Summary
我々は、急性肺損傷をモデル化するために、噴霧によりエアロゾル化したリポ多糖にチャレンジすることにより好中球の肺の炎症を誘導するための方法を記載している。また、肺の分離、気管挿管および気管支肺胞洗浄のための基本的な外科技術も記載されている。
Abstract
急性肺損傷（ALI）限られた治療選択肢と高い死亡率と、肺胞好中球増加によって特徴付け重篤な疾患である。 ALIの実験モデルは、疾患の病因の我々の理解を高める上で鍵となります。グラム陽性細菌由来のリポ多糖（LPS）は、マウスの気道および肺実質における好中球性炎症を誘導する。 LPSのような化合物の効率的な肺送達は、しかし、達成することは困難である。ここに記載されたアプローチでは、マウスでの肺送達は、エアロゾル化された緑膿菌 LPSをチャレンジすることによって達成される。溶存LPSは、圧縮空気に接続ネブライザーによりエアロゾル化した。マウスは、エアロゾルを中止した後、2分間コンディショニングした後、10分間のプレキシグラスボックス内LPSエアロゾルの連続流に暴露した。気管挿管し、滅菌Pの特性評価を可能にし、ホルマリン灌流に続いて、その後の気管支肺胞、次の行われた、ulmonary炎症。エアロゾル化LPSは、気管支肺胞洗浄および組織学的評価によって検出された歯槽好中球増加によって特徴づけられる肺の炎症を、生成されます。この手法は、少数の家電の小さなコストで設置し、最小限のトレーニングと専門知識を必要とすることができます。露光システムは、このように日常的に肺の病理学の理解を向上させる可能性のある、任意の実験室で行うことができる。
Introduction
リポ多糖（LPS）は、グラム陰性菌1の細胞壁成分である。 LPSへの挑戦は、急性肺障害、急性好中球性炎症と浮腫2を特徴とする症候群のよく文書モデルです。また、肺好中球増加はまた、COPD増悪4をモデル化するために使用されている慢性閉塞性肺疾患（COPD）3、およびヒトにおけるLPSチャレンジの特徴である。このように、LPS曝露の実験モデルは、臨床的にヒト病理を理解するための関連、貴重なツールです。
ここで説明するエアロゾル化LPSの肺送達の目的は、全身性の関与なしに、導電性、呼吸気道における好中球の炎症性応答を生成することである。 LPSチャレンジのいくつかの技術が、以前に記載されている。 LPSの静脈内注射は、投与の最も一般的に使用される経路である。この技術は、tは容易にアクセス可能であるが彼の主な損傷は、肺への好中球の移行以下の肺上皮の二次破壊に、内皮にある。静脈内投与は、動物モデルにおいて臨床像を複雑にする全身性炎症2を誘導する。全身性炎症は、気管内投与では観察されないとは対照的である。しかしながら、この技術は、労働集約的であり、麻酔剤、ならびにかなりの訓練5,6を必要とする。さらに、この投与経路による肺沈着は、呼吸7に依存している。したがって、肺沈着は、気道内、気管内投与、変数析出が観察され得るために必要な麻酔の深さに影響される。対照的に、エアロゾル化したLPSによる肺送達は、最小限の訓練を必要とし、容易に個人5,8の間にほとんど又は全く変動が多数の動物で行うことができる。最近の研究では、エアロゾル送達が堆積に関して気管内経路よりも優れていること、及びLPSのより適切な用量は、このモデル8と好中球性炎症を誘導することを確認する。
これまでの研究では、エアロゾル化した緑膿菌 LPSへの挑戦は、肺胞腔9、10を含む気道内腔および肺実質の著しい炎症反応を生成し、実証した。炎症は、好中球および肺水腫の存在が優位を特徴とし、従って、急性肺損傷の病因に対処し、疾患の病理学に寄与するメカニズムのさらなる知識を得るために使用することができる。
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
動物研究は、北ストックホルム動物福祉倫理委員会によって承認された。実験手順は、スウェーデンの法律に準拠して行った。
1. LPSエアロゾルの生成
- P.精製を0.5g溶解穏やかに撹拌しながら50ミリリットル滅菌生理食塩水中の緑膿菌 LPS及び溶解を確認します。 1mg / mlの最終濃度に9 mlの滅菌生理食塩水にLPSを溶解した1 mlで希釈する。 -20℃でアルミ箔とストアとの光から保護します。
- 室温で暗所に可溶化されたLPSを解凍し、使用直前によく混ぜる。
- 換気されたレベルIIバイオハザードフード中で、噴霧器に赤の入口を挿入し、メーカーが提供するチューブ（ 図1の実験装置を提示するレビュースキーム）を介して加圧された室内空気に噴霧器を接続してください。
注意：適切な個人保護具を、半分の顔ピース再利用可能なrespirat含むまたは粒子フィルタ、ゴーグル、手袋、防護服との暴露の過程で使用されるべきである。
図1：エアロゾルを生成するために用いた実験装置の概略プレゼンテーション噴霧器の入口は、空気供給源に接続されている。噴霧器の出口は、第15.9ミリメートル管及びエアフィルタ、及び空気供給を介して流量計に接続された2キロバールの圧力で5.0 L /メートルに調整する。出口は、圧力上昇を防止するために取り外し可能な蓋と、5mmの穴を取り付けプレキシガラス箱に接続次ある。
- エアフィルタを介して質量流量計に噴霧器の出口に接続します。電源に質量流量計を接続します。
- 1.0-2.0バーで残りの圧力で、5 L / minに空気の供給を調整します。
- 質量流量計を取り外し、空気供給を切断します。
- 150×163 X 205ミリメートル、取り外し可能な蓋を装備：分岐すると寸法を持つ2つのプレキシガラスのボックスに接続する15.9ミリメートルのチューブに噴霧器の出口に接続します。各ボックスは、圧力上昇を防止するために、入口に対向する側に5mmの穴を有するべきである。
- 各プレキシグラスボックス内の5匹のマウスにまで入れて、蓋を閉じます。
- 噴霧器を開き、滅菌生理食塩水または単独の車両に溶解し、少なくとも4ミリリットルのLPSでの挿入を埋める（滅菌生理食塩水;ボリュームは、8ミリリットルを超えないようにしてください）。空気供給への入口を再接続します。
- エアゾールを10分間閉鎖さプレキシグラスの箱に流入することを許可する。継続的に動物を監視します。空気供給が噴霧器の入口にしっかりと保護されたままにしてください。
- 空気供給を外します。蓋を閉じた状態で、動物は2分間プレキシグラスの箱に残ってみましょう。
- 蓋を開き、エアロゾルが分散することを可能にし、tに動物を返す彼のケージ。動物は湿っ表示された場合は、低体温症を防ぐために、弱火に設定された加熱パッドの上にケージを置く。
- 最初の30分間連続して動物を監視し、その後、最初の6時間ごとに2時間。動物は、噴霧手順の間および後に正常呼吸パターンおよび活性を示すべきである。
2.気管支肺胞洗浄（BAL）
- 実験の終了時点で、深くあなたの機関の獣医スタッフによって推奨されているように達成するためにイソフルランで動物を麻酔。大手術を行うために、麻酔の十分な深さを確保するために引っ込め反射を確認するために後肢をピンチ。 70％エタノールを用いた動物の毛皮ダウンスプレー。
- はさみを使用して腹部を開き、動物を放血する大動脈を切断。血液を吸収するために腹部の上に組織片を置きます。
- 安楽死をFollwingにハサミのシングル前後カットを使用胸部を公開。胸骨の前方先端で胸郭を持ち上げ、すべての肺葉に切断することなく、ほとんどの腹側時点でダイヤフラムを穿刺するはさみを使用しています。前後方向（顎下の会合）で2カットを行うことで胸郭を開きます。
- 静かに鉗子を用いて胸郭を引き離す、および喉頭下に気管をカット。
- 鉗子で気管を持ち上げ、胸腔へのローブを接続する靭帯を切断し、そして優しく脂肪と心臓組織によって引っ張って肺を取り除く。
- 気管に及び絹糸の文字列を使用してチューブを固定し;：ポリエチレンチューブ（0.965ミリメートル、外径0.58ミリメートル内径）を挿入します。
- 絹糸で（右肺の4のローブ）マルチローブをオフに接続します。
- ポリエチレンチューブに23ゲージの針を挿入し、ゆっくりと1ミリリットルの注射器を持つ単一の葉に氷冷滅菌PBS250μlのを注入する。
- 慎重に肺をタップする30回と注射器を介して液体を集める。 200μlのPBS（約300μlのPBSを450μlの総注入量から単一の葉から回収する必要があります）を使用して手順を繰り返します。
- 氷上で気管支肺胞洗浄液（BALF）を保持、またはすぐにBAL細胞を列挙。細胞11を染色するトルコ溶液を使用して、heamocytometerで細胞を数える。染色溶液の希釈係数とheamocytometerカウントフィールド内の体積で細胞数を乗じることによって総細胞数を計算する。
- 他の場所で11説明したように細胞遠心細胞から差動細胞数を準備します。
組織学的評価のための肺組織の3ホルマリン固定
- マルチローブを削除し、スナップ凍結をドライアイス上。 -80℃で保管してください。
- 金属支持スタンドに取り除かジャーで60ミリリットル注射器を取り付けます。 10％ホルマリンで注射器を充填一定圧力の20センチメートルを表す実験台上20cmの高さは、。
- ホルマリンの流れを制御するバルブでプラスチックチューブを経由して60ミリリットル注射器に気管に固定さ23ゲージの針を接続します。
- 5分間ホルマリンで肺葉を吹き込み。針を外し、気管を閉じて、肺の中の圧力を保持するために絹糸に引きながら気管からポリエチレンチューブと一緒にそれを削除します。
- ホルマリンで肺葉水没し、4℃で24時間固定します。
- 70％エタノールで少なくとも20分間固定した組織を3回洗浄し、そして以下のレジメン（1時間毎）を介してキシレンに脱水する。
- 3倍の70％エタノール
- 3倍の95％エタノール
- 3倍の100％エタノール
- 3Xキシレン
- 1×（液体）パラフィン
- 埋め込み脱水4-5ミクロン切片に切断し、パラフィン組織、および組織学的評価を可能にするためにヘマトキシリンおよびエオシンで染色する。
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
エアロゾル化P.への挑戦緑膿菌 LPSは、通常、両方の初期および後期の時点で好中球の優位性によって特徴づけられる気道内腔および肺胞腔における顕著な炎症反応を、得られます。
エアロゾル化LPSは、肺好中球増加を誘発する
C57BL / 6byとBALB / cマウスを、エアロゾル化P.に曝露した緑膿菌 LPS単独車両と好中球がBALF中で数えた。 C57BL車両で生成されたエアロゾルに露出/ 6byマウスのBALFにおける総細胞数は、典型的には約200,000細胞未満であり、細胞が少数のリンパ球（0.5〜5％）で、95から100パーセントの単核細胞から構成され、かつBALF中の好中球ないなかった（ 図2A-C）。マウスは、6時間後に>一般的に、エアロゾル化LPSの展示BALF中の増大した総細胞数を500,000細胞に挑戦。細胞浸潤は、24時間後に高いままである。 BALF中の細胞のプロファイルは、APの方にシフトしているLPS曝露（ 図2BおよびC）は、次の好中球（80から95%）のredominance。
図2：1mg / mlのLPSエアロゾル化 C57BL / 6byマウスでチャレンジC57BL / 6byマウスにおける肺好中球増加を 1mgに暴露された/ mlのP.をエアロゾル化緑膿菌 LPSまたは単独の10分間の車両（生理食塩水、白バー）。気管支肺胞洗浄（BAL）は、6時間または24時間後に実施した白血球はBAL液（BALF）中で計数した。（A）総細胞数（TCN）、（B）、好中球、および（C）単核細胞（MNC）でBALF。有意差は未対応のあるt検定を用いて分析した。 nは3~4、*はp <0.05、**は、p <0.01を示すことを示します。
BALFにおける炎症細胞において同程度の増加はLPSチャレンジしたBALB / cマウスにおいて観察される（ 図3A 図3B及びC）において同等である。
図3：1mg / mlのエアロゾル化LPSで攻撃したBALB / cマウスにおける肺好中球増加は、BALB / cマウスを1mgに暴露された/ mlのP.をエアロゾル化緑膿菌 LPSまたは単独の10分間の車両（生理食塩水、白バー）。気管支肺胞洗浄（BAL）は、6時間または24時間後に実施した白血球はBAL液（BALF）中で計数した。（A）総細胞数（TCN）、（B）、好中球、および（C）単核細胞（MNC）でBALF。有意差は未対応のあるt検定を用いて分析した。 n = 3で、**はp <0.01、***はP <0.001を示すことを示します。
類似の炎症性細胞のプロファイルAN以前に報告されているように12,13 dは、肺好中球増加は、5 mg / mlのLPS（ 図4A-C）の噴霧に及びLPSの鼻腔内送達によって観察される。
図4：5 mg / mlのエアロゾル化LPSで攻撃したBALB / cマウスにおける肺好中球増加は、BALB / cマウスは、5mgに暴露された/ mlのP.をエアロゾル化緑膿菌 LPSまたは単独の10分間の車両（生理食塩水、白バー）。気管支肺胞洗浄（BAL）は、24時間後に実施し、白血球がBAL液（BALF）中で計数した。BALF中の（A）総細胞数（TCN）、（B）、好中球、および（C）単核細胞（MNC）。有意差は未対応のあるt検定を用いて分析した。 n = 3で、***はp <0.001を示す。
LPSチャレンジ中の好中球の肺ローカライゼーション
「ontent>好中球は、LPSチャレンジしたマウス（ 図5）の誘導気道および血管周囲のスペースだけでなく、上皮粘膜下組織で観察される。分散された好中球はまた、実質及び肺胞領域で検出される。
図5：肺、LPSチャレンジしたマウスにおける好中球の局在ヘマトキシリンおよびビヒクル単独または（B）に曝露し（A）C57BL / 6byマウスからのホルマリン固定した肺組織のエオシン染色、1mg / mlのエアロゾル化されたLPSは、6時間後に屠殺し、または（C）24時間。矢印は、好中球を示している。バーは200μmでを示している。 この図の拡大版をご覧になるにはこちらをクリックしてください。
ConcentrBALF中の好中球化学誘引物質のATION
LPSチャレンジしたマウスのBALFにおける総タンパク質含量は、生理食塩水（ 図6）に曝露されたマウスと比較して増加する。また、好中球化学誘引物質ケモカイン（CXCモチーフ）リガンド（CXCL）1及びCXCL2の発現は、LPSチャレンジしたマウス10（ 図7AおよびB）において増加する。
図6：LPSチャレンジC57BL / 6byマウスの気管支肺胞洗浄液（BALF）中の増加総タンパク質濃度マウスのBALFにおける総タンパク質含量1 mg / mlのエアロゾル化LPSをチャレンジまたはビヒクルに暴露し（生理食塩水、白色バー）のみた。分光光度分析により測定した。有意差は未対応のあるt検定を用いて分析した。 N = 3-4、** P <0.01を示している。
図7：Iは、LPSチャレンジしたマウスの気管支肺胞洗浄液（BALF）中CXCL1及びCXCL2の発現をncreased（A）CXCL1およびマウスのBALFにおける（B）CXCL2 1 mg / mlのエアロゾル化LPSをチャレンジまたは車両にさらさの発現。一人で、ELISAによって定量化（生理食塩水、白バー）。有意差は未対応のあるt検定を用いて分析した。 n = 3である。
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
エアロゾル化LPSは、上皮粘膜下組織中の好中球、誘導気道のほか、肺胞腔を囲むスペースで特徴付けられる気道における炎症反応を、生成されます。これは、一緒に血漿漏出、急性肺障害の病理学の代表を示すBALFにおける増加し、総タンパク質含有量、である。 LPSは、無菌性炎症を誘導するように、反応は、適応免疫応答とは無関係であり、細菌感染との関連性には限界がある。技術は、しかしながら、適応免疫応答を排除することにより、炎症性のメカニズムを分析するために使用することができる。
方法論は単純で、簡単に別の科学的な質問に答えるように適応するが、噴霧器とチューブの選択が重要です。 LPSそして得られた好中球増加の堆積は、入口、ネブライザーと、ここで説明されているもの以外のチューブを検証する必要があります。また、あまり一般的ではマウスSTとして雨は、LPSの最適な用量はそれぞれの株のために決定されるべきで、LPSに対する異なる応答を表示することがあります。他人12,13によって観察されるようさらに、エアロゾル化LPSで生成された好中球性炎症は、LPSの鼻腔内送達によって誘発される炎症に匹敵する。鼻腔内投与を容易に行っているが、方法論は、麻酔を必要とし、鼻腔無菌でなく、技術は、車両の大容量を必要とする潜在的に、肺に、鼻腔の微生物叢を導入する可能性がある。
急性肺損傷に関連することに加えて、この技術は、さらにエアロゾル化LPSとの複数のチャレンジを含むように開発されてもよい。方法論は、このように一緒に再発細菌感染または永久的な微生物のコロニー形成と、好中球増加14を永続化に関連しているCOPDの慢性炎症、中の病原性のメカニズムを研究するために使用され得る
エアロゾル化LPSによるチャレンジは、いくつかの機器の小さなコストで設定し、最小限のトレーニングを必要とすることができます。さらに、技術は、このように日常的に個人間のほとんど、あるいは全く変化して、すべての研究室で大規模に実施し、肺送達の他のルートにこのように優れていることができます。
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
アブラハムルースはベーリンガーインゲルハイム、アストラゼネカのR＆DとアストラゼネカのR＆Dからの研究助成金からの移動補助金から講師料を受け取った。マグナスノールは、アストラゼネカのR＆Dのフルタイムの従業員で、アストラゼネカ、R＆Dからの研究助成金を受けている。ヨハン·グリューネとトーベベルクは、アストラゼネカのR＆Dが出資関係のない研究プロジェクトの共同研究者である。
Acknowledgments
私たちは、カースティン·ティム（アストラゼネカ、ルンド、スウェーデン）、ベニータダールバーグ博士アンダースエクランド（カロリンスカ研究所、ストックホルム、スウェーデン）だけでなく、熟練した援助のためのドクターマーチンシュテンプフリ（マクマスター大学、ハミルトン、ON、Canada）を感謝したいと思いますと専門家の助言。
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Purified Pseudomonas aeruginosa LPS | Sigma-Aldrich | Harmful. Recomended purification. LPS purified from other bactria may be used. | |
| Pari LC sprint star nebulizer | PARI Respiratory Equipment Inc. | 023G1250 | |
| TSI mass flowmeter 4040 | TSI | 4040 | Alternative product from supplier may be used. |
| Saint-Gobain 15.9 mm Tygon tube | Sigma-Aldrich | Z685704 | Recomended brand. |
| Plexiglas boxes with removable lids | Custom built | N/A | 150 x 163 x 205 mm (a 2 mm hole on the side). |
| 3M Half Facepiece Reusable Respirator | 3M | 7503 | Recomended brand. |
| 3M Advanced Particulate Filters (P100) | 3M | 2291 | Recomended brand. |
| Scissors | VWR | 233-1104 | Preferred scissors may be used. |
| Forceps | VWR | 232-1313 | Preferred forceps may be used. |
| Intramedic PE50 polyethylene tube | BD | 427411 | Recomended brand. |
| Ethicon 2-0 Perma-hand silk tread | VWR | 95056-992 | Recomended brand. |
| 26 ½ gage needle | Alternative suppliers exist. | ||
| 1 ml BD slip-tip syringe, non-sterile |  BD |
301205 | Alternative suppliers exist. |
| 60 ml BD Luer-Lok syringe, non-sterile, polypropolene | BD | 301035 | Alternative suppliers exist. |
| Fluka Hematoxylin-Eosin | Sigma-Aldrich | 3972 | Alternative suppliers exist. |
| Türk's solution | Merck Millipore | 109277 | |
| Table top centrifuge | Alternative manufacturers exist. | ||
| Cytospin 4 cytocentrifuge | Thermo Scientific | A78300003 | Alternative centrifuge can be used. |
| HEMA-3 stat pack | Fisher Scientific | 23-123-869 | Alternative staining kits exists. |
| Formalin solution, neutral buffered, 10% | Sigma-Aldrich | HT501128 | Alternative suppliers exist. |
References
- King, J. D., Kocincova, D., Westman, E. L., Lam, J. S. Review: Lipopolysaccharide biosynthesis in Pseudomonas aeruginosa. Innate Immun. 15, 261-312 (2009).
- Grommes, J., Soehnlein, O. Contribution of neutrophils to acute lung injury. Mol Med. 17, 293-307 (2011).
- Pesci, A., et al. Inflammatory cells and mediators in bronchial lavage of patients with chronic obstructive pulmonary disease. Eur Respir J. 12, 380-386 (1998).
- Hoogerwerf, J. J., et al. Lung Inflammation Induced by Lipoteichoic Acid or Lipopolysaccharide in Humans. Am. J. Respir. Crit. Care Med. 178, 34-41 (2008).
- Scheuchenzuber, W. J., Eskew, M. L., Zarkower, A. Comparative humoral responses to Escherichia coli and sheep red blood cell antigens introduced via the respiratory tract. Exp Lung Res. 13, 97-112 (1987).
- Asti, C., et al. Lipopolysaccharide-induced lung injury in mice. I. Concomitant evaluation of inflammatory cells and haemorrhagic lung damage. Pulm Pharmacol Ther. 13, 61-69 (2000).
- Brand, P., et al. Total deposition of therapeutic particles during spontaneous and controlled inhalations. Journal of pharmaceutical sciences. 89, 724-731 (2000).
- Liu, F., Li, W., Pauluhn, J., Trubel, H., Wang, C. Lipopolysaccharide-induced acute lung injury in rats: comparative assessment of intratracheal instillation and aerosol inhalation. Toxicology. 304, 158-166 (2013).
- Skerrett, S. J., et al. Role of the type 1 TNF receptor in lung inflammation after inhalation of endotoxin or Pseudomonas aeruginosa. American Journal of Physiology - Lung Cellular and Molecular Physiology. 276, L715-L727 (1999).
- Roos, A. B., et al. Lung epithelial-C/EBPbeta contributes to LPS-induced inflammation and its suppression by formoterol. Biochem Biophys Res Commun. 423, 134-139 (2012).
- Didon, L., et al. Lung epithelial CCAAT/enhancer-binding protein-beta is necessary for the integrity of inflammatory responses to cigarette smoke. Am J Respir Crit Care Med. 184, 233-242 (2011).
- Silverpil, E., et al. Negative feedback on IL-23 exerted by IL-17A during pulmonary inflammation. Innate Immunity. 19, 479-492 (2013).
- Mercer, P. F., et al. Proteinase-Activated Receptor-1, CCL2 and CCL7 Regulate Acute Neutrophilic Lung Inflammation. American Journal of Respiratory Cell and Molecular Biology. , (2013).
- Korkmaz, B., Horwitz, M. S., Jenne, D. E., Gauthier, F. Neutrophil Elastase, Proteinase 3, and Cathepsin G as Therapeutic Targets in Human Diseases. Pharmacological Reviews. 62, 726-759 (2010).
- Bafadhel, M., et al. Acute Exacerbations of COPD: Identification of Biological Clusters and Their Biomarkers. Am. J. Respir. Crit. Care Med. , 201104-200597 (2011).
- Hurst, J. R., Perera, W. R., Wilkinson, T. M. A., Donaldson, G. C., Donaldson, G. C., Wedzicha, G. C. Systemic and Upper and Lower Airway Inflammation at Exacerbation of Chronic Obstructive Pulmonary. Am. J. Respir. Crit. Care Med. 173, 71-78 (2006).
- Rabe, K. F., et al. Global Strategy for the Diagnosis, Management, and Prevention of Chronic Obstructive Pulmonary Disease: GOLD Executive Summary. Am. J. Respir. Crit. Care Med. 176, 532-555 (2007).
