Summary

Lineage-reprogramación de células derivadas de pericitos del cerebro humano adulto en neuronas inducidas

Published: May 12, 2014
doi:

Summary

Atacar a las células cerebrales residente por linaje reprogramación directa ofrece nuevas perspectivas para la reparación del cerebro. Aquí se describe un protocolo de cómo preparar cultivos enriquecidos por pericitos cerebrales residente del adulto corteza cerebral humana y convertirlas en neuronas inducida por la expresión mediada por retrovirus de los factores de transcripción Sox2 y Ascl1.

Abstract

Linaje reprogramación directa de las células no neuronales en neuronas inducidas (INS) puede proporcionar conocimientos sobre los mecanismos moleculares que subyacen a la neurogénesis y permitir nuevas estrategias para el modelado in vitro o reparar el cerebro enfermo. La identificación de los tipos de células no neuronales del cerebro residente susceptibles de conversión directa en iNs podrían permitir el lanzamiento de un enfoque de este tipo in situ, es decir, dentro del tejido cerebral dañado. Aquí se describe un protocolo desarrollado en el intento de identificar las células derivadas de cerebro humano adulto que cumplen esta premisa. Este protocolo implica: (1) el cultivo de células humanas a partir de la corteza cerebral obtenidos a partir de biopsias de cerebro humano adulto; (2) la expansión in vitro (que requiere aproximadamente 2-4 semanas) y caracterización de la cultura por inmunocitoquímica y citometría de flujo; (3) el enriquecimiento por células activadas por fluorescencia (FACS) utilizando anticuerpos anti-receptor de PDGF-β y los anticuerpos anti-CD146;(4) la transducción mediada por retrovirus con la transcripción neurogénica factores de Sox2 y Ascl1; (5) y, finalmente, la caracterización de las neuronas resultantes derivadas de pericitos inducidas (PdiNs) por inmunocitoquímica (14 días a 8 semanas después de la transducción retroviral). En esta etapa, el INS se puede probar por sus propiedades eléctricas mediante la grabación de patch-clamp. Este protocolo proporciona un procedimiento altamente reproducible para la conversión linaje in vitro de los pericitos cerebrales residente en iNs humanos funcionales.

Introduction

A diferencia de la reprogramación de células somáticas en células madre pluripotentes inducidas (iPSCs), que a su vez están dotados de una gran cantidad de potenciales de diferenciación, la reprogramación directa tiene como objetivo para la conversión recta de un tipo específico de célula a otro. Con respecto a su aplicación en el contexto de la modelización de enfermedades y terapias basadas en células potenciales, ambos enfoques de reprogramación tienen ventajas y desventajas específicas. Reprogramación en iPSCs (i) ofrece una fuente casi infinita de células; (Ii) permite la ingeniería genética; (Iii) dota de un potencial de diferenciación casi ilimitada. Sin embargo, las principales desventajas de CMPI conllevan el riesgo de tumorigenicidad de las células no diferenciadas (la formación de teratomas in vivo) y la necesidad para el cultivo ex vivo y posterior trasplante si estas células se van a utilizar para las terapias basadas en células. Por el contrario, el linaje-reprogramación directa está limitado por el menor rendimiento de las células deseadasque se correlaciona directamente con el número de las células diana de la población de partida, sino que posee la ventaja de que las células de linaje-reprogramado parecen exhibir ningún riesgo tumorigénico en el trasplante 1,2; además, la reprogramación directa, incluso se puede lograr in situ, es decir, en el órgano donde se requerirían estas células, evitando así la necesidad de un trasplante.

Con esto en mente, nuestro laboratorio ha perseguido la posibilidad de las células cerebrales residente linaje reprogramación en iNs como un nuevo enfoque hacia las terapias basadas en las células de las enfermedades neurodegenerativas. Células cerebrales-residente que pueden ser considerados como potencialmente dianas celulares para el linaje-reprogramación comprenden diferentes tipos de macroglía (astrocitos, células NG2 y oligodendrocitos), microglia y células microvasculares asociadas (células endoteliales y los pericitos). Hemos estudiado ampliamente el potencial reprogramación in vitro de astroglia del cor cerebraltex de principios de ratones postnatales 3-5. En la búsqueda de fuentes de células de manera similar adecuadas para linaje reprogramación directa en el cerebro humano adulto, nos encontramos con una población de células que se pueden reprogramar con éxito en ins y características de exhibición de los pericitos. Aquí se describe un protocolo de cómo cosechar estas células de biopsias de cerebro humano adulto, para expandir y enriquecer estas células in vitro, y finalmente reprogramar con éxito una fracción sustancial de estas células in vitro en expandido (en el rango de 25-30%) en Ins. La reprogramación se puede lograr por mediada por retrovirus co-expresión simultánea de dos factores de transcripción, Sox2 y Ascl1. Se encontró que estas PdiNs para adquirir la capacidad de acción repetitiva potencial de fuego y para servir como dianas sinápticas de otras neuronas que indican su capacidad de integrarse en las redes neuronales. Nuestro protocolo proporciona un mecanismo sencillo para que el aislamiento y el linaje de conversión de pericitos cerebro humano adulto en Complementos. </p>

Protocol

1. Aislamiento y cultivo de células cerebro humano adulto Los experimentos con el tejido humano se deben realizar de acuerdo con todas las regulaciones gubernamentales e institucionales pertinentes en relación con la utilización de material humano para fines de investigación. El presente protocolo fue desarrollado de acuerdo con la aprobación del comité de ética de la Facultad de Medicina de la LMU Munich y el consentimiento informado por escrito de todos los pacientes. <p class="jo…

Representative Results

El primer resultado de este protocolo después de establecer con éxito una cultura de un espécimen de ser humano adulto corteza cerebral consiste en la identificación de la composición celular de la cultura. La inmunocitoquímica de proteínas específicas de tipo celular revela un grado considerable de heterogeneidad entre los cultivos derivados de muestras de diferentes pacientes (Figura 1A). Tal como se cuantifica por citometría de flujo no es siempre una fracción sustancial de las células que…

Discussion

El presente protocolo describe la expansión in vitro y el enriquecimiento de las células derivadas de pericitos después del aislamiento por parte del adulto corteza cerebral humana y la posterior conversión en iNs por la expresión mediada por retrovirus de la transcripción neurogénica factores Sox2 y Ascl1. Tal protocolo experimental proporciona un sistema in vitro para estudiar el linaje de conversión de las células cerebrales-residente en neuronas y glía, potencialmente, también, con el ob…

Disclosures

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

Estamos muy agradecidos a la Dra. Magdalena Götz por su aportación durante el desarrollo de este protocolo. Agradecemos al Dr. Marius Wernig (Universidad de Stanford) por su generoso que nos proporciona la secuencia de codificación sox2. También estamos muy agradecidos a la Dra. Alexandra Lepier para la producción de virus. Este trabajo fue apoyado por becas de la Deutsche Forschungsgemeinschaft (BE 4182/2-2) y el BMBF (01GN1009A) a BB, y el Ministerio de Ciencias del Estado de Baviera, Investigación y las Artes a MK y BBCS recibieron financiación de la SYSTHER-binacional INREMOS Instituto Virtual (Ministerios Federal alemán y esloveno de Educación e Investigación) y la DFG (SFB 824).

Materials

anti-CD140b-PE BD Biosciences 558821 use 1:100
anti-CD146-FITC AbD Serotec MCA2141FT use 1:100
anti-CD13-FITC AbD Serotec MVA1270A488T use 1:100
anti-CD34-APC BD Biosciences 560940 use 1:100
anti-PDGFRβ Cell Signaling 3169S use 1:200
anti-CD146 Abcam Ab75769 use 1:400
anti-NG2 Millipore AB5320 use 1:400
anti-SMA Sigma-Aldrich A2547 use 1:400
anti-βIII-tubulin Sigma-Aldrich T8660 use 1:400
anti-MAP2 Sigma-Aldrich M4403 use 1:200
anti-GFAP Sigma-Aldrich G3893 use 1:600
anti-GFP Aves Labs GFP 10-20 use 1:1000
anti-RFP Chromotek 5F8 use 1:500
anti-S100β Sigma-Aldrich S2532 use 1:300
anti-NeuN Millipore MAB377 use 1:200
anti-GABA Sigma-Aldrich A2052 use 1:500
anti-Calretinin Millipore AB5054 use 1:500
anti-vGluT1 SYnaptic SYstems 135511 use 1:1000
Rat IgG1 isotype control FITC AbD Serotec 11-4301-81 use 1:100
Rat IgG1 isotype control PE AbD Serotec 12-4301-81 use 1:100
Rat IgG1 isotype control APC AbD Serotec 17-4301-81 use 1:100
TrypLE Invitrogen 12605-010
DMEM, high glucose, GlutaMAX Invitrogen 61965
B27 serum-free supplement Invitrogen 17504044
fetal calf serum Invitrogen 10106-169 perform heat inactivation by incubation at 56 °C for 30 min
Penicillin-Streptomycin Invitrogen 15140122
HBSS (Hanks Balanced Salt Solution) Invitrogen 24020-091
Dulbecco's PBS without CaCl2 and MgCl2 (D-PBS, 1×; Invitrogen, cat. no. 14190) Invitrogen 14190
HEPES  Sigma-Aldrich H3375
Poly-D-lysine hydrobromide (PDL) Sigma-Aldrich P0899
PFA (paraformaldehyde) Sigma-Aldrich P1648
Bovine serum albumin Sigma-Aldrich A9418
Triton X-100 Sigma-Aldrich T9284
DAPI (4′,6-Diamidin-2-phenylindole) dilactate Sigma-Aldrich 042M4005
Aqua-Poly/Mount Polysciences 18606-20
Polypropylene round-bottom tubes  BD Biosciences 352063
Polystyrene round-bottom tubes with cell-strainer cap  BD Biosciences 352235
24-well plates Orange Scientific 5530305
75 cm2 culture flasks Greiner Bio-One 658175
25 cm2 culture flasks Greiner Bio-One 690175
Disposable pipettes 10 ml Sarstedt #########
Glass Pasteur pipettes (150 mm) Fisherbrand FB50251
Glass coverslips 12 mm diameter Menzel CB00120RA1
Surgical disposable scalpels  B. Braun 5518083
Tissue culture dishes  Greiner Bio-One 633180
Conical tubes 15ml BD Biosciences 352095
Laminar flow hood
Centrifuge and swing-out rotor with adapters for 15 ml and 50 ml tubes Hettich Lab Technology 1406
Flow cytometry cell sorter: FACSAria l with FACSDiva software  BD Biosciences
Humified cell culture incubator Eppendorf Galaxy 170R
Wather bath at 37 °C
FACSFlow sheath fluid  BD Biosciences 342003
Epifluorescence microscope BX61 Olympus
Confocal microscope LSM710 Zeiss

References

  1. Caiazzo, M., et al. Direct generation of functional dopaminergic neurons from mouse and human fibroblasts. Nature. 476, 224-227 (2011).
  2. Kim, J., et al. Functional integration of dopaminergic neurons directly converted from mouse fibroblasts. Cell stem cell. 9, 413-419 (2011).
  3. Duan, B., et al. Interactions between water deficit, ABA, and provenances in Picea asperata. Journal of experimental botany. 58, 3025-3036 (2007).
  4. Heinrich, C., et al. Directing astroglia from the cerebral cortex into subtype specific functional neurons. PLoS Biol. 8, (2010).
  5. Heinrich, C., et al. Generation of subtype-specific neurons from postnatal astroglia of the mouse cerebral cortex. Nat Protoc. 6, 214-228 (2011).
  6. Gavrilescu, L. C., Van Etten, R. A. Production of replication-defective retrovirus by transient transfection of 293T cells. J Vis Exp. , (2007).
  7. Karow, M., et al. Reprogramming of pericyte-derived cells of the adult human brain into induced neuronal cells. Cell stem cell. 11, 471-476 (2012).
  8. Ortega, F., et al. Using an adherent cell culture of the mouse subependymal zone to study the behavior of adult neural stem cells on a single-cell level. Nat Protoc. 6, 1847-1859 (2011).
  9. Ladewig, J., et al. Small molecules enable highly efficient neuronal conversion of human fibroblasts. Nat Methods. 9, 575-578 (2012).
  10. Espuny-Camacho, I., et al. Pyramidal neurons derived from human pluripotent stem cells integrate efficiently into mouse brain circuits in vivo. Neuron. 77, 440-456 (2013).
  11. Davila, J., Chanda, S., Ang, C. E., Sudhof, T. C., Wernig, M. Acute reduction in oxygen tension enhances the induction of neurons from human fibroblasts. J Neurosci Methods. 216, 104-109 (2013).
  12. Vierbuchen, T., et al. Direct conversion of fibroblasts to functional neurons by defined factors. Nature. 463, 1035-1041 (2010).
  13. Pfisterer, U., et al. Direct conversion of human fibroblasts to dopaminergic neurons. Proc Natl Acad Sci USA. 108, 10343-10348 (2011).
  14. Lu, J., et al. Generation of Integration-free and Region-Specific Neural Progenitors from Primate Fibroblasts. Cell Rep. 3, 1580-1591 (2013).
  15. Yang, N., Ng, Y. H., Pang, Z. P., Sudhof, T. C., Wernig, M. Induced neuronal cells: how to make and define a neuron. Cell Stem Cell. 9, 517-525 (2011).
  16. Pang, Z. P., et al. Induction of human neuronal cells by defined transcription factors. Nature. 476, 220-223 (2011).
  17. Yoo, A. S., et al. MicroRNA-mediated conversion of human fibroblasts to neurons. Nature. 476, 228-231 (2011).
  18. Son, E. Y., et al. Conversion of mouse and human fibroblasts into functional spinal motor neurons. Cell Stem Cell. 9, 205-218 (2011).
  19. Lujan, E., Chanda, S., Ahlenius, H., Sudhof, T. C., Wernig, M. Direct conversion of mouse fibroblasts to self-renewing, tripotent neural precursor cells. Proc Natl Acad Sci USA. 109, 2527-2532 (2012).
  20. Thier, M., et al. Direct conversion of fibroblasts into stably expandable neural stem cells. Cell Stem Cell. 10, 473-479 (2012).
  21. Yang, N., et al. Generation of oligodendroglial cells by direct lineage conversion. Nat Biotechnol. 31, 434-439 (2013).
  22. Najm, F. J., et al. Transcription factor-mediated reprogramming of fibroblasts to expandable, myelinogenic oligodendrocyte progenitor cells. Nat Biotechnol. 31, 426-433 (2013).

Play Video

Cite This Article
Karow, M., Schichor, C., Beckervordersandforth, R., Berninger, B. Lineage-reprogramming of Pericyte-derived Cells of the Adult Human Brain into Induced Neurons. J. Vis. Exp. (87), e51433, doi:10.3791/51433 (2014).

View Video