Summary
Vi beskriver en metod för att inducera neutrofil pulmonell inflammation genom utmaning för aerosoliserad lipopolysackarid genom nebulisering, att modellera akut lungskada. Dessutom är grundläggande kirurgiska tekniker för lung- isolering, trakeal intubering och bronkoalveolärt lavage också beskrivits.
Abstract
Akut lungskada (ALI) är en allvarlig sjukdom som kännetecknas av alveolär neutrofili, med begränsade behandlingsalternativ och hög dödlighet. Experimentella modeller av ALI är nyckeln för att öka vår förståelse av sjukdomen patogenes. Lipopolysackarid (LPS) härrörande från grampositiva bakterier inducerar neutrofil inflammation i luftvägarna och lungparenkym av möss. Effektiv pulmonal tillförsel av föreningar, såsom LPS är dock svårt att uppnå. I den metod som beskrivs här, är pulmonell leverans i möss uppnås genom utmaning för aerosoliserad Pseudomonas aeruginosa LPS. Löst LPS aerosol genom en nebulisator kopplad till tryckluft. Möss utsattes för ett kontinuerligt flöde av LPS aerosol i en plexiglaslåda i 10 min, följt av 2 min konditionering efter aerosol avbröts. Trakealintubation och efterföljande lungsköljning, följt av formalin perfusion var nästa utförts, vilket möjliggör för karakterisering av den sterila pulmonary inflammation. Aerosolform LPS genererar en lunginflammation som kännetecknas av alveolär neutrofili, upptäcktes i bronkoalveolärt lavage och genom histologisk bedömning. Denna teknik kan sättas upp till en liten kostnad med få apparater, och kräver minimal utbildning och kompetens. Exponeringssystemet kan således rutinmässigt vid alla laboratorier, med potential att öka vår förståelse av lungpatologi.
Introduction
Lipopolysackarid (LPS) är en cellväggkomponent av gramnegativa bakterier 1. Utmaning till LPS är en väldokumenterad modell av akut lungskada, ett syndrom som kännetecknas av akut neutrofil inflammation och ödem 2. Dessutom är lung neutrofili också ett kännetecken för kronisk obstruktiv lungsjukdom (KOL) 3, och LPS utmaningen hos människa har använts för att modellera KOL exacerbationer 4. Således experimentella modeller av LPS exponering är kliniskt relevanta och värdefulla verktyg för att förstå människans patologi.
Syftet med pulmonell leverans av aerosolform LPS beskrivs här är att generera en neutrofil inflammatoriskt svar i ledande och andningsvägarna, utan systemiskt engagemang. Flera tekniker för LPS-utmaning har beskrivits tidigare. Intra-venös injektion av LPS är den mest använda administreringssättet. Även om denna teknik är lättillgänglig, tHan primär skada är att endotelet, med sekundär förstörelse av lung epitel efter neutrofilmigrationen till lungan. Intravenös administrering inducerar även systemisk inflammation 2, vilket kan komplicera den kliniska bilden i djurmodeller. Systemisk inflammation står i kontrast inte observerats med intratrakeal administration. Denna teknik är dock arbetsintensiv och kräver bedövningsmedel samt betydande utbildning 5, 6. Dessutom är lung nedfall genom denna administreringsväg beroende andning 7. Således är lung nedfall påverkas av anestesidjupet behövs för intra trakeal administration och rörlig nedfall i luftvägarna kan observeras. Däremot kräver pulmonell leverans med aerosolform LPS minimal utbildning, och kan lätt åstadkommas på ett stort antal djur med liten eller ingen variation mellan individer 5, 8.En färsk studie bekräftar att aerosoltillförsel är överlägsen den intratrakeal väg när det gäller deponering, och att mer relevanta doser av LPS inducerar neutrofil inflammation med denna modell 8.
Tidigare studier har visat att utmaningen till aerosolisPseudoMonas aeruginosa LPS alstrar en markerad inflammatoriskt svar i luftvägslumen och lungparenkym, däribland de alveolära utrymmena 9, 10. Inflammationen karakteriseras av en övervikt av neutrofiler och förekomst av lungödem, och kan således användas för att ta itu med patogenes av akut lungskada och uppnå ytterligare kunskap om de mekanismer som bidrar till sjukdomspatologin.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Djurstudier har godkänts av Norra Stockholms djurskydds etisk kommitté på. De experimentella procedurer utfördes i enlighet med Svensk lag.
1. Att utveckla en LPS Aerosol
- Lös 0,5 g renad P. aeruginosa LPS i 50 ml steril koksaltlösning under försiktig omrörning och verifiera upplösningen. Späd 1 ml upplösta LPS i 9 ml steril saltlösning, till en slutlig koncentration av 1 mg / ml. Skyddas från ljus med aluminiumfolie och förvara vid -20 ° C.
- Tina solubiliserade LPS i mörker vid rumstemperatur och blanda väl omedelbart före användning.
- I en ventilerad nivå II biohazard huva, infoga en röd inlopp i en nebulisator, och anslut nebulisatorn till tryckrumsluften via slangen tillhandahålls av tillverkaren (översyn schema presentera de experimentella enheter i figur 1).
VARNING: lämplig personlig skyddsutrustning, inklusive en halv ansikts återanvändningsbar Respirateller med partikelfilter, skyddsglasögon, handskar och skyddskläder bör användas under exponeringen.
Figur 1:. Schematisk presentation av de experimentella anordningar som används för att generera en aerosol Inloppet till nebulisator är ansluten till en lufttillförsel. Utloppet av nebulisatorn är först ansluten till en flödesmätare via ett 15,9 mm rör och ett luftfilter, och lufttillförseln justeras till 5,0 L / m vid 2 kbar tryck. Utloppet är bredvid ansluten till ett plexiglas låda försedd med avtagbara lock och 5 mm hål för att förhindra tryckuppbyggnad.
- Anslut utlopp nebulisatorn till en massflödesmätare via ett luftfilter. Anslut massflödesmätare till en elektrisk källa.
- Justera lufttillförseln till 5 l / min, med tryck kvar på 1,0-2,0 bar.
- Ta bort massflödesmätare ochkoppla bort lufttillförseln.
- Anslut utlopp nebulisator till en 15,9 mm rör, som förgrenar och ansluter till två plexiglaslådor med måtten: 150 x 163 x 205 mm, försedda med avtagbara lock. Varje låda bör ha en 5 mm hål i den sida som är motsatt inloppet, för att förhindra tryckuppbyggnad.
- Placera upp till fem möss i varje plexiglas låda och stäng locken.
- Öppna nebulisatorn och fylla insatsen med åtminstone 4 ml LPS lösta i steril saltlösning eller enbart vehikel (steril saltlösning; volymen bör inte överstiga 8 ml). Åter Anslut inloppet till lufttillförseln.
- Låt aerosol flöda in i de slutna plexiglas boxar i 10 min. Övervaka djuren kontinuerligt. Se till att lufttillförseln är fortfarande tätt säkrad till inloppet av nebulisatorn.
- Koppla bort lufttillförseln. Med stängt locken, låt djuren kvar i plexiglaslådor i 2 min.
- Öppna locken och möjliggöra aerosol för att skingra, och åter djuren till than burar. Om djuren verkar blöt, placera burarna på en värmedyna inställd på låg värme, för att förhindra hypotermi.
- Övervaka djuren kontinuerligt för första 30 min, och därefter varje 2 h under det första 6 h. Djuren bör uppvisa normala andningsmönster och aktivitet under och efter nebuliseringen förfarandet.
2. lung Lavage (BAL)
- Vid den experimentella slutpunkt, djupt söva djuren med isofluran till effekt som rekommenderas av din institutions veterinärpersonal. Nyp baktassen för att kontrollera om ett tillbakadragande reflex för att säkerställa tillräcklig anestesidjup för att genomföra större operation. Spraya ner pälsen av djuren med 70% etanol.
- Öppna buken med hjälp av en sax, och skilja de aorta att exsanguinate djuret. Placera en bit vävnad över buken för att suga upp blodet.
- Följande städerna eutanasi, använda en enda främre-bakre snitt av en sax för attexponera bröstkorgen. Lyft upp bröstkorgen med den främre spetsen av bröstbenet och använda sax för att punktera membranet på den mest ventrala punkten, utan att skära in i någon lungloben. Öppna bröstkorgen genom att göra två snitt i främre-bakre riktning (mötes nedanför käken).
- Dra försiktigt isär bröstkorgen med pincett, och skär luftstrupen nedanför struphuvudet.
- Lyft upp luftstrupen med pincett och ta bort lungorna genom att skära ligamenten som förbinder loberna till brösthålan, och försiktigt dra av fett- och hjärtvävnad.
- Sätt ett polyetenrör (innerdiameter: 0,58 mm; ytterdiameter: 0,965 mm) i luftstrupen och säkra röret med en sträng av silkestråd.
- Knyt bort multilobe (de fyra lober höger lunga) med silkestråd.
- Sätt i en 23 gauge nål i polyetenröret och injicera långsamt 250 pl iskall steril PBS i den inre lob med en 1 ml spruta.
- Knacka försiktigt lungorna30 gånger och samla vätskan genom sprutan. Upprepa proceduren med 200 pl PBS (ca 300 l PBS bör återvinnas från enstaka lob från den totala injicerade volymen på 450 l).
- Håll bronkoalveolär sköljvätska (BALF) på is, eller räkna upp de BAL cellerna omedelbart. Räkna celler med en heamocytometer, använder Turk-lösning för att färga cellerna 11. Beräkna det totala cellantalet genom att multiplicera antalet celler med utspädningsfaktorn för färglösningen och volymen inuti det räknade området för heamocytometer.
- Förbered differentiella cellräkningar från cytocentrifuged celler som beskrivs på annan plats 11.
3. Formalin Fixering av lungvävnad för histologisk bedömning
- Avlägsna multilobe och snap-frysa på torris. Förvara vid -80 ° C.
- Montera en 60 ml spruta med kolven avlägsnades på en metallstödstativ. Fyll sprutan med 10% formalin tillhöjd 20 cm ovanför laboratoriebänk, som representerar 20 cm konstant tryck.
- Anslut 23 gauge nål fäst vid luftstrupen till 60 ml-sprutan via ett plaströr med en ventil för att kontrollera flödet av formalin.
- Insufflate lungan lob med formalin under 5 minuter. Koppla nålen och ta bort den tillsammans med polyetenröret från luftstrupen när du drar på silkestråd för att stänga luftstrupen och behålla trycket i lungan.
- Sänk lungan loben i formalin och fastställa till 24 h vid 4 ° C.
- Tvätta den fasta vävnaden tre gånger under minst 20 min med 70% etanol, och torkar för xylen igenom följande kur (1 tim vardera):
- 3x 70% etanol
- 3x 95% etanol
- 3x 100% etanol
- 3x xylen
- 1x (flytande) paraffin
- Bädda dehydratiserad vävnad i paraffin, skars i 4-5 | im sektioner och fläcken med hematoxylin och eosin för att möjliggöra för histologisk bedömning.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Utmaning till aerosoliserad P. aeruginosa LPS ger oftast en markerad inflammatorisk reaktion i luftvägslumen och alveolär utrymme, som kännetecknas av en dominans av neutrofiler vid både tidiga och sena tidpunkter.
Aerosolform LPS inducerar pulmonell neutrofili
C57BL / 6BY och BALB / c-möss exponerades för aerosoliserad P. aeruginosa LPS eller ensam fordonet och neutrofiler räknades i BALF. Det totala antalet celler i BALF av C57BL / 6BY möss som exponerats för en aerosol som genereras med bilen bara är typiskt runt eller under 200.000 celler och cellerna består av 95-100% mononukleära celler, med bara några få lymfocyter (0,5-5%), och inga neutrofiler i BALF (Figur 2A-C). Möss utmanades med aerosolform LPS uppvisar en ökad total cellnummer i BALF, typiskt> 500.000 celler efter 6 timmar. Cell infiltrat fortfarande hög efter 24 timmar. Det cellulära profil i BALF förskjuts mot apredominance av neutrofiler (80-95%) efter LPS exponering (Figur 2B och C).
Figur 2:. Pulmonell neutrofili i C57BL / 6BY möss stimulerade med 1 mg / ml i aerosolform LPS C57BL / 6BY möss exponerades för 1 mg / ml aerosol P. aeruginosa LPS eller fordon (saltlösning, vit bar) ensam i 10 min. Bronkoalveolärt lavage (BAL) utfördes efter 6 timmar eller 24 timmar och leukocyter räknades i BAL-vätska (BALF). (A) Totalt antal celler (TCN), (B) neutrofiler, och (C) mononukleära celler (MNC) i BALF. Signifikanta skillnader analyserades med hjälp av FN-parade t-tester. n = 3-4, * indikerar p <0,05, ** indikerar p <0,01.
En jämförbar ökning av inflammatoriska celler i BALF observeras i LPS-utmanade BALB / c-möss (Figur 3A (figur 3B och C).
Figur 3:. Pulmonell neutrofili i BALB / c-möss utmanade med en mg / ml aerosoliserad LPS BALB / c-möss exponerades för 1 mg / ml aerosol P. aeruginosa LPS eller fordon (saltlösning, vit bar) ensam i 10 min. Bronkoalveolärt lavage (BAL) utfördes efter 6 timmar eller 24 timmar och leukocyter räknades i BAL-vätska (BALF). (A) Totalt antal celler (TCN), (B) neutrofiler, och (C) mononukleära celler (MNC) i BALF. Signifikanta skillnader analyserades med hjälp av FN-parade t-tester. n = 3, ** indikerar p <0,01, *** indikerar p <0,001.
Liknande inflammatorisk cellprofil en d lung neutrofili observeras med nebulisering av 5 mg / ml LPS (Figur 4A-C) och genom intranasal leverans av LPS, som tidigare rapporterats 12,13.
Figur 4:. Pulmonell neutrofili i BALB / c-möss utmanade med 5 mg / ml i aerosolform LPS BALB / c-möss exponerades för 5 mg / ml aerosol P. aeruginosa LPS eller fordon (saltlösning, vit bar) ensam i 10 min. Bronkoalveolärt lavage (BAL) utfördes efter 24 timmar och leukocyter räknades i BAL-vätska (BALF). (A) Totalt antal celler (TCN), (B) neutrofiler, och (C) mononukleära celler (MNC) i BALF. Signifikanta skillnader analyserades med hjälp av FN-parade t-tester. n = 3, *** indikerar p <0,001.
Lung lokalisering av neutrofiler i LPS-utmanas
INNEHÅLL "> Neutrofiler observeras i epitelial submukosa, samt utrymmen som omger luftvägarna och blodkärlen i LPS-utmanade möss (Figur 5). Dispergerade neutrofiler också upptäckts i parenkymet och alveolära region.
Figur 5:. Lung lokalisering av neutrofiler i LPS-utmanade möss Hematoxylin och eosin färgning av formalinfixerad lungvävnad från (A) C57BL / 6BY möss som exponerats för enbart vehikel eller (B) en mg / ml i aerosolform LPS avlivades efter 6 h eller (C) 24 tim. Arrow indikerar en neutrofil. Bar indikerar 200 nm. Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Concentration av neutrofila chemoattractants i BALF
Den totala proteinhalten i BALF av LPS-utmanade möss är högre än i möss som exponerats för saltlösning (Figur 6). Dessutom är uttrycket av neutrofila kemoattraktanter kemokin (CXC motiv) ligander (CXCL) 1 och CXCL2 ökat i LPS-utmanade möss 10 (figur 7A och B).
Figur 6:. Ökad total proteinkoncentration i bronkoalveolär sköljvätska (BALF) av LPS-utmanade C57BL / 6BY möss Totalt proteininnehåll i BALF av möss utmanade till 1 mg / ml i aerosolform LPS eller exponerats för vehikel (saltlösning, vit stapel) enbart var mätt genom spektrofotometrisk analys. Signifikanta skillnader analyserades med hjälp av FN-parade t-tester. n = 3-4, ** indikerar p <0,01.
Figur 7: Jag ncreased uttryck av CXCL1 och CXCL2 i bronkoalveolär sköljvätska (BALF) av LPS-utmanade möss Uttryck av (A) CXCL1 och (B) CXCL2 i BALF av möss utmanas att 1 mg / ml aerosolform LPS eller utsätts för fordonet. (saltlösning, vit bar) ensamt kvantifieras med ELISA. Signifikanta skillnader analyserades med hjälp av FN-parade t-tester. n = 3.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Aerosoliserad LPS genererar en inflammatorisk reaktion i luftvägarna, som kännetecknas av neutrofiler i epitelial submukosa, utrymmen som omger luftvägarna, liksom de alveolära utrymmena. Detta är, tillsammans med den ökade totala proteininnehållet i BALF, ett tecken på plasmaläckage, representativ för patologi av akut lungskada. Som LPS inducerar en steril inflammation, är reaktionen oberoende av det adaptiva immunsvaret, och det finns begränsningar för relevans för bakterieinfektioner. Tekniken kan emellertid användas för att dissekera inflammatoriska mekanismer genom att utesluta adaptiva immunsvar.
Även metodiken är enkel och lätt att anpassa till besvara olika vetenskapliga frågor, är valet av nebulisatorn och slangar kritisk. Avsättningen av LPS och resulte neutrofili måste valideras med vikar, nebulisatorer och slangar än vad som beskrivs här. Eftersom mindre vanliga musen stregn kan visa olika reaktioner på LPS, bör optimala doser av LPS bestämmas för varje stam. Dessutom är jämförbar med den inflammation som induceras av intranasal leverans av LPS den neutrofil inflammation genereras med aerosolform LPS, som observerats av andra 12, 13. Fastän intranasal administrering lätt utförs, kräver den metod anestetika och kunde potentiellt introducera mikrobiologiska flora näshålan till lungorna, som näshålan är inte steril och tekniken kräver en stor volym av vehikel.
Förutom den relevans för akut lungskada, kan tekniken vidareutvecklas för att inkludera flera utmaningar med aerosolform LPS. Metodiken kan således användas för att studera patogena mekanismer i kronisk inflammation i KOL, vilket är förenat med ihållande neutrofili 14, tillsammans med återkommande bakteriella infektioner eller permanent mikrobiell kolonisering
Utmaning med aerosolform LPS kan sättas upp till en liten kostnad med få apparater och kräver minimal utbildning. Vidare tekniken kan således rutinmässigt i stor skala vid varje laboratorium, med liten eller ingen variation mellan individer och är därmed överlägsen andra vägar för pulmonal tillförsel.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Abraham Roos har fått en föreläsare avgift från Boehringer Ingelheim, resebidrag från AstraZeneca R & D och forskningsbidrag från AstraZeneca R & D. Magnus Nord är en heltidsanställd för AstraZeneca R & D och har erhållit forskningsanslag från AstraZeneca R & D. Johan Grunewald och Tove Berg är co-utredare på en obesläktad forskningsprojekt finansierat av AstraZeneca R & D.
Acknowledgments
Vi vill tacka Kerstin Thim (AstraZeneca, Lund, Sverige), Benita Dahlberg och Dr Anders Eklund (Karolinska Institutet, Stockholm, Sverige) samt Dr Martin Stampfli (McMaster University, Hamilton, ON, Kanada) för skickliga bistånd och expertråd.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Purified Pseudomonas aeruginosa LPS | Sigma-Aldrich | Harmful. Recomended purification. LPS purified from other bactria may be used. | |
| Pari LC sprint star nebulizer | PARI Respiratory Equipment Inc. | 023G1250 | |
| TSI mass flowmeter 4040 | TSI | 4040 | Alternative product from supplier may be used. |
| Saint-Gobain 15.9 mm Tygon tube | Sigma-Aldrich | Z685704 | Recomended brand. |
| Plexiglas boxes with removable lids | Custom built | N/A | 150 x 163 x 205 mm (a 2 mm hole on the side). |
| 3M Half Facepiece Reusable Respirator | 3M | 7503 | Recomended brand. |
| 3M Advanced Particulate Filters (P100) | 3M | 2291 | Recomended brand. |
| Scissors | VWR | 233-1104 | Preferred scissors may be used. |
| Forceps | VWR | 232-1313 | Preferred forceps may be used. |
| Intramedic PE50 polyethylene tube | BD | 427411 | Recomended brand. |
| Ethicon 2-0 Perma-hand silk tread | VWR | 95056-992 | Recomended brand. |
| 26 ½ gage needle | Alternative suppliers exist. | ||
| 1 ml BD slip-tip syringe, non-sterile |  BD |
301205 | Alternative suppliers exist. |
| 60 ml BD Luer-Lok syringe, non-sterile, polypropolene | BD | 301035 | Alternative suppliers exist. |
| Fluka Hematoxylin-Eosin | Sigma-Aldrich | 3972 | Alternative suppliers exist. |
| Türk's solution | Merck Millipore | 109277 | |
| Table top centrifuge | Alternative manufacturers exist. | ||
| Cytospin 4 cytocentrifuge | Thermo Scientific | A78300003 | Alternative centrifuge can be used. |
| HEMA-3 stat pack | Fisher Scientific | 23-123-869 | Alternative staining kits exists. |
| Formalin solution, neutral buffered, 10% | Sigma-Aldrich | HT501128 | Alternative suppliers exist. |
References
- King, J. D., Kocincova, D., Westman, E. L., Lam, J. S. Review: Lipopolysaccharide biosynthesis in Pseudomonas aeruginosa. Innate Immun. 15, 261-312 (2009).
- Grommes, J., Soehnlein, O. Contribution of neutrophils to acute lung injury. Mol Med. 17, 293-307 (2011).
- Pesci, A., et al. Inflammatory cells and mediators in bronchial lavage of patients with chronic obstructive pulmonary disease. Eur Respir J. 12, 380-386 (1998).
- Hoogerwerf, J. J., et al. Lung Inflammation Induced by Lipoteichoic Acid or Lipopolysaccharide in Humans. Am. J. Respir. Crit. Care Med. 178, 34-41 (2008).
- Scheuchenzuber, W. J., Eskew, M. L., Zarkower, A. Comparative humoral responses to Escherichia coli and sheep red blood cell antigens introduced via the respiratory tract. Exp Lung Res. 13, 97-112 (1987).
- Asti, C., et al. Lipopolysaccharide-induced lung injury in mice. I. Concomitant evaluation of inflammatory cells and haemorrhagic lung damage. Pulm Pharmacol Ther. 13, 61-69 (2000).
- Brand, P., et al. Total deposition of therapeutic particles during spontaneous and controlled inhalations. Journal of pharmaceutical sciences. 89, 724-731 (2000).
- Liu, F., Li, W., Pauluhn, J., Trubel, H., Wang, C. Lipopolysaccharide-induced acute lung injury in rats: comparative assessment of intratracheal instillation and aerosol inhalation. Toxicology. 304, 158-166 (2013).
- Skerrett, S. J., et al. Role of the type 1 TNF receptor in lung inflammation after inhalation of endotoxin or Pseudomonas aeruginosa. American Journal of Physiology - Lung Cellular and Molecular Physiology. 276, L715-L727 (1999).
- Roos, A. B., et al. Lung epithelial-C/EBPbeta contributes to LPS-induced inflammation and its suppression by formoterol. Biochem Biophys Res Commun. 423, 134-139 (2012).
- Didon, L., et al. Lung epithelial CCAAT/enhancer-binding protein-beta is necessary for the integrity of inflammatory responses to cigarette smoke. Am J Respir Crit Care Med. 184, 233-242 (2011).
- Silverpil, E., et al. Negative feedback on IL-23 exerted by IL-17A during pulmonary inflammation. Innate Immunity. 19, 479-492 (2013).
- Mercer, P. F., et al. Proteinase-Activated Receptor-1, CCL2 and CCL7 Regulate Acute Neutrophilic Lung Inflammation. American Journal of Respiratory Cell and Molecular Biology. , (2013).
- Korkmaz, B., Horwitz, M. S., Jenne, D. E., Gauthier, F. Neutrophil Elastase, Proteinase 3, and Cathepsin G as Therapeutic Targets in Human Diseases. Pharmacological Reviews. 62, 726-759 (2010).
- Bafadhel, M., et al. Acute Exacerbations of COPD: Identification of Biological Clusters and Their Biomarkers. Am. J. Respir. Crit. Care Med. , 201104-200597 (2011).
- Hurst, J. R., Perera, W. R., Wilkinson, T. M. A., Donaldson, G. C., Donaldson, G. C., Wedzicha, G. C. Systemic and Upper and Lower Airway Inflammation at Exacerbation of Chronic Obstructive Pulmonary. Am. J. Respir. Crit. Care Med. 173, 71-78 (2006).
- Rabe, K. F., et al. Global Strategy for the Diagnosis, Management, and Prevention of Chronic Obstructive Pulmonary Disease: GOLD Executive Summary. Am. J. Respir. Crit. Care Med. 176, 532-555 (2007).
