Summary
Descreve-se um método para a indução de inflamação pulmonar neutrofílica desafio por aerossol para lipopolissacarídeo por nebulização, para modelar a lesão pulmonar aguda. Além disso, também são descritas as técnicas cirúrgicas básicas para isolamento pulmonar, intubação traqueal e lavado bronco-alveolar.
Abstract
A lesão pulmonar aguda (LPA) é uma doença grave, caracterizada por neutrofilia alveolar, com opções limitadas de tratamento e alta mortalidade. Modelos experimentais de ALI são fundamentais para melhorar a nossa compreensão da patogênese da doença. O lipopolissacárido (LPS) derivadas a partir de bactérias gram positivas induz inflamação neutrofílica nas vias aéreas e do parênquima pulmonar de ratos. Administração pulmonar eficaz de compostos, tais como LPS é, no entanto, difícil de alcançar. Na abordagem aqui descrita, a administração pulmonar em ratinhos é obtido por desafio com aerossol Pseudomonas aeruginosa LPS. LPS foi dissolvido em aerossol através de um nebulizador conectado ao ar comprimido. Os ratinhos foram expostos a um fluxo contínuo de aerossol de LPS numa caixa de plexiglas durante 10 minutos, seguido de 2 minutos após o condicionamento de aerossol foi descontinuado. Entubação traqueal e subsequente lavagem broncoalveolar, seguido por perfusão de formalina foi realizada próximo, o que permite a caracterização do p estérilinflamação ulmonar. Aerosolized LPS gera uma inflamação pulmonar caracterizada por neutrofilia alveolar, detectado no lavado bronco-alveolar e pela avaliação histológica. Esta técnica pode ser configurado com um custo pequeno, com poucos aparelhos, e exige treinamento e experiência mínima. O sistema de exposição pode, portanto, ser realizado rotineiramente em qualquer laboratório, com o potencial de melhorar a nossa compreensão da patologia pulmonar.
Introduction
O lipopolissacárido (LPS) é um componente da parede celular de bactérias gram-negativas 1. Desafio ao LPS é um modelo bem documentado da lesão pulmonar aguda, uma síndroma caracterizada por inflamação e edema agudo neutrofílica 2. Além disso, a neutrofilia pulmonar é também uma característica da doença pulmonar obstrutiva crónica (DPOC) 3, e provocação com LPS em seres humanos tem sido utilizado para modelar as exacerbações da DPOC 4. Assim, modelos experimentais de exposição LPS são clinicamente relevantes e ferramentas valiosas para entender a patologia humana.
O objetivo da administração pulmonar de LPS aerossol descritas aqui é gerar uma resposta inflamatória neutrofílica na condução e vias respiratórias, sem envolvimento sistêmico. Várias técnicas de provocação com LPS foram descritos anteriormente. Injecção intra-venosa do LPS é a via de administração mais utilizada. Embora esta técnica é facilmente acessível, tele dano primário é para o endotélio, com destruição secundário do epitélio pulmonar após a migração de neutrófilos para o pulmão. A administração intra-venosa também induz inflamação sistémica 2, o que pode complicar o quadro clínico em modelos animais. Inflamação sistémica está em contraste não observados com a administração intra-traqueal. Esta técnica, no entanto, é trabalhoso e requer anestésicos, bem como treinamento considerável 5, 6. Além disso, a deposição pulmonar por esta via de administração é dependente de respiração 7. Assim, a deposição pulmonar é afectada pela profundidade da anestesia necessários para a administração intra traqueal e variável deposição nas vias aéreas pode ser observada. Em contraste, a administração pulmonar com LPS requer o mínimo de formação de aerossol, e pode ser facilmente conseguido com um grande número de animais com pouca ou nenhuma variação entre indivíduos 5, 8.Um estudo recente confirmou que o fornecimento de aerossol é superior a via intra-traqueal em relação à deposição, e que doses mais pertinentes do LPS induzir inflamação neutrofílica com este modelo 8.
Estudos anteriores demonstraram que a desafio aerossolizado Psuedomonas aeruginosa LPS gera uma resposta inflamatória significativa no lúmen das vias aéreas e do parênquima pulmonar, incluindo os espaços alveolares 9, 10. A inflamação é caracterizada pela predominância de neutrófilos e presença de edema pulmonar, e pode, assim, ser usado para endereçar patogénese da lesão pulmonar aguda e ganhar conhecimento adicional sobre os mecanismos que contribuem para a patologia da doença.
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Protocol
Os estudos com animais foram aprovados pelo comitê de ética bem-estar animal do Norte Estocolmo. Os procedimentos experimentais foram realizados em conformidade com a lei sueca.
1. Gerando um LPS Aerosol
- Dissolve-se 0,5 g purificado P. aeruginosa LPS em 50 ml de solução salina estéril com agitação suave e verificar dissolução. Dilui-se 1 ml de LPS dissolvidos em 9 ml de solução salina estéril, a uma concentração final de 1 mg / ml. Proteger da luz com papel alumínio e armazenar a -20 ° C.
- Descongelar LPS solubilizados no escuro à temperatura ambiente e misture bem imediatamente antes da utilização.
- Em um ventilado nível II capô biohazard, inserir uma entrada de vermelho em um nebulizador e ligue o nebulizador ao ar ambiente pressurizado através do tubo fornecido pelo (esquema de avaliação apresentando os dispositivos experimentais na Figura 1) fabricante.
CUIDADO: equipamento de protecção individual adequado, incluindo uma meia peça facial Respirat reutilizávelou com filtros de partículas, óculos de proteção, luvas e vestuário de protecção deve ser utilizado durante o curso da exposição.
Figura 1:. Apresentação esquemática dos dispositivos experimentais utilizados para a geração de um aerossol A entrada do nebulizador é ligado a uma alimentação de ar. A saída do nebulizador é primeiro ligado a um medidor de fluxo através de um tubo de 15,9 milímetros e um filtro de ar, e de fornecimento de ar é ajustado para 5,0 L / m a 2 kbar pressão. A saída está próxima ligado a uma caixa de acrílico equipados com tampas removíveis e 5 furos mm para evitar aumento de pressão.
- Ligue a saída do nebulizador a um medidor de fluxo de massa através de um filtro de ar. Ligue o medidor de vazão em massa para uma alimentação eléctrica.
- Ajuste o suprimento de ar para 5 L / min, com a pressão restante em 1,0-2,0 bar.
- Remova o medidor de vazão em massa edesligue o suprimento de ar.
- Ligue a saída do nebulizador para um tubo de 15,9 milímetros, o que se bifurca e conecta-se duas caixas de Plexiglas com as dimensões: 150 x 163 x 205 milímetros, equipados com tampas removíveis. Cada caixa deve ter um buraco de cinco milímetros no lado oposto da entrada, para evitar acúmulo de pressão.
- Coloque até 5 ratos em cada caixa de acrílico e feche as tampas.
- Abra o nebulizador e encher o inserto com pelo menos 4 ml de LPS dissolvidos em soro fisiológico estéril ou apenas veículo (solução salina estéril; o volume não deverá exceder 8 ml). Volte a ligar a entrada para o suprimento de ar.
- Permitir que o aerossol para fluir para dentro das caixas de Plexiglas fechados durante 10 min. Monitorar continuamente os animais. Certifique-se o fornecimento de ar permanece firmemente fixado à entrada do nebulizador.
- Desligue o fornecimento de ar. Com as pálpebras fechadas, deixe os animais permanecem nas caixas de acrílico para 2 min.
- Abrir as tampas e para permitir que o aerossol para dispersar, e devolver os animais atele gaiolas. Se os animais aparecem molhados, coloque as gaiolas em uma almofada de aquecimento definido para fogo baixo, para evitar a hipotermia.
- Monitorizar os animais continuamente durante os primeiros 30 minutos, e posteriormente, a cada 2 horas durante as primeiras 6 horas. Os animais devem apresentar padrão respiratório e da actividade normal durante e após o procedimento de nebulização.
2. Lavagem Broncoalveolar (BAL)
- No ponto final experimental, profundamente anestesiar os animais com isoflurano a efeito tal como recomendado pela equipe de veterinários da sua instituição. Aperte a pata traseira para verificar se há um reflexo de retirada para assegurar suficiente profundidade da anestesia para realizar cirurgia de grande porte. Spray para baixo a pele dos animais com etanol 70%.
- Abra o abdômen com uma tesoura e cortar a aorta para desangrar o animal. Coloque um pedaço de tecido sobre o abdômen para absorver o sangue.
- Follwing eutanásia, use um único corte ântero-posterior da tesoura paraexpor o tórax. Levante a caixa torácica pela ponta anterior do esterno e use a tesoura para perfurar o diafragma no ponto mais ventral, sem cortar qualquer lobo pulmonar. Abra a caixa torácica, fazendo dois cortes no sentido ântero-posterior (reuniões abaixo da mandíbula).
- Delicadamente, puxe a caixa torácica com a pinça, e cortar a traqueia, abaixo da laringe.
- Levante a traquéia com a pinça e remover os pulmões, cortando os ligamentos que ligam os lobos para a cavidade torácica, e puxando pelo tecido adiposo e cardíaca.
- Insira um tubo de polietileno (diâmetro interno de 0,58 mm; diâmetro externo: 0,965 milímetros) na traquéia e fixar o tubo com uma corda de fio de seda.
- Empate fora do multilobe (os quatro lobos do pulmão direito) com fio de seda.
- Insira uma agulha de calibre 23 para dentro do tubo de polietileno e injetar lentamente 250 mL de gelada PBS estéril para o lobo único com uma seringa de 1 ml.
- Tocar com cuidado os pulmões30 vezes e recolher o líquido através da seringa. Repetir o processo com 200 ul de PBS (aproximadamente 300 ul de PBS deve ser recuperado a partir do lobo único a partir do volume total de 450 ul injectados).
- Mantenha o lavado bronco-alveolar (LBA) em gelo, ou enumerar as células do LBA imediatamente. Contar as células com um heamocytometer, utilizando uma solução de Turk para corar as células 11. Calcula-se o número total de células através da multiplicação do número de células com o factor de diluição da solução de coloração e o volume dentro do campo contado do heamocytometer.
- Prepare a contagem diferencial de células a partir de células citocentrifugada como descrito noutro local 11.
3. Formalin fixação do tecido pulmonar para avaliação histológica
- Retire o multilobe e snap-freeze em gelo seco. Armazenar a -80 ° C.
- Montar uma seringa de 60 ml com o êmbolo removido em um cavalete de suporte de metal. Encher a seringa com 10% de formalina paraa altura de 20 cm acima da bancada do laboratório, representando 20 cm de pressão constante.
- Ligar-se a agulha de calibre 23, fixada à traqueia para a seringa de 60 ml através de um tubo de plástico com uma válvula para controlar o fluxo de formalina.
- Insuflar o lobo pulmonar com formalina durante 5 min. Desligar a agulha e removê-lo em conjunto com o tubo de polietileno a partir da traqueia, enquanto em puxando o fio de seda para fechar a traqueia e manter a pressão no pulmão.
- Submergir o lóbulo do pulmão em formalina e fixar durante 24 horas a 4 ° C.
- Lavar o tecido fixado três vezes durante pelo menos 20 minutos com etanol a 70%, e desidratar a xileno através do seguinte esquema (1 h cada):
- 3x etanol a 70%
- 3x etanol a 95%
- 3x etanol a 100%
- 3x xileno
- 1x (líquido) parafina
- Incorporar tecido desidratado em parafina, cortadas em 4-5 mm seções, e mancha com HE para permitir a avaliação histológica.
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Representative Results
Desafio para aerossol P. aeruginosa LPS geralmente produz uma resposta inflamatória marcado no lúmen das vias aéreas e do espaço alveolar, caracterizado por uma predominância de neutrófilos em ambos os pontos de tempo precoces e tardios.
Aerosolized LPS induz neutrophilia pulmonar
C57BL / 6BY e BALB / c foram expostos a aerossol P. aeruginosa LPS ou veículo sozinho e neutrófilos foram enumerados no LBA. O número total de células no FLBA dos ratinhos C57BL / 6BY expostos a um aerossol gerado apenas com veículo é tipicamente cerca ou abaixo de 200.000 células e as células consistir em 95-100% de células mononucleares, com apenas poucos linfócitos (0,5-5%), e não há neutrófilos no LBA (Figura 2A-C). Ratos desafiados com aerossol exposição LPS um aumento do número total de células no LBA, tipicamente> 500.000 células após 6 horas. O infiltrado celular continua alta após 24 horas. O perfil celular em LBA é deslocado para apredominance de neutrófilos (80-95%) após a exposição ao LPS (Figura 2B e C).
Figura 2:. Neutrofilia pulmonar em ratinhos C57BL / 6BY desafiados com 1 mg / ml de LPS em aerossol ratinhos C57BL / 6BY foram expostas a 1 mg / ml em aerossol P. aeruginosa LPS ou veículo (solução salina, barra branca) por si só durante 10 min. A lavagem broncoalveolar (LBA) foi feita depois de 6 h ou 24 horas e os leucócitos foram enumeradas no LBA (LBA). (A) Número total de células (TCN), (B), neutrófilos, e (C), as células mononucleares (MNC) no LBA. Diferenças significativas foram analisados por meio de testes t un pareado. n = 3-4, * indica p <0,05, ** indica p <0,01.
Um aumento comparável em células inflamatórias no LBA é observada em LPS-desafiados ratinhos BALB / c (Figura 3A (Figura 3B e C).
Figura 3:. Neutrofilia pulmonar em ratinhos BALB / c estimulados com 1 mg / ml de LPS em aerossol ratinhos BALB / c foram expostos a 1 mg / ml em aerossol P. aeruginosa LPS ou veículo (solução salina, barra branca) por si só durante 10 min. A lavagem broncoalveolar (LBA) foi feita depois de 6 h ou 24 horas e os leucócitos foram enumeradas no LBA (LBA). (A) Número total de células (TCN), (B), neutrófilos, e (C), as células mononucleares (MNC) no LBA. Diferenças significativas foram analisados por meio de testes t un pareado. n = 3, ** indica p <0,01, *** indica p <0,001.
Similar inflamatória um perfil de celular d neutrofilia pulmonar é observado com a nebulização de 5 mg / ml de LPS (Figura 4A-C) e por administração intranasal de LPS, conforme relatado anteriormente 12,13.
Figura 4:. Neutrofilia pulmonar em ratinhos BALB / c estimulados com 5 mg / ml de LPS em aerossol ratinhos BALB / c foram expostos a 5 mg / ml em aerossol P. aeruginosa LPS ou veículo (solução salina, barra branca) por si só durante 10 min. Lavado bronco-alveolar (LBA) foi realizada após 24 horas e os leucócitos foram enumerados no LBA (LBA). (A) número total de células (TCN), (B) neutrófilos, e (C), as células mononucleares (MNC) no LBA. Diferenças significativas foram analisados por meio de testes t un pareado. n = 3, *** indica p <0,001.
Localização pulmonar de neutrófilos em LPS-desafiado
ontent "> Os neutrófilos são observados na submucosa epitelial, bem como os espaços em torno dos condutores das vias respiratórias e dos vasos sanguíneos de ratinhos desafiados com LPS (Figura 5). neutrófilos dispersas são também detectados na região alveolar e parênquima.
Figura 5:. Localização pulmonar de neutrófilos em ratinhos desafiados com LPS de hematoxilina e eosina de tecido pulmonar fixados em formalina a partir de (A) camundongos C57BL / 6BY expostos ao veículo sozinho ou (B) a 1 mg / ml de LPS em aerossol sacrificados após 6 h ou (C) 24 horas. A seta indica um neutrófilo. Bar indica 200 um. Por favor, clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Concentrção de chemoattractants neutrófilos em BALF
O teor total de proteína no LBA de ratinhos desafiados com LPS é aumentada em comparação com ratinhos expostos a solução salina (Figura 6). Além disso, a expressão da quimioquina quimioatractores neutrófilos (CXC) motivo ligandos (CXCL) 1 e CXCL2 são aumentados em ratinhos desafiados com LPS-10 (Figura 7A e B).
Figura 6:. O aumento da concentração de proteína total no fluido de lavagem broncoalveolar (LBA) de LPS-desafiados ratinhos C57BL / 6BY O teor proteico total em LBA de ratinhos provocados para 1 mg / ml de LPS em aerossol ou expostos ao veículo (solução salina, barra branca) sozinho era medido por análise espectrofotométrica. Diferenças significativas foram analisados por meio de testes t un pareado. n = 3-4, ** indica p <0,01.
Figura 7: I ncreased expressão de CXCL1 e CXCL2 no fluido de lavagem broncoalveolar (LBA) de ratinhos desafiados com LPS Expressão de (A) CXCL1 e (B) CXCL2 em LBA de ratinhos desafiados a 1 mg / ml de LPS em aerossol ou expostas ao veículo. (soro fisiológico, barra branca) sozinho quantificada por ELISA. Diferenças significativas foram analisados por meio de testes t un pareado. n = 3.
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Discussion
Em aerossol de LPS gera uma resposta inflamatória nas vias aéreas, caracterizada por neutrófilos na submucosa epitelial, espaços circundantes as vias aéreas de condução, bem como os espaços alveolares. Isto é, em conjunto com o aumento do conteúdo de proteína total na LBA, indicativo de perda de plasma, representativo da patologia da lesão pulmonar aguda. Como LPS induz uma inflamação estéril, a reacção é independente da resposta imune adaptativa, e existem limitações para a relevância para infecções bacterianas. A técnica pode, no entanto, ser utilizado para dissecar os mecanismos inflamatórios por exclusão de respostas imunitárias adaptativas.
Embora a metodologia é simples e facilmente adaptado para responder a perguntas científicos diferentes, a escolha do nebulizador e tubagem é crítica. A deposição de LPS e resultando neutrophilia deve ser validado com entradas, nebulizadores e tubulação, além do que é descrito aqui. Além disso, o mouse como menos comum stchuvas podem mostrar diferentes respostas ao LPS, doses ideais de LPS deve ser determinado para cada estirpe. Além disso, a inflamação neutrofílica gerado com LPS em aerossol é comparável com a inflamação induzida por administração intranasal de LPS, como observado por outros 12, 13. Embora a administração intranasal é facilmente realizada, o método requer anestésicos e poderia potencialmente introduzir a flora microbiana da cavidade nasal para os pulmões, tal como a cavidade nasal não é estéril e a técnica requer um grande volume de veículo.
Além da relevância à lesão pulmonar aguda, a técnica pode ser desenvolvida para incluir vários desafios com LPS em aerossol. A metodologia pode, assim, ser utilizados para estudar os mecanismos patogénicos na inflamação crónica da DPOC, que está associada com a persistência neutrofilia 14, em conjunto com infecções bacterianas recorrentes ou colonização microbiana permanente
Desafio com LPS em aerossol pode ser configurado com um custo pequeno, com poucos aparelhos e requer um mínimo de treinamento. Além disso, a técnica pode assim ser rotineiramente realizados em grande escala, em qualquer laboratório, com pouca ou nenhuma variação entre indivíduos e, portanto, é superior a outras vias de administração pulmonar.
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Disclosures
Abraham Roos recebeu uma taxa conferencista da Boehringer Ingelheim, bolsas de viagem de AstraZeneca R & D e uma bolsa de pesquisa da AstraZeneca R & D. Magnus Nord é um funcionário em tempo integral da AstraZeneca R & D e tem recebido bolsas de pesquisa da AstraZeneca R & D. Johan Grunewald e Tove Berg são co-pesquisadores em um projeto de pesquisa relacionado financiado pela AstraZeneca R & D.
Acknowledgments
Gostaríamos de agradecer a Kerstin Thim (AstraZeneca, Lund, Suécia), Benita Dahlberg e Dr. Anders Eklund (Karolinska Institutet, em Estocolmo, Suécia), bem como Dr. Martin Stampfli (Universidade McMaster, Hamilton, ON, Canadá) para obter assistência hábil e conselhos de especialistas.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Purified Pseudomonas aeruginosa LPS | Sigma-Aldrich | Harmful. Recomended purification. LPS purified from other bactria may be used. | |
| Pari LC sprint star nebulizer | PARI Respiratory Equipment Inc. | 023G1250 | |
| TSI mass flowmeter 4040 | TSI | 4040 | Alternative product from supplier may be used. |
| Saint-Gobain 15.9 mm Tygon tube | Sigma-Aldrich | Z685704 | Recomended brand. |
| Plexiglas boxes with removable lids | Custom built | N/A | 150 x 163 x 205 mm (a 2 mm hole on the side). |
| 3M Half Facepiece Reusable Respirator | 3M | 7503 | Recomended brand. |
| 3M Advanced Particulate Filters (P100) | 3M | 2291 | Recomended brand. |
| Scissors | VWR | 233-1104 | Preferred scissors may be used. |
| Forceps | VWR | 232-1313 | Preferred forceps may be used. |
| Intramedic PE50 polyethylene tube | BD | 427411 | Recomended brand. |
| Ethicon 2-0 Perma-hand silk tread | VWR | 95056-992 | Recomended brand. |
| 26 ½ gage needle | Alternative suppliers exist. | ||
| 1 ml BD slip-tip syringe, non-sterile |  BD |
301205 | Alternative suppliers exist. |
| 60 ml BD Luer-Lok syringe, non-sterile, polypropolene | BD | 301035 | Alternative suppliers exist. |
| Fluka Hematoxylin-Eosin | Sigma-Aldrich | 3972 | Alternative suppliers exist. |
| Türk's solution | Merck Millipore | 109277 | |
| Table top centrifuge | Alternative manufacturers exist. | ||
| Cytospin 4 cytocentrifuge | Thermo Scientific | A78300003 | Alternative centrifuge can be used. |
| HEMA-3 stat pack | Fisher Scientific | 23-123-869 | Alternative staining kits exists. |
| Formalin solution, neutral buffered, 10% | Sigma-Aldrich | HT501128 | Alternative suppliers exist. |
References
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