Summary
हम गंभीर फेफड़ों की चोट मॉडल के लिए, nebulization के द्वारा aerosolized lipopolysaccharide के लिए चुनौती से neutrophilic फेफड़े की सूजन उत्प्रेरण के लिए एक विधि का वर्णन। इसके अलावा, फेफड़ों के अलगाव, सांस की नली इंटुबैषेण और ब्रोन्कोएल्वियोलर पानी से धोना लिए बुनियादी शल्य चिकित्सा तकनीक भी वर्णित हैं।
Abstract
गंभीर फेफड़ों की चोट (अली) सीमित उपचार के विकल्प और उच्च मृत्यु दर के साथ वायुकोशीय neutrophilia द्वारा विशेषता एक गंभीर बीमारी है। अली की प्रयोगात्मक मॉडल रोग रोगजनन के बारे में हमारी समझ को बढ़ाने में महत्वपूर्ण हैं। ग्राम सकारात्मक बैक्टीरिया से निकाली गई lipopolysaccharide (LPS) neutrophilic वायुमार्ग में सूजन और चूहों के फेफड़ों पैरेन्काइमा लाती है। ऐसे LPS के रूप में यौगिकों के कुशल फेफड़े के वितरण, हालांकि, प्राप्त करने के लिए मुश्किल है। यहाँ वर्णित दृष्टिकोण में, चूहों में फेफड़े के वितरण aerosolized Pseudomonas aeruginosa LPS के लिए चुनौती से हासिल की है। भंग LPS के संपीड़ित हवा से जुड़ा एक छिटकानेवाला द्वारा aerosolized गया था। चूहे एयरोसोल बंद किया गया था के बाद 2 मिनट कंडीशनिंग, जिसके बाद 10 मिनट के लिए एक Plexiglas बॉक्स में LPS एयरोसोल की एक सतत प्रवाह से अवगत कराया गया। Formalin छिड़काव द्वारा पीछा सांस की नली इंटुबैषेण और बाद ब्रोन्कोएल्वियोलर पानी से धोना, अगले बाँझ पी के लक्षण वर्णन के लिए अनुमति देता है, जो प्रदर्शन किया थाulmonary सूजन। Aerosolized LPS ब्रोन्कोएल्वियोलर पानी से धोना में और histological आकलन से पता लगाया वायुकोशीय neutrophilia द्वारा विशेषता फेफड़े की सूजन, उत्पन्न करता है। इस तकनीक को कुछ उपकरणों के साथ एक छोटी सी कीमत पर स्थापित है, और न्यूनतम प्रशिक्षण और विशेषज्ञता की आवश्यकता हो सकती है। जोखिम प्रणाली इस प्रकार नियमित रूप से फेफड़ों विकृति के बारे में हमारी समझ को बढ़ाने की क्षमता के साथ, किसी भी प्रयोगशाला में प्रदर्शन किया जा सकता है।
Introduction
Lipopolysaccharide (LPS) ग्राम नकारात्मक बैक्टीरिया 1 के एक कोशिका दीवार घटक है। LPS के लिए चैलेंज गंभीर फेफड़ों की चोट, तीव्र neutrophilic सूजन और शोफ 2 द्वारा विशेषता सिंड्रोम की एक अच्छी तरह से प्रलेखित मॉडल है। इसके अलावा, फेफड़े neutrophilia भी सीओपीडी exacerbations 4 मॉडल के लिए इस्तेमाल किया गया है क्रोनिक ऑब्सट्रक्टिव पल्मोनरी डिजीज (सीओपीडी) 3, और मानव में LPS चुनौती की एक बानगी है। इस प्रकार, LPS के लोगों तक पहुंचाने की प्रयोगात्मक मॉडल चिकित्सकीय मानव विकृति को समझने के लिए प्रासंगिक और मूल्यवान उपकरण हैं।
यहाँ वर्णित aerosolized LPS के फेफड़े के वितरण का उद्देश्य प्रणालीगत भागीदारी के बिना आयोजन और श्वसन वायुमार्ग में एक neutrophilic भड़काऊ प्रतिक्रिया उत्पन्न करने के लिए है। LPS चुनौती से निपटने के कई तकनीकों पहले से वर्णित किया गया है। LPS का इंट्रा-शिरापरक इंजेक्शन प्रशासन का सबसे अधिक इस्तेमाल किया मार्ग है। इस तकनीक को आसानी से पहुँचा जा सकता है हालांकि, टीवह प्राथमिक क्षति फेफड़ों को न्युट्रोफिल प्रवास निम्नलिखित फेफड़े उपकला के माध्यमिक विनाश के साथ, अन्तःचूचुक करने के लिए है। इंट्रा-शिरापरक प्रशासन भी पशु मॉडल में नैदानिक तस्वीर को मुश्किल हो सकती है, जो प्रणालीगत सूजन 2, लाती है। प्रणालीगत सूजन इंट्रा-सांस की नली प्रशासन के साथ नहीं मनाया विपरीत है। इस तकनीक, हालांकि, श्रम गहन है और एनेस्थेटिक्स के साथ-साथ काफी प्रशिक्षण 5, 6 की आवश्यकता है। इसके अलावा, प्रशासन का इस मार्ग से फेफड़े के बयान साँस लेने में सात पर निर्भर है। इस प्रकार, फेफड़े के बयान एयरवेज में इंट्रा सांस की नली प्रशासन और चर बयान देखा जा सकता है के लिए आवश्यक संज्ञाहरण की गहराई से प्रभावित है। इसके विपरीत, aerosolized LPS के साथ फेफड़े के वितरण न्यूनतम प्रशिक्षण की आवश्यकता होती है, और आसानी से थोड़ा के साथ जानवरों की एक बड़ी संख्या या व्यक्तियों 5, 8 के बीच कोई भिन्नता पर पूरा किया जा सकता है।एक ताजा अध्ययन में एयरोसोल वितरण बयान के संबंध में इंट्रा-सांस की नली मार्ग से बेहतर है कि, और LPS के अधिक प्रासंगिक खुराक इस मॉडल 8 के साथ neutrophilic सूजन प्रेरित कि पुष्टि करता है।
Aerosolized Psuedomonas aeruginosa LPS वायुकोशीय रिक्त स्थान 9, 10 सहित airway के लुमेन और फेफड़ों पैरेन्काइमा, में एक उल्लेखनीय भड़काऊ प्रतिक्रिया उत्पन्न करने के लिए पिछले अध्ययनों कि चुनौती का प्रदर्शन किया है। सूजन न्यूट्रोफिल और फेफड़े के edema की मौजूदगी की एक विशेषता की विशेषता है, और इस तरह गंभीर फेफड़ों की चोट के रोगजनन संबोधित करने और रोग विकृति विज्ञान के लिए योगदान दे तंत्र के आगे ज्ञान हासिल करने के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है।
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
जानवरों के अध्ययन उत्तरी स्टॉकहोम पशु कल्याण आचार समिति द्वारा अनुमोदित किया गया। प्रयोगात्मक प्रक्रियाओं स्वीडिश कानून के अनुपालन में प्रदर्शन किया गया।
1. एक LPS एयरोसोल सृजन
- पी शुद्ध 0.5 ग्राम भंग कोमल आंदोलन के साथ 50 मिलीलीटर बाँझ खारा में aeruginosa LPS और विघटन की पुष्टि करें। 1 मिलीग्राम / एमएल के एक अंतिम एकाग्रता के लिए, 9 मिलीलीटर बाँझ खारा में LPS भंग 1 मिलीलीटर पतला। -20 डिग्री सेल्सियस पर एल्यूमीनियम पन्नी और दुकान के साथ प्रकाश से सुरक्षित रखें।
- कमरे के तापमान पर अंधेरे में solubilized LPS पिघलना और उपयोग करने से पहले अच्छी तरह से तुरंत मिश्रण।
- एक हवादार स्तर द्वितीय Biohazard हुड में, एक छिटकानेवाला में एक लाल इनलेट डालें, और निर्माता (चित्रा 1 में प्रायोगिक उपकरणों पेश की समीक्षा स्कीम) द्वारा प्रदान की ट्यूबिंग के माध्यम से दबाव कमरे में हवा को छिटकानेवाला कनेक्ट।
चेतावनी: उपयुक्त व्यक्तिगत सुरक्षा उपकरण, एक आधा चेहरा टुकड़ा पुन: प्रयोज्य respirat सहितया कण फिल्टर, चश्मे, दस्ताने और सुरक्षात्मक कपड़ों के साथ लोगों तक पहुंचाने के दौरान इस्तेमाल किया जाना चाहिए।
चित्रा 1:। एक एयरोसोल पैदा करने के लिए इस्तेमाल किया प्रायोगिक उपकरणों के योजनाबद्ध प्रस्तुति छिटकानेवाला के इनलेट एक हवा की आपूर्ति से जुड़ा है। छिटकानेवाला के आउटलेट पहले एक 15.9 मिमी ट्यूब और एक एयर फिल्टर, और हवा की आपूर्ति के माध्यम से एक फ्लो मीटर से जुड़ा है 2 kbar दबाव में 5.0 एल / मी के लिए निकाला जाता है। आउटलेट हटाने योग्य lids और दबाव का निर्माण हुआ रोकने के लिए 5 मिमी छेद के साथ लगे एक Plexiglas बॉक्स से जुड़ा बगल में है।
- एक हवा फिल्टर के माध्यम से एक जन प्रवाहमापी के लिए छिटकानेवाला के आउटलेट से कनेक्ट करें। एक बिजली की आपूर्ति करने के लिए बड़े पैमाने पर प्रवाहमापी कनेक्ट करें।
- 1.0-2.0 बार में शेष दबाव के साथ, 5 एल / मिनट के लिए हवा की आपूर्ति को समायोजित करें।
- बड़े पैमाने पर प्रवाहमापी निकालें औरहवा की आपूर्ति काट।
- 150 X 163 X 205 मिमी, हटाने योग्य lids के साथ फिट: bifurcates और आयामों के साथ दो Plexiglas बक्से को जोड़ता है, जो एक 15.9 मिमी ट्यूब, के लिए छिटकानेवाला के आउटलेट से कनेक्ट करें। प्रत्येक बॉक्स में दबाव का निर्माण हुआ रोकने के लिए इनलेट विरोध पक्ष में एक 5 मिमी छेद होना चाहिए।
- प्रत्येक Plexiglas बॉक्स में 5 चूहों अप करने के लिए जगह है और पलकों को बंद करें।
- छिटकानेवाला खोलें और अकेले बाँझ खारा या वाहन में भंग कर कम से कम 4 मिलीलीटर LPS के साथ डालने भरने (बाँझ खारा; मात्रा 8 मिलीग्राम से अधिक नहीं होना चाहिए)। हवा की आपूर्ति करने के लिए इनलेट फिर से कनेक्ट।
- एयरोसोल 10 मिनट के लिए बंद कर दिया Plexiglas बक्से में प्रवाह करने की अनुमति दें। लगातार जानवरों की निगरानी करें। सुनिश्चित करें कि हवा की आपूर्ति छिटकानेवाला के प्रवेश को कसकर सुरक्षित रहता है बनाओ।
- हवा की आपूर्ति काट। पलकों को बंद कर दिया साथ, जानवरों 2 मिनट के लिए Plexiglas बक्से में रहते हैं।
- पलकों को खोलें और एयरोसोल फैलाने के लिए अनुमति देते हैं, और टी के लिए जानवरों लौटनेवह पिंजरों। जानवरों गीला दिखाई देते हैं, हाइपोथर्मिया को रोकने के लिए, कम गर्मी के लिए सेट एक हीटिंग पैड पर पिंजरों जगह है।
- पहले 30 मिनट के लिए लगातार जानवरों नजर रखता है और पहले छह घंटे के लिए उसके बाद हर 2 घंटे। जानवरों के दौरान और nebulization के प्रक्रिया के बाद सामान्य श्वसन पैटर्न और गतिविधि का प्रदर्शन करना चाहिए।
2. ब्रोन्कोएल्वियोलर Lavage (बाल)
- अपनी संस्था के पशु चिकित्सा स्टाफ की सिफारिश के अनुसार प्रयोगात्मक अंत बिंदु पर, गहरा प्रभाव को isoflurane के साथ पशुओं anesthetize। बड़ी सर्जरी का संचालन करने के लिए संज्ञाहरण की पर्याप्त गहराई सुनिश्चित करने के लिए एक वापसी पलटा के लिए जाँच करने के लिए हिंद पंजा चुटकी। 70% इथेनॉल के साथ पशुओं के फर नीचे स्प्रे।
- कैंची का उपयोग पेट खोलें, और पशु रक्तहीन को महाधमनी तोड़। रक्त सोख पेट पर ऊतक का एक टुकड़ा रखें।
- इच्छामृत्यु follwing, कैंची की एक एकल पूर्वकाल-पीछे कटौती का उपयोगछाती बेनकाब। उरोस्थि के पूर्वकाल टिप द्वारा रिब पिंजरे उठा और किसी भी फेफड़ों पालि में काटने के बिना, सबसे उदर बिंदु पर डायाफ्राम पंचर करने के लिए कैंची का उपयोग करें। पूर्वकाल-पीछे दिशा में दो कटौती (जबड़े के नीचे बैठक) बनाकर ribcage खोलें।
- धीरे संदंश का उपयोग रिब पिंजरे के अलावा पुल, और गला नीचे श्वासनली में कटौती।
- संदंश के साथ ट्रेकिआ उठा और वक्ष गुहा को पालियों जोड़ने स्नायुबंधन काटने, और धीरे वसा और हृदय के ऊतकों से खींच कर फेफड़ों को हटा दें।
- एक पॉलीथीन ट्यूब (: 0.58 मिमी, बाहरी व्यास: भीतरी व्यास 0.965 मिमी) डालें श्वासनली में और रेशम के धागे का एक तार के साथ ट्यूब सुरक्षित।
- रेशम के धागे के साथ multilobe (दाएं फेफड़े के चार पालियों) बंद टाई।
- पॉलीथीन ट्यूब में एक 23 गेज सुई डालें और धीरे धीरे एक एक मिलीलीटर सिरिंज के साथ एकल पालि में बर्फ ठंड बाँझ पीबीएस के 250 μl इंजेक्षन।
- ध्यान से फेफड़ों का दोहन30 बार और सिरिंज के माध्यम से तरल इकट्ठा। 200 μl पीबीएस के साथ प्रक्रिया को दोहराएँ (लगभग 300 μl पीबीएस 450 μl की कुल इंजेक्शन की मात्रा से एकल पालि से बरामद किया जाना चाहिए)।
- बर्फ पर ब्रोन्कोएल्वियोलर पानी से धोना द्रव (BALF) रखें, या तुरंत बाल कोशिकाओं की गणना करें। कोशिकाओं 11 दाग तुर्क समाधान का उपयोग कर, एक heamocytometer साथ कोशिकाओं की गणना। धुंधला समाधान के कमजोर पड़ने कारक और heamocytometer की गिना क्षेत्र के भीतर मात्रा के साथ कोशिकाओं की संख्या से गुणा करके कुल सेल नंबर की गणना।
- कहीं और 11 के रूप में वर्णित cytocentrifuged कोशिकाओं से अंतर कोशिकाओं की गिनती तैयार करें।
Histological आकलन के लिए फेफड़े के ऊतकों की 3. Formalin फिक्सेशन
- Multilobe निकालें और स्नैप-फ्रीज सूखी बर्फ पर। -80 डिग्री सेल्सियस पर स्टोर।
- एक धातु समर्थन स्टैंड पर हटाया सवार के साथ एक 60 मिलीलीटर सिरिंज माउंट। 10 formalin% करने के साथ सिरिंज भरेंलगातार दबाव के 20 सेमी का प्रतिनिधित्व प्रयोगशाला बेंच के ऊपर 20 सेमी की ऊंचाई।
- Formalin के प्रवाह को नियंत्रित करने के लिए एक वाल्व के साथ एक प्लास्टिक ट्यूब के माध्यम से 60 मिलीलीटर सिरिंज से श्वासनली के लिए सुरक्षित 23 गेज सुई कनेक्ट करें।
- 5 मिनट के लिए formalin के साथ फेफड़ों पालि Insufflate। सुई डिस्कनेक्ट और रेशम धागे पर खींच श्वासनली को बंद करने और फेफड़ों में दबाव बनाए रखने के लिए, जबकि श्वासनली से पॉलीथीन ट्यूब के साथ यह एक साथ हटा दें।
- Formalin में फेफड़ों पालि डूब और 4 डिग्री सेल्सियस पर 24 घंटे के लिए तय कर लो।
- 70% इथेनॉल के साथ कम से कम 20 मिनट के लिए तय ऊतक तीन बार धोएं, और निम्न आहार (1 घंटा प्रत्येक) के माध्यम से xylene को निर्जलीकरण:
- 3x 70% इथेनॉल
- 3x 95% इथेनॉल
- 3x 100% इथेनॉल
- 3x xylene
- 1x (तरल) आयल
- Hematoxylin और eosin साथ एम्बेड निर्जलित 4-5 माइक्रोन वर्गों में कटौती आयल में ऊतक, और दाग ऊतकीय मूल्यांकन के लिए अनुमति देने के लिए।
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Aerosolized पी को चैलेंज aeruginosa LPS आमतौर पर जल्दी और देर से समय बिंदुओं पर दोनों neutrophils की एक विशेषता द्वारा विशेषता airway के लुमेन और वायुकोशीय अंतरिक्ष में एक चिह्नित भड़काऊ प्रतिक्रिया पैदावार।
Aerosolized LPS के फेफड़े neutrophilia लाती है
C57BL / 6by और BALB / ग चूहों aerosolized पी से अवगत कराया गया aeruginosa LPS या अकेले वाहन और न्यूट्रोफिल BALF में प्रगणित थे। C57BL वाहन के साथ उत्पन्न एक एयरोसोल से अवगत कराया / 6by चूहों के BALF में कुल सेल नंबर ही आम तौर पर चारों ओर या 200.000 कोशिकाओं से नीचे है और कोशिकाओं को केवल कुछ लिम्फोसाइटों (0.5-5%) के साथ, 95-100% मोनोन्यूक्लियर कोशिकाओं से मिलकर बनता है, और BALF में कोई न्यूट्रोफिल (2A चित्रा-सी)। चूहे 6 घंटे के बाद, aerosolized LPS के प्रदर्शन के साथ आम तौर पर> 500,000 कोशिकाओं BALF में एक वृद्धि की कुल सेल नंबर को चुनौती दी। सेल पैठ 24 घंटा के बाद उच्च बनी हुई है। BALF में सेलुलर प्रोफाइल एपी की ओर स्थानांतरित कर दिया गया हैLPS के जोखिम (चित्रा 2B और सी) निम्नलिखित न्यूट्रोफिल (80-95%) की redominance।
चित्रा 2:। 1 मिलीग्राम / एमएल aerosolized LPS C57BL / 6by चूहों के साथ चुनौती दी C57BL / 6by चूहों में फेफड़े के neutrophilia 1 मिलीग्राम से अवगत कराया गया / एमएल पी aerosolized aeruginosa LPS या अकेले 10 मिनट के लिए वाहन (खारा, सफेद पट्टी)। ब्रोन्कोएल्वियोलर पानी से धोना (बाल) 6 घंटा या 24 घंटे के बाद प्रदर्शन किया था और ल्यूकोसाइट्स बाल तरल पदार्थ (BALF) में प्रगणित किया गया। (ए) कुल सेल नंबर (TCN), (ख) न्यूट्रोफिल, और (सी) मोनोन्यूक्लियर कोशिकाओं (एमएनसी) में BALF। महत्वपूर्ण मतभेद संयुक्त राष्ट्र-बनती टी परीक्षण का उपयोग कर विश्लेषण किया गया। एन = 3-4, *, पी <0.05 इंगित करता है ** <0.01 पी इंगित करता है।
BALF में भड़काऊ कोशिकाओं में एक तुलनीय वृद्धि LPS को चुनौती दी BALB / ग चूहों में मनाया जाता है (चित्रा 3A (चित्रा 3 बी और सी) में तुलनीय है।
चित्रा 3:। 1 मिलीग्राम / एमएल aerosolized LPS के साथ चुनौती दी BALB / ग चूहों में फेफड़े के neutrophilia BALB / ग चूहों 1 मिलीग्राम से अवगत कराया गया / एमएल पी aerosolized aeruginosa LPS या अकेले 10 मिनट के लिए वाहन (खारा, सफेद पट्टी)। ब्रोन्कोएल्वियोलर पानी से धोना (बाल) 6 घंटा या 24 घंटे के बाद प्रदर्शन किया था और ल्यूकोसाइट्स बाल तरल पदार्थ (BALF) में प्रगणित किया गया। (ए) कुल सेल नंबर (TCN), (ख) न्यूट्रोफिल, और (सी) मोनोन्यूक्लियर कोशिकाओं (एमएनसी) में BALF। महत्वपूर्ण मतभेद संयुक्त राष्ट्र-बनती टी परीक्षण का उपयोग कर विश्लेषण किया गया। एन = 3, **, पी <0.01 इंगित करता है *** 0.001 <पी इंगित करता है।
इसी प्रकार के भड़काऊ सेल प्रोफ़ाइल में एक पहले से 12,13 रिपोर्ट के रूप में डी फेफड़े neutrophilia, 5 मिलीग्राम / एमएल LPS (चित्रा -4 ए-सी) के nebulization के साथ और LPS की intranasal प्रसव के द्वारा मनाया जाता है।
चित्रा 4:। 5 मिलीग्राम / एमएल aerosolized LPS के साथ चुनौती दी BALB / ग चूहों में फेफड़े के neutrophilia BALB / ग चूहों 5 मिलीग्राम से अवगत कराया गया / एमएल पी aerosolized aeruginosa LPS या अकेले 10 मिनट के लिए वाहन (खारा, सफेद पट्टी)। ब्रोन्कोएल्वियोलर पानी से धोना (बाल) 24 घंटा के बाद किया गया था और ल्यूकोसाइट्स बाल तरल पदार्थ (BALF) में प्रगणित गया। BALF (क) में कुल सेल नंबर (TCN), (ख) न्यूट्रोफिल, और (सी) मोनोन्यूक्लियर कोशिकाओं (एमएनसी)। महत्वपूर्ण मतभेद संयुक्त राष्ट्र-बनती टी परीक्षण का उपयोग कर विश्लेषण किया गया। एन = 3, *** पी <0.001 इंगित करता है।
LPS को चुनौती दी में neutrophils के पल्मोनरी स्थानीयकरण
"ontent> न्यूट्रोफिल LPS को चुनौती दी चूहों (चित्रा 5) का आयोजन करने एयरवेज और रक्त वाहिकाओं के आसपास के रिक्त स्थान के रूप में के रूप में अच्छी तरह से, उपकला submucosa में मनाया जाता है। बिखरे न्यूट्रोफिल भी पैरेन्काइमा और वायुकोशीय क्षेत्र में पाया जाता है।
चित्रा 5:। LPS को चुनौती दी चूहों में neutrophils के पल्मोनरी स्थानीयकरण (ए) से formalin तय फेफड़े के ऊतकों के hematoxylin और eosin धुंधला C57BL / अकेले वाहन या (बी) 1 मिलीग्राम से अवगत कराया 6by चूहों / एमएल aerosolized LPS के 6 घंटे के बाद का बलिदान या (सी) 24 घंटा। तीर एक न्युट्रोफिल इंगित करता है। बार 200 माइक्रोन इंगित करता है। यह आंकड़ा का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।
CONCENTRBALF में न्युट्रोफिल chemoattractants की समझना
LPS को चुनौती दी चूहों के BALF में कुल प्रोटीन सामग्री खारा के संपर्क में चूहों (चित्रा 6) की तुलना में वृद्धि हुई है। इसके अलावा, न्यूट्रोफिल chemoattractants केमोकाइन (CXC आकृति) ligands के (CXCL) एक और CXCL2 की अभिव्यक्ति LPS को चुनौती दी चूहों 10 (चित्रा 7A और बी) में बढ़ रहे हैं।
चित्रा 6:। ब्रोन्कोएल्वियोलर पानी से धोना तरल पदार्थ LPS को चुनौती दी C57BL / 6by चूहों की (BALF) में वृद्धि की कुल प्रोटीन एकाग्रता 1 मिलीग्राम / एमएल aerosolized LPS के लिए चुनौती दी है या वाहन (खारा, सफेद पट्टी) के संपर्क में चूहों के BALF में कुल प्रोटीन सामग्री अकेला था spectrophotometric विश्लेषण द्वारा मापा जाता है। महत्वपूर्ण मतभेद संयुक्त राष्ट्र-बनती टी परीक्षण का उपयोग कर विश्लेषण किया गया। एन = 3-4, ** पी <0.01 इंगित करता है।
चित्रा 7:। मैं ब्रोन्कोएल्वियोलर पानी से धोना तरल पदार्थ LPS को चुनौती दी चूहों के (BALF) 1 मिलीग्राम / एमएल aerosolized LPS के लिए चुनौती दी चूहों के BALF में (ए) CXCL1 और (बी) CXCL2 की अभिव्यक्ति में CXCL1 और CXCL2 की अभिव्यक्ति ncreased या वाहन से अवगत कराया अकेले एलिसा द्वारा मात्रा (खारा, सफेद पट्टी)। महत्वपूर्ण मतभेद संयुक्त राष्ट्र-बनती टी परीक्षण का उपयोग कर विश्लेषण किया गया। एन = 3।
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Aerosolized LPS उपकला submucosa में न्यूट्रोफिल द्वारा विशेषता एयरवेज में एक भड़काऊ प्रतिक्रिया, उत्पन्न करता है, का आयोजन एयरवेज, साथ ही वायुकोशीय रिक्त स्थान के आसपास के रिक्त स्थान। यह एक साथ प्लाज्मा रिसाव, गंभीर फेफड़ों की चोट की विकृति के प्रतिनिधि का संकेत BALF में वृद्धि की कुल प्रोटीन सामग्री, के साथ है। LPS के एक बाँझ सूजन लाती है, के रूप में प्रतिक्रिया अनुकूली प्रतिरक्षा प्रतिक्रिया के स्वतंत्र है, और बैक्टीरिया के संक्रमण के लिए प्रासंगिकता के लिए सीमाएं हैं। तकनीक, हालांकि, अनुकूली प्रतिरक्षा प्रतिक्रिया को छोड़कर द्वारा भड़काऊ तंत्र काटना करने के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है।
पद्धति सरल है और आसानी से विभिन्न वैज्ञानिक सवालों के जवाब देने के लिए अनुकूलित हालांकि, छिटकानेवाला और ट्यूबिंग का चुनाव महत्वपूर्ण है। LPS और जिसके परिणामस्वरूप neutrophilia के बयान यहाँ वर्णित है के अलावा अन्य inlets, Nebulizers और ट्यूबिंग के साथ मान्य किया जाना चाहिए। इसके अलावा, के रूप में कम आम माउस सेंटLPS के लिए अलग-अलग प्रतिक्रियाएं प्रदर्शित कर सकता है बारिश, LPS का इष्टतम खुराक प्रत्येक तनाव के लिए निर्धारित किया जाना चाहिए। दूसरों 12, 13 से मनाया के रूप में इसके अलावा, aerosolized LPS के साथ उत्पन्न neutrophilic सूजन, LPS की intranasal प्रसव से प्रेरित सूजन के साथ तुलनीय है। Intranasal प्रशासन आसानी से किया जाता है, कार्यप्रणाली एनेस्थेटिक्स की आवश्यकता है और नाक गुहा बाँझ नहीं है और तकनीक के वाहन की एक बड़ी मात्रा की आवश्यकता के रूप में संभावित, फेफड़ों के लिए नाक गुहा की माइक्रोबियल वनस्पति मिलवा सकता है।
गंभीर फेफड़ों की चोट की प्रासंगिकता के अलावा, तकनीक आगे aerosolized LPS के साथ कई चुनौतियों शामिल करने के लिए विकसित किया जा सकता है। कार्यप्रणाली इस प्रकार एक साथ reoccurring जीवाणु संक्रमण या स्थायी माइक्रोबियल उपनिवेशन के साथ, neutrophilia 14 बने साथ जुड़ा हुआ है जो सीओपीडी के जीर्ण सूजन, में रोगजनक तंत्र का अध्ययन करने के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है
Aerosolized LPS के साथ चुनौती कुछ उपकरणों के साथ एक छोटी सी कीमत पर स्थापित किया है और कम से कम प्रशिक्षण की आवश्यकता हो सकती है। इसके अलावा, तकनीक इस प्रकार नियमित रूप से व्यक्तियों के बीच बहुत कम या कोई बदलाव के साथ, किसी भी प्रयोगशाला में बड़े पैमाने पर प्रदर्शन किया और फेफड़े के वितरण के अन्य मार्गों के लिए इस प्रकार बेहतर किया जा सकता है।
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
इब्राहीम Roos Boehringer Ingelheim, एस्ट्राजेनेका अनुसंधान एवं विकास और एस्ट्राजेनेका अनुसंधान एवं विकास से एक शोध अनुदान से यात्रा अनुदान से एक व्याख्याता शुल्क प्राप्त हुआ है। मैगनस नोर्ड एस्ट्राज़ेनेका आर एंड डी के एक पूर्णकालिक कर्मचारी है और एस्ट्राजेनेका अनुसंधान एवं विकास से अनुसंधान अनुदान प्राप्त हुआ है। जोहान Grunewald और टुवे बर्ग एस्ट्राज़ेनेका अनुसंधान एवं विकास द्वारा वित्त पोषित एक असंबंधित अनुसंधान परियोजना पर सह जांचकर्ता हैं।
Acknowledgments
हम कुशल सहायता के लिए Kerstin Thim (एस्ट्राजेनेका, लंड, स्वीडन), Benita Dahlberg और डॉ ऐन्डर्स Eklund (कारोलिंस्का Institutet, स्टॉकहोम, स्वीडन) और साथ ही डॉ मार्टिन Stampfli (मैकमास्टर विश्वविद्यालय, हैमिल्टन, पर, कनाडा) शुक्रिया अदा करना चाहूँगा और विशेषज्ञ सलाह।
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Purified Pseudomonas aeruginosa LPS | Sigma-Aldrich | Harmful. Recomended purification. LPS purified from other bactria may be used. | |
| Pari LC sprint star nebulizer | PARI Respiratory Equipment Inc. | 023G1250 | |
| TSI mass flowmeter 4040 | TSI | 4040 | Alternative product from supplier may be used. |
| Saint-Gobain 15.9 mm Tygon tube | Sigma-Aldrich | Z685704 | Recomended brand. |
| Plexiglas boxes with removable lids | Custom built | N/A | 150 x 163 x 205 mm (a 2 mm hole on the side). |
| 3M Half Facepiece Reusable Respirator | 3M | 7503 | Recomended brand. |
| 3M Advanced Particulate Filters (P100) | 3M | 2291 | Recomended brand. |
| Scissors | VWR | 233-1104 | Preferred scissors may be used. |
| Forceps | VWR | 232-1313 | Preferred forceps may be used. |
| Intramedic PE50 polyethylene tube | BD | 427411 | Recomended brand. |
| Ethicon 2-0 Perma-hand silk tread | VWR | 95056-992 | Recomended brand. |
| 26 ½ gage needle | Alternative suppliers exist. | ||
| 1 ml BD slip-tip syringe, non-sterile |  BD |
301205 | Alternative suppliers exist. |
| 60 ml BD Luer-Lok syringe, non-sterile, polypropolene | BD | 301035 | Alternative suppliers exist. |
| Fluka Hematoxylin-Eosin | Sigma-Aldrich | 3972 | Alternative suppliers exist. |
| Türk's solution | Merck Millipore | 109277 | |
| Table top centrifuge | Alternative manufacturers exist. | ||
| Cytospin 4 cytocentrifuge | Thermo Scientific | A78300003 | Alternative centrifuge can be used. |
| HEMA-3 stat pack | Fisher Scientific | 23-123-869 | Alternative staining kits exists. |
| Formalin solution, neutral buffered, 10% | Sigma-Aldrich | HT501128 | Alternative suppliers exist. |
References
- King, J. D., Kocincova, D., Westman, E. L., Lam, J. S. Review: Lipopolysaccharide biosynthesis in Pseudomonas aeruginosa. Innate Immun. 15, 261-312 (2009).
- Grommes, J., Soehnlein, O. Contribution of neutrophils to acute lung injury. Mol Med. 17, 293-307 (2011).
- Pesci, A., et al. Inflammatory cells and mediators in bronchial lavage of patients with chronic obstructive pulmonary disease. Eur Respir J. 12, 380-386 (1998).
- Hoogerwerf, J. J., et al. Lung Inflammation Induced by Lipoteichoic Acid or Lipopolysaccharide in Humans. Am. J. Respir. Crit. Care Med. 178, 34-41 (2008).
- Scheuchenzuber, W. J., Eskew, M. L., Zarkower, A. Comparative humoral responses to Escherichia coli and sheep red blood cell antigens introduced via the respiratory tract. Exp Lung Res. 13, 97-112 (1987).
- Asti, C., et al. Lipopolysaccharide-induced lung injury in mice. I. Concomitant evaluation of inflammatory cells and haemorrhagic lung damage. Pulm Pharmacol Ther. 13, 61-69 (2000).
- Brand, P., et al. Total deposition of therapeutic particles during spontaneous and controlled inhalations. Journal of pharmaceutical sciences. 89, 724-731 (2000).
- Liu, F., Li, W., Pauluhn, J., Trubel, H., Wang, C. Lipopolysaccharide-induced acute lung injury in rats: comparative assessment of intratracheal instillation and aerosol inhalation. Toxicology. 304, 158-166 (2013).
- Skerrett, S. J., et al. Role of the type 1 TNF receptor in lung inflammation after inhalation of endotoxin or Pseudomonas aeruginosa. American Journal of Physiology - Lung Cellular and Molecular Physiology. 276, L715-L727 (1999).
- Roos, A. B., et al. Lung epithelial-C/EBPbeta contributes to LPS-induced inflammation and its suppression by formoterol. Biochem Biophys Res Commun. 423, 134-139 (2012).
- Didon, L., et al. Lung epithelial CCAAT/enhancer-binding protein-beta is necessary for the integrity of inflammatory responses to cigarette smoke. Am J Respir Crit Care Med. 184, 233-242 (2011).
- Silverpil, E., et al. Negative feedback on IL-23 exerted by IL-17A during pulmonary inflammation. Innate Immunity. 19, 479-492 (2013).
- Mercer, P. F., et al. Proteinase-Activated Receptor-1, CCL2 and CCL7 Regulate Acute Neutrophilic Lung Inflammation. American Journal of Respiratory Cell and Molecular Biology. , (2013).
- Korkmaz, B., Horwitz, M. S., Jenne, D. E., Gauthier, F. Neutrophil Elastase, Proteinase 3, and Cathepsin G as Therapeutic Targets in Human Diseases. Pharmacological Reviews. 62, 726-759 (2010).
- Bafadhel, M., et al. Acute Exacerbations of COPD: Identification of Biological Clusters and Their Biomarkers. Am. J. Respir. Crit. Care Med. , 201104-200597 (2011).
- Hurst, J. R., Perera, W. R., Wilkinson, T. M. A., Donaldson, G. C., Donaldson, G. C., Wedzicha, G. C. Systemic and Upper and Lower Airway Inflammation at Exacerbation of Chronic Obstructive Pulmonary. Am. J. Respir. Crit. Care Med. 173, 71-78 (2006).
- Rabe, K. F., et al. Global Strategy for the Diagnosis, Management, and Prevention of Chronic Obstructive Pulmonary Disease: GOLD Executive Summary. Am. J. Respir. Crit. Care Med. 176, 532-555 (2007).
