваться для клеточной терапии. С другой стороны, линия прямой-перепрограммирование ограничена нижней выход целевого клетокчто коррелирует непосредственно с количеством целевых клеток исходной популяции, но обладает тем преимуществом, что Lineage-перепрограммировать клетки-видимому, не обладают не онкогенного риска после трансплантации 1,2; Кроме того, прямое перепрограммирование даже может быть достигнуто на месте, то есть внутри органа, где эти клетки потребовалось бы, таким образом избегая необходимости трансплантации.

Имея это в виду, наша лаборатория проводит возможность клон-перепрограммирования мозга резидентом клеток в INS в качестве нового подхода к основе клеток терапии нейродегенеративных заболеваний. Мозг-резидентом клетки, которые потенциально могут быть рассмотрены как клеточных мишеней для Lineage-перепрограммирования включают различные типы макроглии (астроциты, NG2 клеток и олигодендроцитов), микроглии и микрососудов связанных клеток (эндотелиальных клеток и перицитов). Мы всесторонне изучают в пробирке перепрограммирования потенциал астроглии головного кортекс раннего послеродового мышей 3-5. В поисках же подходящих источников клеток для прямого Lineage-перепрограммирования во взрослом мозге человека, мы столкнулись с клеточной популяции, которые могут быть успешно перепрограммировать в входы и выставочных признаков перицитами. Здесь мы описываем протокол, как собрать эти клетки от взрослых биопсии головного мозга человека, расширить и обогатить эти клетки в пробирке, и, наконец, успешно перепрограммировать значительную часть этих расширенных в пробирке клеток (в диапазоне 25-30%) в дюймов Перепрограммирование может быть достигнуто путем одновременного опосредованного ретровирусом совместной экспрессии двух факторов транскрипции, Sox2 и ascl1. Эти PdiNs были найдены приобрести способность повторяющиеся потенциала действия стрельбы и служить синаптические цели для других нейронов с указанием их способность интеграции в нейронных сетях. Наш протокол обеспечивает простой процедуры для изоляции и рода превращения взрослых перицитами мозга человека в INS. </р>

Protocol

1. Изоляция и культивирование мозг взрослого человека клеток Опыты с человеческую ткань должна быть выполнена в соответствии со всеми соответствующими правительственными и институциональных правил, касающихся использования человеческого материала для исследовательс…

Representative Results

Первым результатом этого протокола после успешного создания культуры от образце человеческой взрослого коры головного мозга состоит в идентификации клеточного состава культуре. Иммуноцитохимия для специфических белков типа клеток показывает значительную степень гетерогенности м?…

Discussion

Настоящий протокол описывает расширение в пробирке и обогащение перицитами клеток, полученных следующий изоляции от взрослого головного мозга человека и последующее преобразование в INS по ретровируса-опосредованной экспрессии нейрогенной транскрипционных факторов Sox2 и Ascl1. Та?…

Disclosures

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

Мы благодарны доктору Магдалена Гетц для ее ввода в процессе разработки этого протокола. Мы благодарим доктора Marius Wernig (Стэнфордский университет) за щедрое предоставляя нам последовательности Sox2 кодирования. Мы также очень благодарны доктору Александра Lepier для производства вируса. Эта работа была поддержана грантами Deutsche Forschungsgemeinschaft (BE 4182/2-2) и BMBF (01GN1009A) до BB, и Баварским государственным министерством наук, исследований и искусства в МК и BBCs получил финансирование от двухнационального SYSTHER- INREMOS Виртуальный институт (немецкий и словенский Федеральные министерства образования и научных исследований) и DFG (SFB 824).

Materials

anti-CD140b-PE BD Biosciences 558821 use 1:100
anti-CD146-FITC AbD Serotec MCA2141FT use 1:100
anti-CD13-FITC AbD Serotec MVA1270A488T use 1:100
anti-CD34-APC BD Biosciences 560940 use 1:100
anti-PDGFRβ Cell Signaling 3169S use 1:200
anti-CD146 Abcam Ab75769 use 1:400
anti-NG2 Millipore AB5320 use 1:400
anti-SMA Sigma-Aldrich A2547 use 1:400
anti-βIII-tubulin Sigma-Aldrich T8660 use 1:400
anti-MAP2 Sigma-Aldrich M4403 use 1:200
anti-GFAP Sigma-Aldrich G3893 use 1:600
anti-GFP Aves Labs GFP 10-20 use 1:1000
anti-RFP Chromotek 5F8 use 1:500
anti-S100β Sigma-Aldrich S2532 use 1:300
anti-NeuN Millipore MAB377 use 1:200
anti-GABA Sigma-Aldrich A2052 use 1:500
anti-Calretinin Millipore AB5054 use 1:500
anti-vGluT1 SYnaptic SYstems 135511 use 1:1000
Rat IgG1 isotype control FITC AbD Serotec 11-4301-81 use 1:100
Rat IgG1 isotype control PE AbD Serotec 12-4301-81 use 1:100
Rat IgG1 isotype control APC AbD Serotec 17-4301-81 use 1:100
TrypLE Invitrogen 12605-010
DMEM, high glucose, GlutaMAX Invitrogen 61965
B27 serum-free supplement Invitrogen 17504044
fetal calf serum Invitrogen 10106-169 perform heat inactivation by incubation at 56 °C for 30 min
Penicillin-Streptomycin Invitrogen 15140122
HBSS (Hanks Balanced Salt Solution) Invitrogen 24020-091
Dulbecco's PBS without CaCl2 and MgCl2 (D-PBS, 1×; Invitrogen, cat. no. 14190) Invitrogen 14190
HEPES  Sigma-Aldrich H3375
Poly-D-lysine hydrobromide (PDL) Sigma-Aldrich P0899
PFA (paraformaldehyde) Sigma-Aldrich P1648
Bovine serum albumin Sigma-Aldrich A9418
Triton X-100 Sigma-Aldrich T9284
DAPI (4′,6-Diamidin-2-phenylindole) dilactate Sigma-Aldrich 042M4005
Aqua-Poly/Mount Polysciences 18606-20
Polypropylene round-bottom tubes  BD Biosciences 352063
Polystyrene round-bottom tubes with cell-strainer cap  BD Biosciences 352235
24-well plates Orange Scientific 5530305
75 cm2 culture flasks Greiner Bio-One 658175
25 cm2 culture flasks Greiner Bio-One 690175
Disposable pipettes 10 ml Sarstedt #########
Glass Pasteur pipettes (150 mm) Fisherbrand FB50251
Glass coverslips 12 mm diameter Menzel CB00120RA1
Surgical disposable scalpels  B. Braun 5518083
Tissue culture dishes  Greiner Bio-One 633180
Conical tubes 15ml BD Biosciences 352095
Laminar flow hood
Centrifuge and swing-out rotor with adapters for 15 ml and 50 ml tubes Hettich Lab Technology 1406
Flow cytometry cell sorter: FACSAria l with FACSDiva software  BD Biosciences
Humified cell culture incubator Eppendorf Galaxy 170R
Wather bath at 37 °C
FACSFlow sheath fluid  BD Biosciences 342003
Epifluorescence microscope BX61 Olympus
Confocal microscope LSM710 Zeiss

References

  1. Caiazzo, M., et al. Direct generation of functional dopaminergic neurons from mouse and human fibroblasts. Nature. 476, 224-227 (2011).
  2. Kim, J., et al. Functional integration of dopaminergic neurons directly converted from mouse fibroblasts. Cell stem cell. 9, 413-419 (2011).
  3. Duan, B., et al. Interactions between water deficit, ABA, and provenances in Picea asperata. Journal of experimental botany. 58, 3025-3036 (2007).
  4. Heinrich, C., et al. Directing astroglia from the cerebral cortex into subtype specific functional neurons. PLoS Biol. 8, (2010).
  5. Heinrich, C., et al. Generation of subtype-specific neurons from postnatal astroglia of the mouse cerebral cortex. Nat Protoc. 6, 214-228 (2011).
  6. Gavrilescu, L. C., Van Etten, R. A. Production of replication-defective retrovirus by transient transfection of 293T cells. J Vis Exp. , (2007).
  7. Karow, M., et al. Reprogramming of pericyte-derived cells of the adult human brain into induced neuronal cells. Cell stem cell. 11, 471-476 (2012).
  8. Ortega, F., et al. Using an adherent cell culture of the mouse subependymal zone to study the behavior of adult neural stem cells on a single-cell level. Nat Protoc. 6, 1847-1859 (2011).
  9. Ladewig, J., et al. Small molecules enable highly efficient neuronal conversion of human fibroblasts. Nat Methods. 9, 575-578 (2012).
  10. Espuny-Camacho, I., et al. Pyramidal neurons derived from human pluripotent stem cells integrate efficiently into mouse brain circuits in vivo. Neuron. 77, 440-456 (2013).
  11. Davila, J., Chanda, S., Ang, C. E., Sudhof, T. C., Wernig, M. Acute reduction in oxygen tension enhances the induction of neurons from human fibroblasts. J Neurosci Methods. 216, 104-109 (2013).
  12. Vierbuchen, T., et al. Direct conversion of fibroblasts to functional neurons by defined factors. Nature. 463, 1035-1041 (2010).
  13. Pfisterer, U., et al. Direct conversion of human fibroblasts to dopaminergic neurons. Proc Natl Acad Sci USA. 108, 10343-10348 (2011).
  14. Lu, J., et al. Generation of Integration-free and Region-Specific Neural Progenitors from Primate Fibroblasts. Cell Rep. 3, 1580-1591 (2013).
  15. Yang, N., Ng, Y. H., Pang, Z. P., Sudhof, T. C., Wernig, M. Induced neuronal cells: how to make and define a neuron. Cell Stem Cell. 9, 517-525 (2011).
  16. Pang, Z. P., et al. Induction of human neuronal cells by defined transcription factors. Nature. 476, 220-223 (2011).
  17. Yoo, A. S., et al. MicroRNA-mediated conversion of human fibroblasts to neurons. Nature. 476, 228-231 (2011).
  18. Son, E. Y., et al. Conversion of mouse and human fibroblasts into functional spinal motor neurons. Cell Stem Cell. 9, 205-218 (2011).
  19. Lujan, E., Chanda, S., Ahlenius, H., Sudhof, T. C., Wernig, M. Direct conversion of mouse fibroblasts to self-renewing, tripotent neural precursor cells. Proc Natl Acad Sci USA. 109, 2527-2532 (2012).
  20. Thier, M., et al. Direct conversion of fibroblasts into stably expandable neural stem cells. Cell Stem Cell. 10, 473-479 (2012).
  21. Yang, N., et al. Generation of oligodendroglial cells by direct lineage conversion. Nat Biotechnol. 31, 434-439 (2013).
  22. Najm, F. J., et al. Transcription factor-mediated reprogramming of fibroblasts to expandable, myelinogenic oligodendrocyte progenitor cells. Nat Biotechnol. 31, 426-433 (2013).

Play Video

Cite This Article
Karow, M., Schichor, C., Beckervordersandforth, R., Berninger, B. Lineage-reprogramming of Pericyte-derived Cells of the Adult Human Brain into Induced Neurons. J. Vis. Exp. (87), e51433, doi:10.3791/51433 (2014).

View Video