Summary
Vi beskriver en fremgangsmåte for indusering av nøytrofil lungebetennelse ved utfordring for aerosoli lipopolysakkarid ved forstøvning, for å modellere akutt lungeskade. I tillegg er basis kirurgiske teknikker for isolering lunge, trakeal intubasjon og bronkoalveolar lavage også beskrevet.
Abstract
Akutt skade lunge (ALI) er en alvorlig sykdom som kjennetegnes ved alveolar neutrofili, med begrenset behandlingstilbud og høy dødelighet. Eksperimentelle modeller av ALI er nøkkelen i å forbedre vår forståelse av sykdom patogenesen. Lipopolysakkarid (LPS) avledet fra gram-positive bakterier induserer nøytrofil inflammasjon i luftveiene og lunge parenchyma av mus. Effektiv pulmonal levering av forbindelser slik som LPS er imidlertid vanskelig å oppnå. I tilnærmingen som beskrives her, er pulmonal levering i mus oppnås ved utfordring til aeroPseudoMonas aeruginosa LPS. LPS ble oppløst aerosoliseres ved hjelp av en forstøver som er koblet til trykkluft. Mus ble utsatt for en kontinuerlig strøm av LPS aerosol i en pleksiglassboks i 10 minutter, etterfulgt av 2 minutter kondisjonering etter at aerosolen ble avbrutt. Trakeal intubasjon og påfølgende bronkoalveolar lavage, fulgt av formalin perfusjon ble deretter utført, noe som gjør det mulig for karakterisering av den sterile pulmonary betennelse. Aerosoliseres LPS genererer en lungebetennelse preget av alveolar neutrofili, oppdaget i bronchoalveolar kylling og ved histologisk vurdering. Denne teknikken kan settes opp på en liten kostnad med noen apparater, og krever minimalt med opplæring og kompetanse. Eksponeringssystemet kan dermed gjennomføres rutinemessig på noe laboratorium, med potensial til å forbedre vår forståelse av lunge patologi.
Introduction
Lipopolysakkarid (LPS) er en celleveggkomponent av gramnegative bakterier 1. Utfordring til LPS er en veldokumentert modell av akutt lungeskade, et syndrom karakterisert ved akutt nøytrofil inflammasjon og ødem 2. I tillegg er lunge neutrofili også et kjennetegn på kronisk obstruktiv lungesykdom (KOLS) 3, og LPS utfordring hos mennesker har blitt brukt til å modellere KOLS eksaserbasjoner 4. Dermed eksperimentelle modeller av LPS eksponering er klinisk relevante og verdifulle verktøy for å forstå menneskelig patologi.
Målet for pulmonal avlevering av aerosoliserte LPS som er beskrevet her, er å generere en nøytrofil inflammatorisk respons i det ledende og luftveiene, uten systemiske reaksjoner. Flere teknikker for LPS utfordringen har vært beskrevet tidligere. Intra-venøs injeksjon av LPS er den mest brukte administrasjonsmåte. Selv om denne teknikken er lett tilgjengelig, tHan primære skaden er til endotelet, med sekundær ødeleggelse av lunge epitel følgende nøytrofil migrering til lungen. Intra-venøs administrering induserer også systemisk inflammasjon 2, noe som kan komplisere det kliniske bildet i dyremodeller. Systemisk inflammasjon er i motsetning ikke observert med intratrakeal administrering. Denne teknikk er imidlertid arbeidskrevende og krever anestetika samt betydelig trening 5, 6. Videre er lunge deponering av denne administrasjons avhengig puste 7. Således er lungeavsetning påvirkes av anestesidybden som er nødvendig for intra tracheal administrering og variabel deponering i luftveiene kan observeres. I motsetning til dette, med aerosolis LPS pulmonal levering krever minimal opplæring, og kan lett oppnås på et stort antall av dyr med liten eller ingen variasjon mellom individer 5, 8.En fersk studie bekrefter at aerosol levering er overlegen den intratrakealt med hensyn til deponering, og at mer relevante doser av LPS indusere nøytrofil inflammasjon med denne modellen 8.
Tidligere studier har vist at utfordring å aerosoliseres Pseudomonas aeruginosa LPS genererer en markert inflammatorisk respons i luftveislumen og lunge parenchyma, inkludert de alveolare rom 9, 10. Betennelsen er preget av en overvekt av nøytrofile og tilstedeværelse av lungeødem, og kan dermed brukes til å adressere patogenesen av akutt lungeskade og få ytterligere kunnskap om mekanismene som bidrar til sykdom patologi.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
De dyrestudier ble godkjent av Northern Stockholm dyrevelferds etikkomité. De eksperimentelle prosedyrer ble utført i samsvar med svensk lov.
1. Generere en LPS Aerosol
- Oppløse 0,5 g renset P. aeruginosa LPS i 50 ml sterilt saltvann med forsiktig omrøring og verifisere oppløsning. Fortynn 1 ml LPS oppløst i 9 ml sterilt saltvann til en sluttkonsentrasjon på 1 mg / ml. Beskytt mot lys med aluminiumsfolie og oppbevar ved -20 ° C.
- Tine oppløseliggjorte LPS i mørke ved romtemperatur og blandes godt umiddelbart før bruk.
- I et ventilert nivå II biohazard hette, setter en rød innløp til en forstøver, og koble tøver til trykk romluft via slangen levert av produsenten (review ordningen presentere de eksperimentelle enheter i figur 1).
FORSIKTIG: egnet personlig verneutstyr, inkludert en halv ansiktsmaske gjenbruk respirateller med partikkelfilter, beskyttelsesbriller, hansker og beskyttende plagg bør brukes i løpet av eksponeringen.
Fig. 1: Skjematisk fremstilling av de eksperimentelle innretninger som brukes for å generere en aerosol Innløpet til forstøveren er koplet til en luftforsyning. Utløpet fra forstøveren blir først koblet til en strømningsmåler via et 15,9 mm rør og et luftfilter, og lufttilførselen reguleres til 5,0 l / m 2 kbar trykk. Uttaket er neste koblet til en pleksiglass boks utstyrt med avtagbare lokk og 5 mm hull for å hindre oppbygging av trykk.
- Koble utløpet av forstøveren for en massestrømningsmåler via et luftfilter. Koble masse målere til en strømforsyning.
- Justere lufttilførselen til 5 l / min, sammen med gjenværende trykk på 1,0-2,0 bar.
- Fjerne masse målere ogkoble fra lufttilførselen.
- Koble utløpet av forstøveren i et 15,9 mm rør, som deler seg og kobles til to pleksiglass-bokser med dimensjoner: 150 x 163 x 205 mm, utstyrt med avtagbare lokk. Hver boks bør ha et 5 mm hull i siden motstående innløpet, for å hindre oppbygging av trykk.
- Plassere opptil fem mus i hver pleksiglass boks og lukke lokkene.
- Åpne forstøveren og fylle innsatsen med minst 4 ml LPS oppløst i steril saltløsning eller bærer alene (sterilt saltvann, volumet bør ikke overstige 8 ml). Re-koble innløpet til lufttilførselen.
- La aerosolen til å strømme inn i den lukkede pleksiglass-bokser i 10 min. Overvåke dyrene kontinuerlig. Sørge for at lufttilførselen forblir tett sikret til innløpet av forstøveren.
- Koble fra lufttilførselen. Med lokkene lukket, lar dyrene forblir i pleksiglass-bokser i 2 min.
- Åpne dekslene og gir mulighet for aerosolen for å dispergere, og returnere dyrene til than bur. Hvis dyrene vises våt, plassere burene på en varmepute satt til lav varme, for å forebygge hypotermi.
- Overvåke dyrene kontinuerlig for de første 30 min, og deretter hvert 2 timer for første seks hr. Dyrene bør oppvise normal respirasjonsmønster og aktivitet under og etter forstøvning prosedyre.
2. Bronchoalveolar Lavage (BAL)
- På den eksperimentelle endepunktet, dypt bedøve dyrene med isofluran til effekt som anbefalt av institusjonens veterinær ansatte. Knip bakpoten å sjekke for en tilbaketrekning refleks for å sikre tilstrekkelig dybde av anestesi å gjennomføre en større operasjon. Spray ned pelsen av dyrene med 70% etanol.
- Åpne buken med saks, og skille de aorta til exsanguinate dyret. Legg et stykke vev over magen for å suge opp blodet.
- Follwing dødshjelp, bruke en enkelt anterior-posterior kutt av saksen tilutsett thorax. Løft opp brystkassen ved fremre spissen av brystbenet og bruke saks å punktere membranen på det mest ventral punkt, uten å kutte i noen lungelapp. Åpner brystkasse ved å gjøre to kutt i anterior-posterior retning (møte under kjeven).
- Trekk forsiktig fra hverandre brystkassen ved hjelp av pinsett, og kutte luftrøret nedenfor strupehodet.
- Løft opp luftrøret med pinsett og fjerne lungene ved å kutte leddbånd som forbinder lapper til brysthulen, og dra forsiktig av fettvev og hjertevev.
- Sett en polyetylen-rør (indre diameter: 0,58 mm; ytre diameter: 0,965 mm) inn i luftrøret, og sikrer slangen med en streng av silketråd.
- Feste den multilobe (de fire fliker av høyre lunge) med silketråd.
- Sett en 23 gauge nål inn i polyetylen rør og sakte injisere 250 mL iskald steril PBS inn singelen lapp med en 1 ml sprøyte.
- Nøye trykke lungene30 ganger, og samle opp væsken gjennom sprøyten. Gjenta fremgangsmåten med 200 ul PBS (ca. 300 ul PBS bør gjenvinnes fra enkelt lapp fra total injisert mengde på 450 ul).
- Hold bronchoalveolar utskyllingsvæske (Balf) på is, eller oppsummere de BAL celler umiddelbart. Telle cellene med en heamocytometer, ved hjelp av Turk løsning å farge cellene 11. Beregn det totale celletallet ved å multiplisere antall celler med fortynningsfaktoren av fargingsoppløsningen og volumet innenfor den telles feltet i heamocytometer.
- Forberede differensialcelletall fra cytocentrifuged celler som beskrevet andre steder 11.
3. Formalin Fixation av lungevev for Histologisk Assessment
- Ta av multilobe og hurtigfrys på tørris. Lagre ved -80 ° C.
- Montere en 60 ml sprøyte med stempelet fjernet på en metallstativet. Fylle sprøyten med 10% formalin iden høyde på 20 cm over laboratoriebenken, som representerer 20 cm av konstant trykk.
- Koble 23 gauge nål festet til luftrøret til 60 ml sprøyte via et plastrør med en ventil for å kontrollere strømningen av formalin.
- Insufflate lunge lapp med formalin i 5 min. Koble fra nålen og ta det ut sammen med polyetylen-røret fra luftrøret samtidig trekke i silketråd for å lukke luftrøret og holde trykket i lungen.
- Senk lunge lapp i formalin og fikse i 24 timer ved 4 ° C.
- Vask det faste vev tre ganger i minst 20 min med 70% etanol, og dehydrere å xylen gjennom følgende diett (1 time hver):
- 3 x 70% etanol
- 3 x 95% etanol
- 3 x 100% etanol
- 3x xylen
- 1x (flytende) parafin
- Embed dehydrert vev i parafin, skåret i 4-5 mikrometer seksjoner, og flekken med hematoxylin og eosin å tillate for histologisk vurdering.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Utfordring til aero P. aeruginosa LPS gir vanligvis en markert inflammatorisk respons i luftveislumen og alveolar plass, karakterisert ved en overvekt av nøytrofiler på både tidlige og sene tidspunkter.
Aerosoliseres LPS induserer lunge neutrofili
C57BL / 6BY og BALB / c mus ble utsatt for aerosolisert P. aeruginosa LPS eller bærer alene, og nøytrofiler ble nummerert i Balf. Det totale celletall i Balf av C57BL / 6BY mus eksponert for en aerosol generert med kjøretøyet bare er typisk rundt eller under 200 000 celler, og cellene består av 95-100% mononukleære celler, med bare noen få lymfocytter (0,5-5%), og ingen nøytrofile i Balf (Figur 2A-C). Mus utfordret med aero LPS utstillings en økt total celle nummer i Balf, typisk> 500.000 celler etter 6 timer. Cellen infiltrerer fortsatt høy etter 24 timer. Den cellulære profil i Balf er forskjøvet mot apredominance av nøytrofiler (80-95%) etter LPS-eksponering (figur 2B og C).
Fig. 2: Lunge neutrofili i C57BL / 6BY musene behandlet med 1 mg / ml LPS aero C57BL / 6BY mus ble eksponert for 1 mg / ml aerosol P. aeruginosa LPS eller bærer (saltløsning, hvit bar) alene i 10 min. Bronkoalveolær lavage (BAL) ble utført etter 6 timer eller 24 timer og leukocyttene ble nummerert i BAL fluid (Balf). (A) Totale celletall (TCN), (B) nøytrofiler, og (C) mononukleære celler (MNC) i Balf. Signifikante forskjeller ble analysert ved hjelp av un-paret t-test. n = 3-4, * indikerer p <0,05, ** betyr p <0,01.
En tilsvarende økning i inflammatoriske celler i Balf er observert i LPS-utfordret BALB / c-mus (figur 3A (figur 3B og C).
Fig. 3: Lunge neutrofili i BALB / c-mus utfordret med 1 mg / ml LPS aero BALB / c mus ble utsatt for 1 mg / ml aerosol P. aeruginosa LPS eller bærer (saltløsning, hvit bar) alene i 10 min. Bronkoalveolær lavage (BAL) ble utført etter 6 timer eller 24 timer og leukocyttene ble nummerert i BAL fluid (Balf). (A) Totale celletall (TCN), (B) nøytrofiler, og (C) mononukleære celler (MNC) i Balf. Signifikante forskjeller ble analysert ved hjelp av un-paret t-test. n = 3, ** betyr p <0,01, *** angir p <0,001.
Lignende inflammatorisk celle profilen en d pulmonal neutrofili er observert med forstøvning av 5 mg / ml LPS (Figur 4A-C) og ved intranasal levering av LPS, som tidligere rapportert 12,13.
Fig. 4: Lunge neutrofili i BALB / c-mus utfordret med 5 mg / ml LPS aero BALB / c mus ble utsatt for 5 mg / ml aerosol P. aeruginosa LPS eller bærer (saltløsning, hvit bar) alene i 10 min. Bronkoalveolær lavage (BAL) ble utført etter 24 timer og leukocyttene ble nummerert i BAL fluid (Balf). (A) Totale celletall (TCN), (B) nøytrofile celler, og (C) mononukleære celler (MNC) i Balf. Signifikante forskjeller ble analysert ved hjelp av un-paret t-test. n = 3, *** angir p <0,001.
Pulmonal lokalisering av nøytrofile i LPS-utfordret
ontent "> Neutrofiler er observert i epithelial submucosa, samt områder som omgir de ledende luftveier og blodårer av LPS-utfordret mus (figur 5). Dispergerte nøytrofile celler er også detektert i parenchyma og alveolære område.
Fig. 5: Lunge lokaliseringen av nøytrofiler i LPS-mus utfordret hematoksylin og eosin farging av formalinfiksert lungevev fra (A) C57BL / 6BY mus eksponert for kjøretøyet alene eller (B) 1 mg / ml LPS aerosolis avlivet etter 6 timer eller (C) 24 timer. Pil viser en nøytrofile. Strek viser 200 mikrometer. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
Konsentrasjonerasjon av nøytrofile chemoattractants i Balf
Det totale proteininnholdet i Balf av LPS-mus utfordret er økt sammenlignet med mus eksponert for saltvann (figur 6). Dessuten er det uttrykk for nøytrofile chemoattractants kjemokinet (CXC motiv) ligander (CXCL) 1 og CXCL2 økt i LPS-utfordret mus 10 (Figur 7A og B).
Fig. 6: Økt total proteinkonsentrasjon i bronkoalveolær lavage fluid (Balf) av LPS-utfordret C57BL / 6BY mus Totalt proteininnhold i Balf hos mus utfordret til 1 mg / ml LPS eller aerosolis utsatt for kjøretøyet (saltvann, hvit bar) var alene målt ved spektrofotometrisk analyse. Signifikante forskjeller ble analysert ved hjelp av un-paret t-test. n = 3-4, ** indikerer p <0,01.
Figur 7: Jeg ncreased uttrykk for CXCL1 og CXCL2 i bronchoalveolar utskyllingsvæske (Balf) av LPS-utfordret mus Expression av (A) CXCL1 og (B) CXCL2 i Balf av mus utfordret til 1 mg / ml aerosolized LPS eller utsatt for kjøretøy. (saltvann, hvit bar) alene kvantifisert ved ELISA. Signifikante forskjeller ble analysert ved hjelp av un-paret t-test. n = 3.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Aero LPS genererer en inflammatorisk respons i luftveiene, kjennetegnet ved neutrofiler i epithelial submucosa, mellomrom som omgir de ledende luftveier, så vel som de alveolære områder. Dette er, sammen med den økte totale proteininnhold i Balf, en indikasjon på plasmalekkasje, er representative for patologien av akutt lungeskade. Som LPS induserer en steril inflammasjon, er reaksjonen uavhengig av den adaptive immunrespons, og det er begrensninger i relevans for bakterielle infeksjoner. Teknikken kan imidlertid bli brukt til å dissekere inflammatoriske mekanismer ved å utelukke adaptive immunresponser.
Selv om metodikken er enkel og lett tilpasses for å svare på ulike vitenskapelige spørsmål, er valget av forstøver og rør kritisk. Deponering av LPS og resulterer neutrofili må valideres med viker, nebulizers og rør enn det som er beskrevet her. Videre, som mindre vanlig mus stRegnet kan vise ulike reaksjoner på LPS, bør optimale doser av LPS bestemmes for hver stamme. Videre nøytrofil inflammasjon generert med aerosolis LPS er sammenlignbar med inflammasjon indusert av intranasal levering av LPS, som observert av andre 12, 13. Selv om intranasal administrering lett utføres, krever metoden anestetika og potensielt kan innføre de mikrobielle flora i det nasale hulrom til lungene, slik nesehulrommet er ikke sterile, og den teknikk som krever et stort volum bærer.
I tillegg til relevansen til akutt lungeskade, kan teknikken videreutvikles til å omfatte flere utfordringer med aero LPS. Metodikken kan således brukes til å studere patogene mekanismer i kronisk betennelse i COPD, som er forbundet med vedvarende neutrofili 14, sammen med repeterte bakterielle infeksjoner eller permanent mikrobiell kolonisering
Utfordringen med aero LPS kan settes opp på en liten kostnad med noen apparater og krever minimalt med opplæring. Videre teknikken kan således rutinemessig utført i stor skala på ethvert laboratorium, med liten eller ingen variasjon mellom individer og er dermed overlegen i forhold til andre ruter for pulmonal avlevering.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Abraham Roos har fått en foreleser avgift fra Boehringer Ingelheim, reisestipend fra Astrazeneca R & D og et forskningsstipend fra Astrazeneca R & D. Magnus Nord er en fulltids ansatt av Astrazeneca R & D og har fått forskningsmidler fra Astrazeneca R & D. Johan Grunewald og Tove Berg er co-etterforskere på en urelatert forskningsprosjekt finansiert av Astrazeneca R & D.
Acknowledgments
Vi vil gjerne takke Kerstin Thim (Astrazeneca, Lund, Sverige), Benita Dahlberg og Dr. Anders Eklund (Karolinska Institutet, Stockholm, Sverige) samt Dr. Martin Stampfli (McMaster University, Hamilton, ON, Canada) for dyktig assistanse og ekspertråd.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Purified Pseudomonas aeruginosa LPS | Sigma-Aldrich | Harmful. Recomended purification. LPS purified from other bactria may be used. | |
| Pari LC sprint star nebulizer | PARI Respiratory Equipment Inc. | 023G1250 | |
| TSI mass flowmeter 4040 | TSI | 4040 | Alternative product from supplier may be used. |
| Saint-Gobain 15.9 mm Tygon tube | Sigma-Aldrich | Z685704 | Recomended brand. |
| Plexiglas boxes with removable lids | Custom built | N/A | 150 x 163 x 205 mm (a 2 mm hole on the side). |
| 3M Half Facepiece Reusable Respirator | 3M | 7503 | Recomended brand. |
| 3M Advanced Particulate Filters (P100) | 3M | 2291 | Recomended brand. |
| Scissors | VWR | 233-1104 | Preferred scissors may be used. |
| Forceps | VWR | 232-1313 | Preferred forceps may be used. |
| Intramedic PE50 polyethylene tube | BD | 427411 | Recomended brand. |
| Ethicon 2-0 Perma-hand silk tread | VWR | 95056-992 | Recomended brand. |
| 26 ½ gage needle | Alternative suppliers exist. | ||
| 1 ml BD slip-tip syringe, non-sterile |  BD |
301205 | Alternative suppliers exist. |
| 60 ml BD Luer-Lok syringe, non-sterile, polypropolene | BD | 301035 | Alternative suppliers exist. |
| Fluka Hematoxylin-Eosin | Sigma-Aldrich | 3972 | Alternative suppliers exist. |
| Türk's solution | Merck Millipore | 109277 | |
| Table top centrifuge | Alternative manufacturers exist. | ||
| Cytospin 4 cytocentrifuge | Thermo Scientific | A78300003 | Alternative centrifuge can be used. |
| HEMA-3 stat pack | Fisher Scientific | 23-123-869 | Alternative staining kits exists. |
| Formalin solution, neutral buffered, 10% | Sigma-Aldrich | HT501128 | Alternative suppliers exist. |
References
- King, J. D., Kocincova, D., Westman, E. L., Lam, J. S. Review: Lipopolysaccharide biosynthesis in Pseudomonas aeruginosa. Innate Immun. 15, 261-312 (2009).
- Grommes, J., Soehnlein, O. Contribution of neutrophils to acute lung injury. Mol Med. 17, 293-307 (2011).
- Pesci, A., et al. Inflammatory cells and mediators in bronchial lavage of patients with chronic obstructive pulmonary disease. Eur Respir J. 12, 380-386 (1998).
- Hoogerwerf, J. J., et al. Lung Inflammation Induced by Lipoteichoic Acid or Lipopolysaccharide in Humans. Am. J. Respir. Crit. Care Med. 178, 34-41 (2008).
- Scheuchenzuber, W. J., Eskew, M. L., Zarkower, A. Comparative humoral responses to Escherichia coli and sheep red blood cell antigens introduced via the respiratory tract. Exp Lung Res. 13, 97-112 (1987).
- Asti, C., et al. Lipopolysaccharide-induced lung injury in mice. I. Concomitant evaluation of inflammatory cells and haemorrhagic lung damage. Pulm Pharmacol Ther. 13, 61-69 (2000).
- Brand, P., et al. Total deposition of therapeutic particles during spontaneous and controlled inhalations. Journal of pharmaceutical sciences. 89, 724-731 (2000).
- Liu, F., Li, W., Pauluhn, J., Trubel, H., Wang, C. Lipopolysaccharide-induced acute lung injury in rats: comparative assessment of intratracheal instillation and aerosol inhalation. Toxicology. 304, 158-166 (2013).
- Skerrett, S. J., et al. Role of the type 1 TNF receptor in lung inflammation after inhalation of endotoxin or Pseudomonas aeruginosa. American Journal of Physiology - Lung Cellular and Molecular Physiology. 276, L715-L727 (1999).
- Roos, A. B., et al. Lung epithelial-C/EBPbeta contributes to LPS-induced inflammation and its suppression by formoterol. Biochem Biophys Res Commun. 423, 134-139 (2012).
- Didon, L., et al. Lung epithelial CCAAT/enhancer-binding protein-beta is necessary for the integrity of inflammatory responses to cigarette smoke. Am J Respir Crit Care Med. 184, 233-242 (2011).
- Silverpil, E., et al. Negative feedback on IL-23 exerted by IL-17A during pulmonary inflammation. Innate Immunity. 19, 479-492 (2013).
- Mercer, P. F., et al. Proteinase-Activated Receptor-1, CCL2 and CCL7 Regulate Acute Neutrophilic Lung Inflammation. American Journal of Respiratory Cell and Molecular Biology. , (2013).
- Korkmaz, B., Horwitz, M. S., Jenne, D. E., Gauthier, F. Neutrophil Elastase, Proteinase 3, and Cathepsin G as Therapeutic Targets in Human Diseases. Pharmacological Reviews. 62, 726-759 (2010).
- Bafadhel, M., et al. Acute Exacerbations of COPD: Identification of Biological Clusters and Their Biomarkers. Am. J. Respir. Crit. Care Med. , 201104-200597 (2011).
- Hurst, J. R., Perera, W. R., Wilkinson, T. M. A., Donaldson, G. C., Donaldson, G. C., Wedzicha, G. C. Systemic and Upper and Lower Airway Inflammation at Exacerbation of Chronic Obstructive Pulmonary. Am. J. Respir. Crit. Care Med. 173, 71-78 (2006).
- Rabe, K. F., et al. Global Strategy for the Diagnosis, Management, and Prevention of Chronic Obstructive Pulmonary Disease: GOLD Executive Summary. Am. J. Respir. Crit. Care Med. 176, 532-555 (2007).
