Summary
우리는 급성 폐 손상을 모델링하기 위해, 분무에 의해 에어로졸 리포 폴리 사카 라이드에 도전하여 호중구 폐 염증을 유도하는 방법을 설명합니다. 또한, 폐 격리, 기관 삽관 및 기관지 세척액에 대한 기본적인 수술 기법도 설명되어 있습니다.
Abstract
급성 폐 손상 (ALI)는 제한된 치료 옵션과 높은 사망률과 폐포 호중구을 특징으로하는 심각한 질병이다. ALI의 실험 모델은 질병의 발병 기전에 대한 우리의 이해를 향상의 열쇠입니다. 그람 양성 세균에서 파생 된 리포 폴리 사카 라이드 (LPS)는 호중구기도의 염증과 쥐의 폐 실질을 유도한다. 이러한 LPS와 같은 화합물의 효율적인 폐 전달하지만, 달성하기가 어렵다. 여기에 설명 된 방법에서, 마우스의 폐 전달이 에어로졸 녹농균 LPS 챌린지에 의해 달성된다. 용존 LPS는 압축 공기에 연결되어 에어로졸 분무기로 하였다. 생쥐는 에어로졸이 중단 된 후 2 분 컨디셔닝 한 후, 10 분간 플렉시 유리 상자에 LPS 에어로졸의 연속 흐름 노출시켰다. 포르말린 관류 다음에 기관 삽관 이후 기관지 세척은, 다음 멸균 페이지의 특성을 허용하는 수행 하였다ulmonary 염증. 에어로졸 LPS는 기관지 폐포와 조직 학적 평가에 의해 검출 된 폐포 호중구을 특징으로하는 폐 염증을 생성합니다. 이 기술은 몇 가지 제품으로 작은 비용으로 설정하고, 최소한의 교육과 전문 지식을 필요로 할 수 있습니다. 노광 시스템은 따라서 통상적 폐 병변에 대한 이해를 향상시키기 위해 잠재적으로, 임의의 실험실에서 수행 될 수있다.
Introduction
리포 폴리 사카 라이드 (LPS)는 그람 음성 세균 (1)의 세포벽 성분이다. LPS에 도전 급성 폐 손상, 급성 염증 세포의 침윤 염증과 부종이 특징으로하는 증후군의 잘 문서화 된 모델입니다. 또한, 폐 호중구 또한 COPD 악화 4를 모델링하는데 사용되어 만성 폐쇄성 폐 질환 (COPD) 3, 및 인간에서 LPS 챌린지의 특징이다. 따라서, LPS 노출의 실험 모델은 임상 적으로 인간의 병리를 이해하기 위해 적절하고 가치있는 도구입니다.
여기에 설명 된 에어로졸 LPS의 폐 전달의 목적은 전신 개입 없이도 도통 및 호흡기도에 호중구 염증 반응을 생성하는 것이다. LPS 도전의 여러 기술 이전에 기술되었다. LPS의 정맥 내 주입 투여 가장 일반적으로 사용되는 경로이다. 이 기술에 쉽게 접근 할 수 있지만, t그는 차 손상은 폐에 호중구 마이그레이션 다음 폐 상피 세포의 보조 파괴, 내피이다. 인트라 정맥 투여는 동물 모델에서 임상 사진을 복잡하게 할 수 있습니다 전신 염증이를 유도한다. 전신 염증은 내 기관 관리와 관찰되지 대조적이다. 이 기술은, 그러나, 노동 집약적이며, 마취제뿐만 아니라 상당한 훈련 5, 6을 필요로한다. 또한, 행정이 경로를 통한 폐 침착은 호흡 7에 따라 달라집니다. 따라서, 폐 침착은기도에 내 기관 관리 및 변수 침착이 관찰 될 수 있습니다에 필요한 마취의 깊이에 의해 영향을 받는다. 대조적으로, 에어로졸 화 된 LPS와 폐 전달은 최소한의 훈련을 필요로하며, 쉽게 작은 가진 동물의 다수 또는 개인 5, 8 사이에 편차가없이 달성 될 수있다.최근의 연구는 에어로졸 배달 증착에 관한 내부 기관 노선 우수하다는 및 LPS의 관련성 용량이 모델 8 호중구 염증을 유도 확인합니다.
에어로졸 Psuedomonas aeruginosa의 LPS가 폐포 (9), (10)를 포함하여기도 루멘과 폐 실질, 눈에 띄게 염증 반응을 생성에 이전의 연구는 그 도전을 증명하고있다. 염증은 호중구 폐부종의 존재를 특징으로 우세, 따라서 급성 폐 손상의 기전을 해결하고 질병 병리에 기여하는 메커니즘을 더 지식을 얻기 위해 사용될 수있다.
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Protocol
동물 연구는 북부 스톡홀름 동물 복지 윤리위원회에 의해 승인되었다. 실험 절차는 스웨덴어 법을 준수 하였다.
1. LPS 에어로졸을 생성
- P. 정제 0.5 g을 녹여 부드러운 교반과 함께 50 ml의 멸균 식염수에 aeruginosa의 LPS 및 용해를 확인합니다. 1 mg / ml의 최종 농도로, 9 ml의 멸균 식염수에 용해하여 LPS를 1 mL로 희석. -20 ° C에서 알루미늄 호일과 가게와 빛으로부터 보호합니다.
- 실온에서 어두운 가용화 LPS를 사용하기 전에 해동하고 즉시 잘 혼합한다.
- 환기 수준 II 생물 학적 후드에서 분무기에 붉은 입구를 삽입하고, 제조업체 (그림 1의 실험 장치를 제시 검토 방식)에 의해 제공되는 튜브를 통해 가압 실내 공기에 분무기를 연결합니다.
주의 : 적절한 개인 보호 장비, 반 얼굴 조각 재사용 respirat 포함또는 미립자 필터, 고글, 장갑, 보호 의복 노광의 과정 동안 사용되어야한다.
도 1 :. 에어로졸을 생성하기 위해 사용되는 실험 장치의 개략도 표현은 에어로졸 생성기의 입구는 공기 공급 장치에 연결된다. 분무기의 출구는 제 15.9 mm 튜브와 공기 필터 및 공기 공급을 통해 유량계에 연결되어 2 kbar 압력 5.0 L / m으로 조절된다. 출구 이동식 뚜껑과 압력 증가를 방지하기 위해 5mm 구멍에 끼워 플렉시 박스 옆으로 접속된다.
- 에어 필터를 통해 질량 유량계에 분무기의 출구를 연결합니다. 전기 공급 장치에 질량 유량계를 연결합니다.
- 1.0 ~ 2.0 바에서 남은 압력, 5 L / min으로 공기 공급을 조정합니다.
- 질량 유량계를 제거하고공기 공급 장치를 분리합니다.
- 150 X 163 X 205mm, 이동식 뚜껑 장착 : 분기합니다 및 치수 두 플렉시 유리 상자에 연결하는 15.9 mm 튜브에 분무기의 출구를 연결합니다. 각 박스에는 압력 증가를 방지하기 위해 입구 대향 측 5mm 구멍을 가져야한다.
- 각 플렉시 유리 상자에 5 마우스까지 올려 놓고 뚜껑을 닫습니다.
- 분무기를 열고 단독으로 멸균 식염수 또는 차량에 용해 최소 4 ML의 LPS로 삽입을 채우기 (멸균 식염수를, 볼륨 8 ml의를 초과 할 수 없습니다). 공기 공급 장치의 입구를 다시하는 것은 연결합니다.
- 에어로졸은 10 분 동안 폐쇄 플렉시 글라스 상자에 흐르게. 지속적으로 동물을 모니터링합니다. 반드시 공기 공급이 분무기의 입구에 단단히 고정되어있는 상태 확인합니다.
- 공기 공급 장치를 분리합니다. 뚜껑이 닫힌 상태에서, 동물이 2 분 동안 플렉시 유리 상자에 남아있을 수 있습니다.
- 뚜껑을 열고 에어로졸 분산 할 수 있도록하고, T로 동물을 반환그는 케이지. 동물 젖은 나타날 경우 저체온증을 방지하기 위해, 저 발열로 설정 가열 패드에 새장을 배치합니다.
- 처음 30 분 동안 연속적으로 동물을 모니터링하고, 상기 제 6 시간 동안, 그 후 매 2 시간. 동물 중 및 분무 과정을 거친 후 정상적인 호흡 패턴 및 활동을 전시한다.
2. 기관지 폐포 세척 (BAL)
- 교육 기관의 수의 직원에서 권장하는 실험 종료 시점에서, 깊이 효과에 이소 플루 란과 동물을 마취. 큰 수술을 실시 마취의 충분한 깊이를 보장하기 위해 철수 반사를 확인하기 위해 뒷발을 꼬집어. 70 % 에탄올과 동물의 모피를 스프레이.
- 가위를 사용하여 복부를 열고 동물에게서 피를 뽑다하는 대동맥을 절단. 혈액을 흡수하기 위해 복부를 통해 조직의 조각을 놓습니다.
- 안락사를 follwing을하기에 가위 하나의 전후방 컷을 사용가슴 노출. 흉골의 앞쪽 끝으로 흉곽을 들어 올려 모든 폐 엽으로 절단하지 않고, 대부분의 복부 지점에서 다이아 프램에 구멍에 가위를 사용합니다. 전후방 방향으로 두 컷 (턱 아래 회의)하여 흉곽을 엽니 다.
- 부드럽게 집게를 사용하여 흉곽 떨어져 당겨, 그리고 후두 아래의 기관을 잘라.
- 집게로기도를 들어 올려 흉강에 로브를 연결하는 인대를 절단하고 부드럽게 지방과 심장 조직에 의해 당겨 폐를 제거합니다.
- 폴리에틸렌 관 (: 0.58 mm, 외경, 내경 0.965 mm)를 넣 기관에 및 실크 스레드의 문자열로 튜브를 고정합니다.
- 실크 스레드와 multilobe (우측 폐의 네 로브)를 묶어.
- 폴리에틸렌 튜브에 23 게이지 바늘을 삽입하고 천천히 1 ML의 주사기와 단일 로브에 얼음처럼 차가운 멸균 PBS의 250 μl를 주입.
- 조심스럽게 폐를 누릅니다30 시간과 주사기를 통해 액체를 수집합니다. 200 μL PBS와 절차를 반복합니다 (약 300 μl의 PBS 450 μL의 총 주입 볼륨에서 하나의 로브에서 복구해야합니다).
- 얼음에 기관지 세척액 (BALF)을 유지, 또는 즉시 BAL 세포를 열거합니다. 전지 (11)를 염색 터크 용액을 사용하여 세포 heamocytometer 카운트. 염색 액의 희석 배수와 heamocytometer의 카운트 필드 내의 부피 세포 수를 곱하여 총 세포 수를 계산한다.
- 다른 11 설명 된대로 cytocentrifuged 세포에서 차동 세포 수를 준비합니다.
조직 학적 평가를위한 폐 조직의 3 포르말린 고정
- multilobe를 제거하고 스냅인 동결을 드라이 아이스에. -80 ° C에서 보관하십시오.
- 금속 지지대에 제거 플런저와 60 ML의 주사기를 탑재합니다. 10 % 포르말린에와 주사기를 채우일정한 압력의 20cm를 나타내는 실험실 벤치 위에 20cm의 높이.
- 포르말린의 흐름을 제어하는 밸브가 플라스틱 튜브를 통해 60 ml의 시린지에 고정 기관지 23 게이지 바늘을 연결한다.
- 5 분 동안 포르말린 폐 엽 Insufflate. 바늘을 분리하고 실크 스레드에서 당기는 기관을 닫고 폐의 압력을 유지하면서 기관에서 폴리에틸렌 튜브를 함께 제거합니다.
- 포르말린 폐 엽 잠수함 4 ° C에서 24 시간 동안 수정.
- 70 % 에탄올로 적어도 20 분 동안 고정 된 조직을 세 번 씻은 다음, 다음 처방 (1 시간마다)를 통해 탈수 크실렌 :
- 3X 70 % 에탄올
- 3X 95 % 에탄올
- 3X 100 % 에탄올
- 3 배 크실렌
- 1 배 (액체) 파라핀
- 헤 마톡 실린 및 에오신에 포함 탈수 4-5 μm의 섹션으로 잘라 파라핀 조직, 얼룩은 조직 학적 평가를 허용합니다.
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Representative Results
에어로졸 P.에 도전 aeruginosa의 LPS는 보통 초기와 후기 시점에서 모두 우위 호중구 특징으로기도 내강 및 치조 공간에서 표시된 염증 반응을 산출한다.
에어로졸 LPS는 폐 호중구을 유도
C57BL / 6by 및 BALB / C 마우스에게 에어로졸 화 된 P. 노출시켰다 aeruginosa의 LPS 또는 단독으로 차량과 호중구가 폐포 세척액에 열거 하였다. C57BL 차량 생성 에어로졸에 노출 / 6by 마우스의 BALF의 총 세포 수는 단지 일반적으로 약 20 만 세포 이하와 셀은 몇 림프구 (0.5-5 %)과, 95-100% 단핵 세포로 구성하고, 폐포 세척액에는 호중구 없다 (그림 2A-C). 마우스는 6 시간 후, 에어로졸 LPS 전시와 함께 일반적으로> 50 세포를 폐포 세척액에서 증가 된 총 세포 수에 도전했다. 세포 침윤은 24 시간 후 높은 남아있다. 폐포 세척액의 세포 프로파일은 AP쪽으로 이동LPS 노출 (그림 2B 및 C) 다음 호중구 (80-95%)의 redominance.
그림 2 :. 1 ㎎ / ㎖ 에어로졸 LPS C57BL / 6by 마우스에 도전 C57BL / 6by 생쥐의 폐 호중구가 1 mg의 노출 / ml의 P.를 에어로졸 aeruginosa의 LPS 또는 단독으로 10 분 동안 차량 (식염수, 흰색 막대). 기관지 폐포 세척액 (BAL)을 6 시간 또는 24 시간 후에 수행하고, 백혈구는 BAL 액 (BALF)에 열거 하였다. (A) 전체 셀 번호 (TCN), (B) 호중구, 및 (C) 단핵 세포 (MNC)에 BALF. 유의 한 차이는 않은 쌍 t-테스트를 사용하여 분석 하였다. N = 3-4, *, P <0.05를 나타내고 ** P <0.01를 나타냅니다.
폐포 세척액에서 염증 세포의 비교 증가 LPS-도전 BALB / c 마우스에서 관찰된다 (그림 3A (도 3b 및 C)에 대등하다.
그림 3 :. 1 ㎎ / ㎖ 에어로졸 LPS와 도전 BALB / c 마우스에서 폐 호중구가 BALB / c 마우스 1 mg의 노출 / ml의 P.를 에어로졸 aeruginosa의 LPS 또는 단독으로 10 분 동안 차량 (식염수, 흰색 막대). 기관지 폐포 세척액 (BAL)을 6 시간 또는 24 시간 후에 수행하고, 백혈구는 BAL 액 (BALF)에 열거 하였다. (A) 전체 셀 번호 (TCN), (B) 호중구, 및 (C) 단핵 세포 (MNC)에 BALF. 유의 한 차이는 않은 쌍 t-테스트를 사용하여 분석 하였다. N = 3, **, P <0.01를 나타냅니다 *** P <0.001을 나타냅니다.
유사 염증 세포 프로파일 이전에보고 된 12,13 D 폐 호중구는 5 ㎎ / ㎖ LPS (도 4A-C)의 분무와 LPS의 비내 전달에 의해 관찰된다.
그림 4. 5 ㎎ / ㎖ 에어로졸 LPS와 도전 BALB / c 마우스에서 폐 호중구가 BALB / c 마우스는 5 mg의 노출 / ml의 P.를 에어로졸 aeruginosa의 LPS 또는 단독으로 10 분 동안 차량 (식염수, 흰색 막대). 기관지 폐포 세척액 (BAL)은 24 시간 후에 수행하고, 백혈구는 BAL 액 (BALF)에 열거 하였다. BALF에서 (A) 전체 셀 번호 (TCN), (B) 호중구, 및 (C) 단핵 세포 (MNC). 유의 한 차이는 않은 쌍 t-테스트를 사용하여 분석 하였다. N = 3, *** P <0.001을 나타냅니다.
LPS-도전에서 호중구의 폐 현지화
"ontent> 호중구는 LPS-도전 마우스 (그림 5)의 수행기도와 혈관 주변 공간뿐만 아니라, 상피 점막하 층에서 관찰된다. 분산 된 호중구는 실질과 폐포 지역에서 감지됩니다.
그림 5 :. LPS-도전 마우스에서 호중구의 폐 현지화 (A)에서 포르말린 고정 된 폐 조직의 헤 마톡 실린 및 에오신 염색 C57BL가 / 혼자 차량 또는 (B) 1 mg의 노출 6by 마우스 / ㎖ 에어로졸 LPS는 6 시간 후 희생 또는 (C) 24 시간. 화살표는 호중구를 나타냅니다. 바는 200 μm의를 나타냅니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
CONCENTR폐포 세척액에서 호중구의 화학 유인 물질의 ATION
LPS-도전 쥐의 폐포 세척액에서 총 단백질 함량은 식염수에 노출 된 마우스 (그림 6)에 비해 증가한다. 또한, 호중구의 화학 유인 물질 케모카인 (CXC 모티브) 리간드 (CXCL) 1 CXCL2의 발현은 LPS-도전 마우스 (10) (그림 7a 및 B)에서 증가된다.
그림 6 :. 기관지 세척액 LPS-도전 C57BL / 6by 마우스 (BALF)에서 증가 된 총 단백질 농도 1 ㎎ / ㎖ 에어로졸 LPS에 도전 또는 차량 (식염수, 흰색 막대)에 노출 된 쥐의 폐포 세척액에서 총 단백질 함량은 혼자 분광 분석에 의해 측정 하였다. 유의 한 차이는 않은 쌍 t-테스트를 사용하여 분석 하였다. N = 3-4, ** P <0.01를 나타냅니다.
그림 7 :. 나는 기관지 세척액 LPS-도전 쥐 (BALF) 1 ㎎ / ㎖ 에어로졸 LPS에 도전 쥐의 폐포 세척액에서 (A) CXCL1 및 (B) CXCL2의 발현에 CXCL1 및 CXCL2의 발현을 ncreased 또는 차량에 노출 혼자 ELISA로 정량 (식염수, 흰색 막대). 유의 한 차이는 않은 쌍 t-테스트를 사용하여 분석 하였다. N = 3.
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Discussion
에어로졸은 LPS 상피 점막하 호중구 특징으로기도의 염증 반응을 발생시키고, 전도성기도뿐만 아니라 폐포를 둘러싼 공간. 이것은 함께 혈장 누출, 급성 폐 손상의 병리 대표 나타내는 BALF에서 증가 된 총 단백질 함량으로한다. LPS는 무균 염증을 유도 같이, 반응은 적응성 면역 반응에 독립적이며, 세균 감염에 대한 관련성에 한계가있다. 기술은 그러나 적응 면역 반응을 제외하여 염증 기전을 해부하기 위해 사용될 수있다.
방법은 간단하고 쉽게 다른 과학적인 질문에 대답하기에 적합하지만, 분무기 및 튜브의 선택은 매우 중요하다. LPS 및 결과 호중구의 증착은 여기에 설명 된 것보다 다른 입구, 분무기 및 튜브 유효성을 확인해야합니다. 또한, 덜 일반적인 마우스 성LPS에 다른 응답을 표시 할 수 있습니다 비가, LPS의 최적 용량은 각 변형에 대한 결정되어야한다. 등 (12, 13)에 의해 관측 더욱이, 에어로졸 생성 LPS 염증은 호중구, LPS의 비내 전달에 의해 유도 된 염증과 대등하다. 비강 내 투여가 용이하게 수행되지만, 방법론은 마취제 필요하며 비강 멸균되지 않고, 기술은 차량의 대용량을 필요로 잠재적으로, 폐 비강 미생물 총을 도입 할 수있다.
급성 폐 손상에 대한 관련성에 더하여, 상기 에어로졸 화 기술은 LPS 여러 문제를 포함하기 위해 개발 될 수있다. 방법론은 이와 함께 재발 세균 감염 미생물 군체 또는 영구적으로, 호중구 (14)와 연관된 지속 COPD의 만성 염증에 발병 기전을 연구하기 위해 사용될 수있다
에어로졸 LPS와 도전은 몇 제품과 함께 작은 비용으로 설정하고 최소한의 교육을 필요로 할 수 있습니다. 또한, 기술은 따라서 통상적 개인간 거의 또는 전혀 변형으로, 어떤 실험에서 대규모로 수행 폐 전달의 다른 경로에 따라서 우수하다 할 수있다.
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Disclosures
아브라함 로스는 베링거 인 겔 하임, 아스트라 제네카 R & D와 아스트라 제네카 R & D에서 연구 보조금에서 여행 보조금에서 강사 수수료를 받고있다. 매그너스 노르 아스트라 제네카 R & D의 풀 타임 직원과 아스트라 제네카 R & D에서 연구 보조금을 받았다. 요한 Grunewald는과 토베 버그는 아스트라 제네카 R & D 자금 지원 관련없는 연구 프로젝트에 공동 연구자이다.
Acknowledgments
우리는 숙련 된 지원 커스틴 Thim (아스트라 제네카, 룬드, 스웨덴), 베니 타 달 버그 박사 앤더스 에크 룬드 (카롤린스카 연구소, 스톡홀름, 스웨덴)뿐만 아니라 닥터 마틴 Stampfli (맥 매스터 대학, 해밀턴, ON, 캐나다)에 감사드립니다 및 전문가의 조언.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Purified Pseudomonas aeruginosa LPS | Sigma-Aldrich | Harmful. Recomended purification. LPS purified from other bactria may be used. | |
| Pari LC sprint star nebulizer | PARI Respiratory Equipment Inc. | 023G1250 | |
| TSI mass flowmeter 4040 | TSI | 4040 | Alternative product from supplier may be used. |
| Saint-Gobain 15.9 mm Tygon tube | Sigma-Aldrich | Z685704 | Recomended brand. |
| Plexiglas boxes with removable lids | Custom built | N/A | 150 x 163 x 205 mm (a 2 mm hole on the side). |
| 3M Half Facepiece Reusable Respirator | 3M | 7503 | Recomended brand. |
| 3M Advanced Particulate Filters (P100) | 3M | 2291 | Recomended brand. |
| Scissors | VWR | 233-1104 | Preferred scissors may be used. |
| Forceps | VWR | 232-1313 | Preferred forceps may be used. |
| Intramedic PE50 polyethylene tube | BD | 427411 | Recomended brand. |
| Ethicon 2-0 Perma-hand silk tread | VWR | 95056-992 | Recomended brand. |
| 26 ½ gage needle | Alternative suppliers exist. | ||
| 1 ml BD slip-tip syringe, non-sterile |  BD |
301205 | Alternative suppliers exist. |
| 60 ml BD Luer-Lok syringe, non-sterile, polypropolene | BD | 301035 | Alternative suppliers exist. |
| Fluka Hematoxylin-Eosin | Sigma-Aldrich | 3972 | Alternative suppliers exist. |
| Türk's solution | Merck Millipore | 109277 | |
| Table top centrifuge | Alternative manufacturers exist. | ||
| Cytospin 4 cytocentrifuge | Thermo Scientific | A78300003 | Alternative centrifuge can be used. |
| HEMA-3 stat pack | Fisher Scientific | 23-123-869 | Alternative staining kits exists. |
| Formalin solution, neutral buffered, 10% | Sigma-Aldrich | HT501128 | Alternative suppliers exist. |
References
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