Summary
Vi beskriver en fremgangsmåde til at inducere neutrofil pulmonal inflammation ved udfordring aerosoliseret lipopolysaccharid ved forstøvning, at modellere akut lungeskade. Desuden er grundlæggende kirurgiske teknikker til lunge isolation, tracheal intubation og bronchoalveolær lavage også beskrevet.
Abstract
Akut lungeskade (ALI) er en alvorlig sygdom karakteriseret ved alveolær neutrofili, med begrænsede behandlingsmuligheder og høj dødelighed. Eksperimentelle modeller af ALI er nøglen til at øge vores forståelse af sygdommen patogenese. Lipopolysaccharid (LPS) fra gram-positive bakterier inducerer neutrofil inflammation i luftvejene og lungeparenkym af mus. Effektiv pulmonal levering af forbindelser, såsom LPS er imidlertid vanskeligt at opnå. I den fremgangsmåde der er beskrevet her, er pulmonal tilførsel i mus opnås ved udfordring for aerosoliseret Pseudomonas aeruginosa LPS. Opløst LPS blev aerosoliseret af en forstøver forbundet til trykluft. Mus blev udsat for en kontinuerlig strøm af LPS aerosol i en plexiglas kasse i 10 minutter, efterfulgt af 2 minutters konditionering efter aerosolen blev afbrudt. Trakealintubation og efterfølgende bronchoalveolær lavage, efterfulgt af formalin perfusion blev dernæst udført, hvilket tillader karakterisering af den sterile pulmonary inflammation. Aerosoliseret LPS genererer en pulmonal inflammation karakteriseret ved alveolær neutrofili, detekteret i bronchoalveolær udskylning og histologisk vurdering. Denne teknik kan sættes op på en lille pris med få apparater, og kræver minimal træning og ekspertise. Eksponeringen Systemet kan således rutinemæssigt på ethvert laboratorium, med potentiale til at øge vores forståelse af lunge patologi.
Introduction
Lipopolysaccharid (LPS) er en cellevægsbestanddel af gramnegative bakterier 1. Challenge LPS er en veldokumenteret model for akut lungeskade, et syndrom karakteriseret ved akut neutrofil inflammation og ødem 2. Desuden pulmonal neutrofili er også et kendetegn for kronisk obstruktiv lungesygdom (COPD) 3, og LPS-provokationen i mennesker er blevet anvendt til at modellere KOL forværringer 4. Således eksperimentelle modeller af LPS eksponering er klinisk relevante og værdifulde værktøjer til at forstå den menneskelige patologi.
Formålet med den pulmonale levering af aerosoliserede LPS beskrevet her er at generere en neutrofil inflammatorisk respons i den ledende og luftvejene, uden systemisk involvering. Adskillige teknikker til LPS-provokationen er blevet beskrevet tidligere. Intravenøs injektion af LPS er den mest almindeligt anvendte indgivelsesvej. Selv om denne teknik er let tilgængelig, than primære skade på endotelet, med sekundær ødelæggelse af lungeepitelet efter neutrofil migration til lungen. Intravenøs administration inducerer også systemisk inflammation 2, som kan komplicere det kliniske billede i dyremodeller. Systemisk inflammation er i modsætning ikke observeret med intratracheal administration. Denne teknik er imidlertid arbejdskrævende og kræver anæstesi samt en betydelig træning 5, 6. Desuden pulmonal deposition af denne administrationsvej afhænger af vejrtrækning 7. Således lungeaflejring påvirket af dybden af bedøvelse er nødvendige for kan observeres intra administration luftrør og variabel aflejring i luftvejene. I modsætning hertil pulmonal levering med aerosoliserede LPS kræver minimal træning, og kan let opnås på et stort antal dyr med lille eller ingen variation mellem individer 5, 8.En nylig undersøgelse viser, at aerosol levering er overlegen i forhold til intratracheal rute med hensyn til aflejring, og at mere relevante doser af LPS inducerer neutrofil inflammation med denne model 8.
Tidligere undersøgelser har vist, at udfordring for aerosoliseret Pseudomonas aeruginosa LPS genererer en markant inflammatorisk reaktion i luftvejslumen og lungeparenkym, herunder alveolære rum 9, 10. Inflammationen er kendetegnet ved en overvægt af neutrofiler og tilstedeværelsen af lungeødem, og kan således anvendes til at behandle patogenesen af akut lungeskade og få yderligere kendskab til de mekanismer, der bidrager til sygdommen patologi.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Undersøgelserne dyr blev godkendt af Nordlige Stockholm dyrevelfærd etiske udvalg. De eksperimentelle procedurer blev udført i overensstemmelse med den svenske lovgivning.
1. Generering en LPS Aerosol
- 0,5 g oprenset P. Opløs aeruginosa LPS i 50 ml sterilt saltvand under forsigtig omrøring og kontrollere opløsning. Fortyndes 1 ml opløst LPS i 9 ml sterilt saltvand til en slutkoncentration på 1 mg / ml. Beskyt mod lys med alufolie og opbevares ved -20 ° C.
- Optø solubiliserede LPS i mørke ved stuetemperatur og bland godt umiddelbart før brug.
- I et ventileret niveau II biohazard hætte, indsætte en rød indløb ind i en forstøver, og tilslut forstøveren til tryk rumluft via slangen, som fabrikanten (revision ordning præsenterer de eksperimentelle enheder i figur 1).
ADVARSEL: egnede personlige værnemidler, herunder en halv ansigt stykke genanvendelige respirateller med partikelfiltre, beskyttelsesbriller, handsker og beskyttende klæder skal bruges i løbet af eksponeringen.
Figur 1:. Skematisk fremstilling af de eksperimentelle udstyr til generering af en aerosol indløbet af forstøveren er forbundet til en luftforsyning. Udløbet af forstøveren først forbundet til et flowmeter via et 15,9 mm rør, og et luftfilter, og lufttilførsel justeres til 5,0 L / m ved 2 kbar tryk. Udløbet er næste forbundet med en plexiglas kasse forsynet med aftagelige låg og 5 mm huller for at forhindre trykopbygning.
- Tilslut udløb forstøveren til en massestrømmåler via et luftfilter. Slut massestrømmåler til en elektrisk forsyning.
- Juster lufttilførslen til 5 L / min, med tryk forbliver på 1,0-2,0 bar.
- Fjern massestrømmåler ogAfbryd lufttilførslen.
- Slut udløb forstøveren til en 15,9 mm rør, der forgrener og opretter forbindelse til to plexiglas kasser med dimensionerne: 150 x 163 x 205 mm, monteret med aftagelige låg. Hver kasse bør have en 5 mm hul i siden modstående indløbet, for at forhindre trykopbygning.
- Placer op til 5 mus i hver plexiglas kasse og lukke lågene.
- Åbn forstøveren og fylde indsatsen med mindst 4 ml LPS opløst i sterilt saltvand eller vehikel alene (sterilt saltvand; volumen bør ikke overstige 8 ml). Tilslut indløbet til lufttilførslen.
- Lad aerosol til at strømme ind i den lukkede plexiglas kasser til 10 min. Overvåg dyrene kontinuerligt. Sørg for, at lufttilførslen er stramt fastgjort til indløbet af forstøveren.
- Afbryd lufttilførslen. Med lukket låg, lad dyrene forbliver i plexiglas kasser i 2 min.
- Åbn låg og tillader aerosolen at dispergere, og returnere dyrene til than bure. Hvis dyrene vises våd, placere burene på en varmepude indstillet til lav varme, for at forhindre hypotermi.
- Overvåg dyrene kontinuerligt for de første 30 min, og derefter hver 2. time i de første 6 timer. Dyrene skal udvise normal respiratorisk mønster og aktiviteten under og efter forstøvning procedure.
2. Bronchoalveolar lavage (BAL)
- Ved den eksperimentelle slutpunkt, dybt bedøver dyrene med isofluran til virkning som anbefalet af din institutions veterinære personale. Klem bagpoten at kontrollere, om en tilbagetrækning refleks for at sikre tilstrækkelig dybde af bedøvelse at foretage en større operation. Spray ned pelsen af dyrene med 70% ethanol.
- Åbn maven med en saks, og skille de aorta til exsanguinate dyret. Læg et stykke væv over maven til at opsuge blodet.
- Follwing eutanasi, bruge en enkelt anterior-posterior snit af en saks til ateksponere brystkassen. Løft brystkassen ved den forreste spids af brystbenet og bruge saks til at punktere membranen på det mest ventrale punkt, uden at skære ind i nogen lungelap. Åbn brystkassen ved at to snit i anterior-posterior retning (møde under kæben).
- Træk forsigtigt fra hinanden brystkassen med pincet, og skære luftrøret under strubehovedet.
- Løft luftrøret med pincet og fjern lungerne ved at skære ledbånd forbinder lapper til brysthulen, og forsigtigt at trække i fedtvæv og hjertevæv.
- Indsæt en polyethylen rør (indvendig diameter: 0,58 mm udvendig diameter: 0,965 mm) ind i luftrøret og fastgør røret med en perlerække af silketråd.
- Bind off multilobe (de fire kamre af højre lunge) med silketråd.
- Sæt en 23 gauge nål ind i røret polyethylen og langsomt injiceres 250 pi iskold steril PBS i det indre lap med en 1 ml sprøjte.
- Trykke forsigtigt lungerne30 gange og opsamle væsken gennem sprøjten. Gentag proceduren med 200 pi PBS (ca. 300 pi PBS skulle kræves tilbagebetalt af enkelt lap fra den samlede injicerede volumen på 450 pi).
- Hold bronkoalveolærvaskevæsken (BALF) på is eller opregne de BAL celler straks. Tæl cellerne med en heamocytometer, ved hjælp af Turk løsning at farve cellerne 11. Beregn den totale celleantal ved at multiplicere antallet af celler med fortyndingsfaktoren for farvningsopløsning og det volumen i tælles inden for heamocytometer.
- Forbered differential celletal fra cytocentrifuged celler som beskrevet andetsteds 11.
3. formalinfiksering af lungevæv til histologisk vurdering
- Fjern multilobe og snap-freeze på tøris. Opbevares ved -80 ° C.
- Monter en 60 ml sprøjte med fjernet på en metal støtteben stemplet. Fyld sprøjten med 10% formalin tilhøjden af 20 cm over laboratoriebordet, der repræsenterer 20 cm konstant tryk.
- Tilslut 23 gauge nål fastgjort til luftrøret til 60 ml sprøjte via et plastrør med en ventil til at styre strømmen af formalin.
- Insufflat lunge lap med formalin i 5 minutter. Afbryd nålen og fjern den sammen med polyethylen rør fra luftrøret, mens du trækker på silketråd at lukke luftrøret og fastholde trykket i lungerne.
- Nedsænkes lungelap i formalin og løse i 24 timer ved 4 ° C.
- Vask fikseret væv tre gange i mindst 20 minutter med 70% ethanol, og dehydrere at xylen gennem følgende regime (1 time hver):
- 3x 70% ethanol
- 3x 95% ethanol
- 3x 100% ethanol
- 3x xylen
- 1x (flydende) paraffin
- Indlejre dehydreret væv i paraffin, skåret i 4-5 um snit, og pletten med hematoxylin og eosin for at tillade histologisk vurdering.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Udfordring til aerosoliseret P. aeruginosa LPS giver normalt en markant inflammatorisk reaktion i luftvejslumen og alveolære rum, kendetegnet ved en overvægt af neutrofiler på både tidlige og sene tidspunkter.
Aerosoliseret LPS inducerer pulmonal neutrofili
C57BL / 6by og BALB / c-mus blev udsat for aerosoliseret P. aeruginosa LPS eller alene køretøjet og neutrofiler blev optalt i BALF. Det samlede celleantal i BALF af C57BL / 6by mus udsat for en aerosol frembragt med vehikel alene er typisk omkring eller under 200.000 celler og cellerne består af 95-100% mononukleære celler, med kun få lymfocytter (0,5-5%) og ingen neutrofiler i BALF (figur 2A-C). Mus udfordret med aerosoliseret LPS udviser en øget total celle nummer i BALF, typisk> 500.000 celler efter 6 timer. Den celleinfiltrater fortsat høj efter 24 timer. Den cellulære profil i BALF forskydes mod apredominance af neutrofiler (80-95%) efter LPS eksponering (figur 2B og C).
Figur 2:. Pulmonal neutrofili i C57BL / 6by mus udfordret med 1 mg / ml aerosoliseret LPS C57BL / 6by mus blev udsat for 1 mg / ml aerosoliseret P. aeruginosa LPS eller vehikel (saltvand, hvid bar) alene i 10 min. Bronchoalveolar lavage (BAL) blev udført efter 6 timer eller 24 timer, og leukocytter blev optalt i BAL fluid (BALF). (A) Samlet celleantal (TCN), (B) neutrofiler, og (C) mononukleære celler (MNC) i BALF. Signifikante forskelle blev analyseret ved anvendelse af ikke-parrede t-tests. n = 3-4, * angiver p <0,05, ** angiver p <0,01.
Der observeres en tilsvarende stigning i inflammatoriske celler i BALF i LPS-udfordrede BALB / c-mus (figur 3A (figur 3B og C).
Figur 3:. Pulmonal neutrofili i BALB / c-mus udfordret med 1 mg / ml aerosoliseret LPS BALB / c-mus blev udsat for 1 mg / ml aerosoliseret P. aeruginosa LPS eller vehikel (saltvand, hvid bar) alene i 10 min. Bronchoalveolar lavage (BAL) blev udført efter 6 timer eller 24 timer, og leukocytter blev optalt i BAL fluid (BALF). (A) Samlet celleantal (TCN), (B) neutrofiler, og (C) mononukleære celler (MNC) i BALF. Signifikante forskelle blev analyseret ved anvendelse af ikke-parrede t-tests. n = 3, ** angiver p <0,01, *** angiver p <0,001.
Tilsvarende inflammatorisk celle profil en d pulmonal neutrofili observeres med forstøvning af 5 mg / ml LPS (figur 4A-C) og ved intranasal levering af LPS, som tidligere rapporteret 12,13.
Figur 4:. Pulmonal neutrofili i BALB / c-mus udfordret med 5 mg / ml aerosoliseret LPS BALB / c-mus blev udsat for 5 mg / ml aerosoliseret P. aeruginosa LPS eller vehikel (saltvand, hvid bar) alene i 10 min. Bronchoalveolar lavage (BAL) blev udført efter 24 timer, og leukocytter blev optalt i BAL fluid (BALF). (A) Samlet celleantal (TCN), (B) neutrofiler, og (C) mononukleære celler (MNC) i BALF. Signifikante forskelle blev analyseret ved anvendelse af ikke-parrede t-tests. n = 3, *** angiver p <0,001.
Pulmonal lokalisering af neutrofiler i LPS-udfordrede
Indholdsproduktion "> Neutrofiler er observeret i epiteliale submucosa, samt rum, der omgiver de ledende luftveje og blodkar i LPS-udfordrede mus (figur 5). Dispergerede neutrofiler er også påvist i parenkym og alveolære region.
Figur 5:. Pulmonal lokalisering af neutrofiler i LPS-udfordrede mus hematoxylin og eosin-farvning af formalin-fikseret lungevæv fra (A) C57BL / 6by mus udsat for vehikel alene eller (B) 1 mg / ml aerosoliserede LPS aflivet efter 6 timer eller (C) 24 timer. Arrow angiver en neutrofil. Bar indikerer 200 um. Klik her for at se en større udgave af dette tal.
Concentration af neutrofile kemoattraktanter i BALF
Det totale proteinindhold i BALF af LPS-udfordrede mus, sammenlignet med mus udsat for saltvand (figur 6). Desuden er det udtryk for neutrofile kemoattraktanter chemokinet (CXC motiv) ligander (CXCL) 1 og CXCL2 steg i LPS-udfordrede mus 10 (figur 7A og B).
Figur 6:. Øget total proteinkoncentration i bronkoalveolærvaskevæsken (BALF) af LPS-udfordrede C57BL / 6by mus totale proteinindhold i BALF fra mus udfordret til 1 mg / ml aerosoliserede LPS eller udsat for vehikel (saltvand, hvid bar) alene var målt ved spektrofotometrisk analyse. Signifikante forskelle blev analyseret ved anvendelse af ikke-parrede t-tests. n = 3-4, ** angiver p <0,01.
Figur 7: Jeg ncreased ekspression af CXCL1 og CXCL2 i bronkoalveolærvaskevæsken (BALF) af LPS-udfordrede mus Ekspression af (A) CXCL1 og (B) CXCL2 i BALF fra mus udfordret til 1 mg / ml aerosoliserede LPS eller udsættes for køretøjet. (saltvand, hvid bar) alene kvantificeret ved ELISA. Signifikante forskelle blev analyseret ved anvendelse af ikke-parrede t-tests. n = 3.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Aerosoliseret LPS genererer et inflammatorisk respons i luftvejene, kendetegnet ved, neutrofiler i epitel submucosa, rum omkring de ledende luftveje, samt de alveolære rum. Dette er, sammen med den øgede totale proteinindhold i BALF, indikerer plasmalækage, repræsentant for patologien af akut lungeskade. Som LPS inducerer en steril inflammation, reaktionen er uafhængig af det adaptive immunrespons, og der er begrænsninger for relevans for bakterielle infektioner. Teknikken kan dog anvendes til at dissekere inflammatoriske mekanismer ved at udelukke adaptive immunresponser.
Selvom metode er enkel og let tilpasses til at besvare forskellige videnskabelige spørgsmål, valg af forstøver og slanger er kritisk. Aflejring af LPS og deraf neutrofili skal valideres med fjorde, forstøvere og slanger undtagen hvad der er beskrevet her. Som mindre almindelige mus stregnskyl kan vise forskellige reaktioner på LPS, bør bestemmes optimale doser af LPS for hver stamme. Desuden neutrofil inflammation frembragt med aerosoliserede LPS er sammenlignelig med inflammation induceret ved intranasal levering af LPS, som observeret af andre 12, 13. Selv intranasal administration let udføres den metode kræver anæstesi og kan potentielt indføre den mikrobielle flora i næsehulen til lungerne, som næsehulen er ikke steril og teknikken kræver en stor mængde af køretøjet.
Ud over den relevans for akut lungeskade, kan teknikken videreudvikles til at omfatte flere udfordringer med aerosoliserede LPS. Metoden kan således anvendes til at studere patogene mekanismer i kronisk inflammation af KOL, der er forbundet med vedvarende neutrofili 14, sammen med tilbagevendende bakterieinfektioner eller permanent mikrobiel kolonisering
Udfordring med aerosoliserede LPS kan sættes op på en lille pris med få apparater og kræver minimal træning. Endvidere teknikken kan således rutinemæssigt i stor skala på et laboratorium, med lille eller ingen variation mellem individer og er derfor overlegen i forhold til andre former for pulmonal levering.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Abraham Roos har modtaget en foredragsholder gebyr fra Boehringer Ingelheim, rejselegater fra AstraZeneca R & D og en forskningsbevilling fra AstraZeneca FoU. Magnus Nord er en fuld tid medarbejder i AstraZeneca R & D og har modtaget forskningsmidler fra AstraZeneca FoU. Johan Grunewald og Tove Berg er co-efterforskere på en ubeslægtet forskningsprojekt finansieret af AstraZeneca F & U.
Acknowledgments
Vi vil gerne takke Kerstin Thim (AstraZeneca, Lund, Sverige), Benita Dahlberg og Dr. Anders Eklund (Karolinska Instituttet, Stockholm, Sverige) samt Dr. Martin Stampfli (McMaster University, Hamilton, ON, Canada) for dygtige assistance og ekspertrådgivning.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Purified Pseudomonas aeruginosa LPS | Sigma-Aldrich | Harmful. Recomended purification. LPS purified from other bactria may be used. | |
| Pari LC sprint star nebulizer | PARI Respiratory Equipment Inc. | 023G1250 | |
| TSI mass flowmeter 4040 | TSI | 4040 | Alternative product from supplier may be used. |
| Saint-Gobain 15.9 mm Tygon tube | Sigma-Aldrich | Z685704 | Recomended brand. |
| Plexiglas boxes with removable lids | Custom built | N/A | 150 x 163 x 205 mm (a 2 mm hole on the side). |
| 3M Half Facepiece Reusable Respirator | 3M | 7503 | Recomended brand. |
| 3M Advanced Particulate Filters (P100) | 3M | 2291 | Recomended brand. |
| Scissors | VWR | 233-1104 | Preferred scissors may be used. |
| Forceps | VWR | 232-1313 | Preferred forceps may be used. |
| Intramedic PE50 polyethylene tube | BD | 427411 | Recomended brand. |
| Ethicon 2-0 Perma-hand silk tread | VWR | 95056-992 | Recomended brand. |
| 26 ½ gage needle | Alternative suppliers exist. | ||
| 1 ml BD slip-tip syringe, non-sterile |  BD |
301205 | Alternative suppliers exist. |
| 60 ml BD Luer-Lok syringe, non-sterile, polypropolene | BD | 301035 | Alternative suppliers exist. |
| Fluka Hematoxylin-Eosin | Sigma-Aldrich | 3972 | Alternative suppliers exist. |
| Türk's solution | Merck Millipore | 109277 | |
| Table top centrifuge | Alternative manufacturers exist. | ||
| Cytospin 4 cytocentrifuge | Thermo Scientific | A78300003 | Alternative centrifuge can be used. |
| HEMA-3 stat pack | Fisher Scientific | 23-123-869 | Alternative staining kits exists. |
| Formalin solution, neutral buffered, 10% | Sigma-Aldrich | HT501128 | Alternative suppliers exist. |
References
- King, J. D., Kocincova, D., Westman, E. L., Lam, J. S. Review: Lipopolysaccharide biosynthesis in Pseudomonas aeruginosa. Innate Immun. 15, 261-312 (2009).
- Grommes, J., Soehnlein, O. Contribution of neutrophils to acute lung injury. Mol Med. 17, 293-307 (2011).
- Pesci, A., et al. Inflammatory cells and mediators in bronchial lavage of patients with chronic obstructive pulmonary disease. Eur Respir J. 12, 380-386 (1998).
- Hoogerwerf, J. J., et al. Lung Inflammation Induced by Lipoteichoic Acid or Lipopolysaccharide in Humans. Am. J. Respir. Crit. Care Med. 178, 34-41 (2008).
- Scheuchenzuber, W. J., Eskew, M. L., Zarkower, A. Comparative humoral responses to Escherichia coli and sheep red blood cell antigens introduced via the respiratory tract. Exp Lung Res. 13, 97-112 (1987).
- Asti, C., et al. Lipopolysaccharide-induced lung injury in mice. I. Concomitant evaluation of inflammatory cells and haemorrhagic lung damage. Pulm Pharmacol Ther. 13, 61-69 (2000).
- Brand, P., et al. Total deposition of therapeutic particles during spontaneous and controlled inhalations. Journal of pharmaceutical sciences. 89, 724-731 (2000).
- Liu, F., Li, W., Pauluhn, J., Trubel, H., Wang, C. Lipopolysaccharide-induced acute lung injury in rats: comparative assessment of intratracheal instillation and aerosol inhalation. Toxicology. 304, 158-166 (2013).
- Skerrett, S. J., et al. Role of the type 1 TNF receptor in lung inflammation after inhalation of endotoxin or Pseudomonas aeruginosa. American Journal of Physiology - Lung Cellular and Molecular Physiology. 276, L715-L727 (1999).
- Roos, A. B., et al. Lung epithelial-C/EBPbeta contributes to LPS-induced inflammation and its suppression by formoterol. Biochem Biophys Res Commun. 423, 134-139 (2012).
- Didon, L., et al. Lung epithelial CCAAT/enhancer-binding protein-beta is necessary for the integrity of inflammatory responses to cigarette smoke. Am J Respir Crit Care Med. 184, 233-242 (2011).
- Silverpil, E., et al. Negative feedback on IL-23 exerted by IL-17A during pulmonary inflammation. Innate Immunity. 19, 479-492 (2013).
- Mercer, P. F., et al. Proteinase-Activated Receptor-1, CCL2 and CCL7 Regulate Acute Neutrophilic Lung Inflammation. American Journal of Respiratory Cell and Molecular Biology. , (2013).
- Korkmaz, B., Horwitz, M. S., Jenne, D. E., Gauthier, F. Neutrophil Elastase, Proteinase 3, and Cathepsin G as Therapeutic Targets in Human Diseases. Pharmacological Reviews. 62, 726-759 (2010).
- Bafadhel, M., et al. Acute Exacerbations of COPD: Identification of Biological Clusters and Their Biomarkers. Am. J. Respir. Crit. Care Med. , 201104-200597 (2011).
- Hurst, J. R., Perera, W. R., Wilkinson, T. M. A., Donaldson, G. C., Donaldson, G. C., Wedzicha, G. C. Systemic and Upper and Lower Airway Inflammation at Exacerbation of Chronic Obstructive Pulmonary. Am. J. Respir. Crit. Care Med. 173, 71-78 (2006).
- Rabe, K. F., et al. Global Strategy for the Diagnosis, Management, and Prevention of Chronic Obstructive Pulmonary Disease: GOLD Executive Summary. Am. J. Respir. Crit. Care Med. 176, 532-555 (2007).
