Summary
الخلايا الدبقية الصغيرة هي الخلايا المناعية مقيم في الجهاز العصبي المركزي (CNS) مع قدرة عالية على يبلعم أو تبتلع المواد في بيئتهم خارج الخلية. هنا، يوصف مقايسة المطبقة على نطاق واسع وموثوق بها، والكمية غاية لتصور وقياس بوساطة الخلايا الدبقية الصغيرة بابتلاعها من مكونات متشابك.
Abstract
البلعمة هي العملية التي خلية تبتلع المواد (الخلية بأكملها، وأجزاء من خلية، والحطام، وغيرها) في البيئة خارج الخلية المحيطة بها وبالتالي يساعد على هضم هذه المواد، عادة من خلال تدهور الليزوزومية. الخلايا الدبقية الصغيرة هي الخلايا المناعية مقيم في الجهاز العصبي المركزي (CNS) والتي تم وصفها في مجموعة واسعة من الشروط من مرض الاعصاب (على سبيل المثال، والتخليص بيتا اميلويد في مرض الزهايمر) لتطور الدماغ صحية (على سبيل المثال، متشابك وظيفة البلعمة التقليم) 1-6. بروتوكول التالية هي فحص الإحاطة وضعت لتصور وقياس بوساطة الخلايا الدبقية الصغيرة الإحاطة المدخلات قبل المشبكي في الماوس تطوير نظام retinogeniculate 7. في حين تم استخدام هذا الاختبار لتقييم وظيفة الخلايا الدبقية الصغيرة في هذا السياق على وجه الخصوص، يمكن استخدام نهج مماثل لتقييم البالعات الأخرى في جميع أنحاء الدماغ (مثل الخلايا النجمية) وباقي الجسم(على سبيل المثال، الضامة الطرفية)، وكذلك السياقات الأخرى التي يحدث فيها إعادة عرض متشابك (على سبيل المثال، إصابات الدماغ / مرض).
Introduction
الدوائر متشابك يعيد طوال حياة الحيوان. في الدماغ النامية، تشكل نقاط الاشتباك العصبي في الزائدة ويجب أن تخضع التقليم متشابك الذي ينطوي على إزالة انتقائية من مجموعة فرعية من نقاط الاشتباك العصبي وصيانة وتعزيز نقاط الاشتباك العصبي من تلك التي لا تزال 8-10. هذه العملية ضرورية لتحقيق سمة الربط الدقيق للنظام العصبي الكبار. في البالغين، ويمكن أيضا أن تكون نقاط الاشتباك العصبي البلاستيكية، ولا سيما في سياق التعلم والذاكرة. يعتقد أن يرتبط هذا اللدونة الهيكلية لتشمل إضافة و / أو القضاء على العمود الفقري شجيري وحبات قبل المشبكي 11-13. بالإضافة إلى هذه الأدوار في سلامة الجهاز العصبي، وتشارك أيضا في إعادة عرض متشابك العصبي مرض 12،14،15 نظام / إصابة. على سبيل المثال، بعد إصابة الحبل الشوكي، يجب إعادة تشكيلها في وقت لاحق قطعت محاور وتشكيل نقاط الاشتباك العصبي وظيفية جديدة لتحقيق الانتعاش 16-19.
الإقليم الشمالي "> الناشئة كجانب هام من اللدونة متشابك هو عملية البلعمة أو الابتلاع من نقاط الاشتباك العصبي متجهة لإزالة 3،5،20. أظهرنا مؤخرا هذه الظاهرة في سياق التقليم متشابك في صحية، وبعد الولادة مخ الفأر 7. على وجه التحديد ، الخلايا الدبقية الصغيرة، وخلايا الجهاز العصبي المركزي وجهاز المناعة البالعات المقيمين عرضت، لتبتلع المدخلات قبل المشبكي خلال فترة الذروة وفي منطقة التقليم متشابك التنموية، والظهرية الجانبية بعد الولادة الركبي النواة (dLGN) من المهاد. الحصار الوراثية أو الدوائية من هذا الغمر أسفرت عن العجز المستمر في اتصال متشابك.في هذا البروتوكول، ونحن تصف مقايسة موثوقة والكمي للغاية لقياس بوساطة بلعمية الإحاطة المدخلات قبل المشبكي. لأغراض هذه المادة، وسيقدم هذا الاختبار في سياق منظومة تطوير retinogeniculate، والذي يتضمن خلايا الشبكية العقدة (RGCs) المقيمين في شبكية العين التيمشروع المدخلات قبل المشبكي إلى dLGN (الشكل 1A). لتبدأ، وسوف يمكن وصفها استراتيجية وضع العلامات تقدمي مقاومة للتدهور الليزوزومية، والذي يستخدم لتصور المدخلات قبل المشبكي RGC محددة في dLGN (الشكل 1) 7،21. بعد هذا الوصف، منهجية مفصلة للتصوير وقياس كميا الغمر باستخدام المجهر متحد البؤر جنبا إلى جنب مع 3 الأبعاد (3D) حجم سطح التقديم سوف تعطى. ويستند هذا المنهج على إعداد الأنسجة ثابتة ولكن يمكن أيضا أن تتكيف لاستخدامها في دراسات التصوير الحي. الأهم من ذلك، في حين تم التحقق من صحة الفحص في سياق صحي، ونظام retinogeniculate ما بعد الولادة، يمكن للمرء أن يطبق نفس الأساليب الأخرى لتقييم التفاعلات بلعمية الخلايا العصبية في جميع أنحاء الدماغ وأثناء المرض، فضلا عن وظيفة بلعمية في أجهزة الجسم الأخرى.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. تقدمي وصفها من قبل المشبكي RGC المدخلات
ملاحظة: تم استعراض جميع التجارب التي تنطوي على استخدام الحيوانات وتشرف عليها لجنة رعاية الحيوان واستخدام المؤسسية (IACUC) وفقا لجميع المبادئ التوجيهية المعاهد الوطنية للصحة.
- تعقيم الميدان والصكوك.
- تخدير الفأر مع 4٪ isoflurane والمجلد في غرفة تحريض زجاجي (هذا المجلد٪ isoflurane ويعمل لالفئران حديثي الولادة والكبار). مراقبة الفئران عن كثب لتجنب الإفراط في التخدير. تنبيه: تجنب استنشاق الغاز مع إجلاء النفايات فراغ.
- بعد 1-3 دقائق، (سوف الفئران الأكبر سنا تتطلب وقتا أقل) ضمان تحقيق المستوى المناسب من التخدير بواسطة معسر الذيل (ينبغي مراعاة أي رد فعل) ومراقبة معدل التنفس (يجب أن يكون معدل بطيئة وثابتة).
- وضع الماوس تحت المجهر ستيريو على جانب ومكان مخروط الأنف لتسليم 3-4 المجلد٪ isoflurane وعلى خطم (حديثي الولادة <يوم ما بعد الولادة 10 (P10) ~ 4 مج٪؛> P10 ~ 3 المجلد٪).
- فضح الصلبة. للحقن من حديثي الولادة قبل فتح العين، واستخدام زوج من مقص الربيع صغيرة لفتح الجفن وسحب الجلد لفضح الصلبة. لالفئران الأكبر سنا، واستخدام الأصابع لسحب الجلد المحيطة بالعين لفضح الصلبة. تنبيه: في حديثي الولادة، وأحيانا أخرى قطع عمودي على زاوية العين أمر ضروري. اتخاذ الحيطة والحذر عند قطع زاوية الجفن كما أن هناك وعاء دموي أنه إذا قطع، وسوف تنزف بشكل مفرط.
- استخدام معقم 30.5 G إبرة لثقب ثقب صغير في جانب العين في السطر حيث يبدأ الصلبة. الحرص على تجنب إتلاف العدسة عن طريق إدخال إبرة فقط بعيدا بما فيه الكفاية أن شطبة يذهب الى العين.
- السماح للزجاجي في التدفق من حفرة واستخدام ذات الرؤوس القطن المعقم قضيب لامتصاص السائل.
- مرة واحدة توقف زجاجي المتدفقة من الحفرة، اضافة الى وجود إبرة حادة العضوية تعلق على حقنة هاميلتون مسبقة مع تقدمي تتبع صبغفي حفرة. تنبيه: أدخل الإبرة ببطء لتجنب ثقب الجانب الآخر من العين أو إتلاف العدسة.
- حقن ببطء صبغ في العين. عادة، يتم استخدام بكتيريا الكوليرا الوحيدات β مترافق لاليكسا 594، 647، 488 أو (CTB-594، CTB-647، أو CTB-488، 5-6 ميكروغرام / ميكرولتر) إلى anterogradely المدخلات RGC التتبع. لحديثي الولادة (≤ P10) 1-2 ميكرولتر كافية وبالنسبة للفئران> P10 ~ 3 ميكرولتر كافية. ملاحظة: الأصباغ اليكسا هي خاصة مقاومة للتدهور الليزوزومية
- ترك الإبرة في ثقب لبضع ثوان ثم إزالة ببطء.
- استخدام القطن يميل قضيب لامتصاص السوائل الزائدة ومنع الصبغة من تسرب.
- تنطبق على كمية صغيرة من مرهم مضاد حيوي للعين. إذا تم فتح العين جراحيا، إعادة برفق الجفون معا.
- إذا حقن كلتا العينين، كرر الإجراء على العين الأخرى.
- بعد الحقن (ق)، وترك الماوس تحت مصباح الحرارة أو على وسادة الحرارة حتى يبدأ في التعافي من anesthESIA.
- العودة الماوس إلى قفص المنزل نظيفة ومراقبة للتأكد من أنها هي مستيقظا تماما قبل أن تعود إلى المستعمرة.
2. تحضير الأنسجة للتصوير
ويستخدم هذا البروتوكول إعداد الأنسجة لمراسل الفئران التي وصفت في البالعات مع علامات الفلورسنت (على سبيل المثال، CX3CR1-EGFP عن الخلايا الدبقية الصغيرة). إذا كان خط مراسل ليست متاحة، ويمكن للمحقق immunostain أقسام الأنسجة (انظر مناقشة).
- ~ 24 ساعة بعد الحقن، والتضحية الماوس وتشريح الدماغ.
- إسقاط إصلاح الدماغ في أنبوب فالكون مليئة بارافورمالدهيد 4٪ (PFA) بين عشية وضحاها في 4 درجات مئوية. تنبيه: PFA سامة. تجنب استنشاق وتعرض الجلد باستخدام في غطاء الدخان أو على طاولة اسفل وارتداء معدات الوقاية الشخصية. ملاحظات: يمكن أن تكون أقصر التثبيت (≥ 4 ساعة). بالإضافة إلى ذلك، بدلا من تثبيت قطرة، 4٪ PFA نضح يمكن استخدامها تليها الإصلاح 2-24 قطرة ساعة. ومع ذلك، مقارنة يرويد لإسقاط العقول حديثي الولادة والكبار ثابتة كشف أي اختلاف في جودة الصورة أو الكمي.
- شطف 3X الدماغ في الفوسفات مخزنة المالحة (PBS).
- صب الدماغ وPFA إلى وزن القارب فارغة.
- استخدام ملعقة لنقل المخ إلى أخرى تزن قارب مليئة برنامج تلفزيوني.
- غسل الدماغ مرتين أكثر في برنامج تلفزيوني (نقل الدماغ لاثنين من أكثر تزن زوارق مليئة PBS).
- نقل الدماغ إلى أنبوب فالكون مليئة حل السكروز 30٪. ترك الدماغ في السكروز في 4 درجات مئوية حتى يغرق الدماغ إلى أسفل الأنبوب (24-48 ساعة).
- مرة واحدة المصارف الدماغ، وإعداد الدماغ لباجتزاء. الخطوات التالية هي إعداد 40 ميكرومتر أقسام العائمة باستخدام مشراح انزلاق مع مرحلة تجميد (ناظم البرد يمكن أن تستخدم أيضا).
- استخدام شفرة حلاقة لإزالة أجزاء من الدماغ غير مطلوبة (للdLGN، وإزالة أجزاء منقاري والذيلية من الدماغ).
- تجميد الصدريةفي رقائق الألومنيوم على أكثر من الثلج الجاف. خلال هذا الوقت، وتجميد المرحلة مشراح وملء كل بئر من 24 لوحة جيدا مع 0.5 مل من 0.1 M العازلة الفوسفات (PB).
- جبل الدماغ المجمدة (يجب أن تظهر مبهمة) على المسرح التجمد.
- تنطبق على كمية صغيرة من درجة الحرارة المثلى القطع مجمع (أكتوبر) إلى خشبة المسرح.
- عندما يبدأ تشغيل OCT لتجميد، يكمن في الدماغ في أكتوبر نهاية الدماغ التي من شأنها أن تقطع ينبغي مواجهة (على سبيل المثال، لdLGN، تواجه الجانب الذيلية متابعة).
- تغطي الدماغ وأكتوبر مع جدا سحقت ناعما الثلج الجاف.
- ترك الثلج الجاف على الدماغ / أكتوبر ل~ 30 ثانية.
- استخدام فرشاة طلاء كبيرة لإزالة الثلج الجاف. ينبغي تجميد الدماغ وأكتوبر إلى المرحلة.
- تبدأ من خلال باجتزاء الأنسجة حتى يتم الوصول إلى المنطقة ذات الاهتمام (ROI).
- مرة واحدة يتم الوصول إلى العائد على الاستثمار، واستخدام فرشاة صغيرة لإزالة الطلاء مقاطع من النصل ونقلها إلى بلات 24 جيدالبريد تحتوي على 0.1 M PB (الخطوة 2.5.2). الحفاظ على فرشاة الطلاء الرطب عن طريق تبليل ذلك في 0.1 م PB قبل ازالة اجزاء من النصل. ملاحظة: أقسام يمكن أن تترك في 0.1 م PB بين عشية وضحاها في 4 درجات مئوية.
- مرة واحدة وقد تم جمع أقسام، تصور وضع العلامات تقدمي تحت المجهر الفلورسنت تشريح واختيار المقاطع التي تحتوي على العائد على الاستثمار.
- جبل أقسام على شريحة بفرشاة الطلاء الصغيرة.
- تطبيق مجموعة صغيرة من 0.1 M PB إلى شريحة المجهر مشحونة.
- نقل قسم الأنسجة إلى تجمع من PB.
- استخدام PB وفرشاة الطلاء لتوجيه ونشر الأنسجة.
- استخدام Kimwipe إلى ذبالة قبالة PB الزائدة. الحرص على تجنب فتل قبالة الباب.
- السماح لهواء جاف تماما.
- تطبيق قطرة صغيرة من تصاعد المتوسطة إلى كل قسم وجبل ساترة على رأس (22 × 50 مم، رقم 1.5).
- ختم حواف الشريحة مع طلاء الأظافر وتخزينها في -20 درجة مئوية حتى جلسة التصوير. ملاحظة: على الرغم من أن التصوير معفي الأسبوع من إعداد وينصح، والشرائح يمكن الحفاظ في -20 درجة مئوية لعدة أسابيع قبل التصوير.
3. التصوير الأنسجة
يتم الحصول على جميع الصور على قرص الغزل المجهر متحد البؤر (UltraView فوكس الغزل القرص المجهر متحد البؤر مجهزة ليزر الصمام الثنائي (405 نانومتر، 445 نانومتر، 488 نانومتر، 514 نانومتر، 561 نانومتر، و 640 نانومتر)). ويمكن أيضا أن الصور يتم الحصول على أي المجهر مع القدرة على اكتساب عالية الدقة ض المداخن (على سبيل المثال، المسح الضوئي ليزر متحد البؤر المجهر، المجهر المجهر epifluorescent تليها deconvolution، الخ). حجم الإطار هو عادة 1،000 خ 1،000 بكسل.
- البحث عن العائد على الاستثمار في 10X التكبير والحصول على صورة. لتصوير الخلايا الدبقية الصغيرة في النظام retinogeniculate، والعائد على الاستثمار هو الأكثر أقسام dLGN وسطي.
- التحول إلى أعلى التكبير (60X هدف خطة آبو، NA = 1.4، ويستخدم عادة).
- الحصول على الحقل الأول نظر تحتوي على البالعات باستخدام 0.2 ميكرون ض خطوةق.
- الحصول على 15-19 الحقول التي تحتوي على أكثر البالعات لكل حيوان.
4. إعداد الصور للالكمي (يماغيج)
- مفتوحة ض المكدس في ImageJ.
- انتقل إلى القائمة صورة، حدد اللون والقنوات سبليت.
- طرح الخلفية من قناة (ق) التي تحتوي على مواد اجتاحت.
- حدد الإطار القناة التي تحتوي على مواد اجتاحت (على سبيل المثال، قبل المشبكي المدخلات).
- انتقل إلى القائمة وحدد خلفية عملية طرح. استخدام المتداول الكرة دائرة نصف قطرها 10 بكسل لتتبع تقدمي المدخلات قبل المشبكي في dLGN. ملاحظة: يتم تحديد نصف قطر الكرة المتداول تجريبيا. ومع ذلك، ينبغي أن يكون بصفة عامة كبيرة مثل نصف قطر أكبر كائن في الصورة التي ليست جزءا من الخلفية.
- سلس القناة التي تحتوي على بلعمية.
- حدد الإطار الذي يحتوي على قناة بلعمية (على سبيل المثال، الخلايا الدبقية الصغيرة).
- انتقل إلى القائمة عملية وقانون حالة الطوارئإلخ فلاتر، يعني. استخدام مرشح متوسط 1.5 (هذا ينعم على الصورة لجعل السطح في خطوات لاحقة).
- طرح الخلفية من القناة التي تحتوي على بلعمية.
- حدد الإطار الذي يحتوي على قناة بلعمية (على سبيل المثال، الخلايا الدبقية الصغيرة).
- انتقل إلى القائمة عملية، حدد خلفية طرح (إعدادات سوف تحتاج إلى أن تحدد تجريبيا). استخدام المتداول من نصف قطر الكرة 50 بكسل لالخلايا الدبقية الصغيرة-EGFP إيجابية.
- دمج القنوات عن طريق الذهاب إلى قائمة صورة واختيار اللون، قنوات دمج.
- ROI المحاصيل التي تحتوي على بلعمية من ملف دمج (وهذا يجعل السطح تقديم أسرع، راجع الخطوة 5).
- رسم مربع حول العائد على الاستثمار باستخدام أداة مستطيلة التحديدات في شريط الأدوات.
- اذهب إلى قائمة صورة وحدد المحاصيل.
- تقسيم القنوات مرة أخرى (راجع الخطوة 4.2).
- حفظ كل قناة كملف TIFF تلقاء نفسها.
5. إعداد صورة للالكميفي Imaris
- مفتوحة Imaris وتأكد من أن يتم تحديد رمز حجم الصوت في القائمة اليسرى العليا (الشكل 2).
- فتح القناة الأولى من الصورة التي تم اقتصاصها (أي من القنوات يمكن فتح الأولى، فقط أن تكون متسقة).
- إضافة قناة أخرى (ق). انتقل إلى القائمة تحرير، حدد إضافة قنوات وحدد القناة التالية في الملف. (كرر هذه الخطوة أي قنوات المتبقية). ملاحظة: لتغيير لون، انتقل إلى عرض نافذة التعديل وانقر على اسم القناة (الشكل 3A). وهذا إحضار مربع الحوار لضبط اللون. إذا كانت نافذة العرض التعديل غير مرئية، انتقل إلى القائمة تحرير واختر عرض التعديل.
- ضبط القيم بكسل. انتقل إلى القائمة تحرير واختر خصائص الصورة. في هذا الإطار، وضبط خ، ذ، ض والقيم بكسل (هذه القيم تعتمد على المجهر، والهدف، وكاميرا، واكتساب ض خطوة ويمكن العثور عليها في البرمجيات المستخدمة لاكتساب صورة).
- سوف الخطوة 5.5 يؤدي إلى غايةالصورة الصغيرة. لتغيير حجم، انقر على أيقونة صالح في أسفل الزاوية اليمنى (الشكل 2).
- في نافذة العرض التكيف، وضبط السطوع والتباين لكل قناة باستخدام مثلثات اليسار والوسط.
6. 3 الأبعاد (3D) جعل سطح بلعمية
- في شريط الأدوات العلوي، تأكد من تحديد وضع فق (الشكل 3C).
- في نافذة العرض التعديل، قم بإلغاء جميع القنوات باستثناء قناة بلعمية. وهذا إخراجها من مجال الرؤية.
- انقر فوق رمز التقديم السطح (الشكل 2).
- سيتم عرض إطار خلق في أسفل اليسار (الشكل 4A)، تأكد من القطاع ROI لم يتم التحقق منه في هذا الإطار الأول. انقر على الزر الأزرق قدما في الأسفل.
- ضبط تجانس.
- في الإطار التالي، واختيار القناة بلعمية من القائمة المنسدلة (الشكل 4B). هذا يضبطكمية التفاصيل التي سيتم ظهرت وينبغي أن تحدد تجريبيا (وعادة ما تستخدم 0.1 ميكرون لتجانس الخلايا الدبقية الصغيرة).
- حدد مستوى العتبة المطلقة.
- انقر على الزر الأزرق قدما في الأسفل.
- عتبة الصورة.
- انقر على الرسم البياني واسحب حتى يتم ظهرت الصورة بشكل مناسب (الشكل 4C). يتم تحديد هذا تجريبيا عن طريق تناوب الصورة لضمان السطوح الرمادية مضافين على الصورة الفلورسنت هي تمثيل سطح دقيقة. ملاحظات: لتدوير، حدد تنقل في القائمة مؤشر على الجانب الأيمن العلوي من الشاشة (الشكل 3B)، انقر فوق وعقد لتدوير الصورة. للعودة إلى التوجه الصورة الأصلية، اختر المنشأ أسفل اليسار من القائمة عرض.
- انقر على الزر الأزرق قدما في الأسفل.
- في الإطار التالي، هناك خيار لتصفية أي السطوح حسب الحجم، الخ إلا صورة صاخبة جدا، لا تصفية وحذفمرشحات ذ التي تظهر تلقائيا. انقر على السهم الأخضر في أسفل لإنهاء السطح مما يجعل بلعمية. وهناك مجموعة جديدة من علامات التبويب تظهر (الشكل 5)
- إذا لزم الأمر، حذف أي الأسطح التي ليست جزءا من بلعمية من الفائدة.
- تأكد من أن يتم تحديد الخيار في اختيار القائمة مؤشر (الشكل 3B).
- انقر على أي سطح المراد حذفه بحيث يتحول إلى اللون الأصفر. لحذف أسطح متعددة، انقر على السطوح أثناء الضغط باستمرار على زر التحكم.
- انقر فوق حذف ضمن علامة التبويب قلم رصاص.
- اختيار ودمج جميع الأسطح من بلعمية في سطح واحد.
- انقر على القمع (أي علامة التبويب تصفية؛ الشكل 5C).
- انقر فوق إضافة.
- اختيار أي مرشح، اسحب الرسم البياني لأقصى اليسار (يجب أن تكون جميع الأسطح الصفراء).
- العودة إلى علامة التبويب قلم رصاص وانقر توحيد.
- انتقل إلى علامة التبويب الرسم البياني (الشكل 5A (الشكل 5D). لعرض معلمات متعددة، انتقل إلى رمز مفتاح في الجزء السفلي الأيسر (الشكل 2) وحدد المعلمات لتسجيل.
- تسجيل حجم بلعمية وحفظ الملف قبل المتابعة.
7. 3D التقديم سطح اجتاحت المواد
- إنشاء قناة جديدة للمواد التي تم اجتاحت من قبل بلعمية.
- بينما يتم تحديد السطح بلعمية، انقر فوق علامة التبويب قلم رصاص.
- انقر قناع جميع.
- في الحوار الذي يظهر، حدد القناة المقابلة لمادة اجتاحت (على سبيل المثال، تتبع تقدمي المدخلات قبل المشبكي؛ الشكل 5B).
- تحقق قناة مكررة قبل تطبيق قناع واضغط زر موافق.
- سوف تظهر قناة جديدة في نافذة العرض التعديل الذي يحتوي فقط على المواد التي تم اجتاحت وداخلبلعمية.
- سطح تجعل القناة التي تحتوي على مجموع المادة واجتاحت nonengulfed.
- قم بإلغاء جميع القنوات في نافذة العرض التعديل باستثناء القناة إلى أن ظهرت وإلغاء السطح إنشاؤها لبلعمية.
- انقر على أيقونة سطح تقديم مرة أخرى (راجع الخطوة 6.3) وإنشاء سطح للقناة باستخدام نفس الخطوات كما هو موضح في بلعمية (الخطوات 6،4 حتي 6،11). ملاحظات: تأكد من تحديد القناة الصحيحة قبل تجانس ومستوى العتبة (الخطوة 6.5؛ الشكل 4B). جعل علما قيمة العتبة (انظر الخطوة 6.6؛ الشكل 4C). كما يمكن الحصول على هذه القيمة بعد تقديم السطح كاملة (علامة التبويب العصا؛ الشكل 5A).
- تسجيل الصوت من مجموع المواد اجتاحت وغير اجتاحت وحفظ الملف قبل المتابعة.
- سطح تقديم المواد اجتاحت (المواد داخل بلعمية).
- تصور مضان فقطقناة جديدة من المواد اجتاحت (راجع الخطوة 7.2.1).
- اتبع نفس الخطوات المذكورة أعلاه (الخطوات 7،2-7،3). ملاحظات: تأكد من تحديد القناة الصحيحة من القائمة المنسدلة قبل تجانس (اختيار القناة الجديدة التي تم إنشاؤها في الخطوة 7.1). في إطار عتبة، يدويا إدخال قيمة العتبة التي تم تعيينها لتقديم مجموع المواد اجتاحت وغير اجتاحت (راجع الخطوة 7.2.2).
- تسجيل حجم المواد اجتاحت وحفظ الملف قبل المتابعة.
8. احسب الحجم الكلي للمجال الرؤية
- إنشاء سطح جديد لأية قناة.
- في إطار مستوى العتبة (الخطوة 6.6)، حرك الرسم البياني على طول الطريق إلى اليسار بحيث يتم ظهرت الحقل بأكمله.
- الانتهاء من السطح الحقل بأكمله وتسجيل حجم (الخطوات 6،7 حتي 6،11).
- حفظ الملف.
9. حساب كمية المواد المبتلعة
- حساب كثافةمجموع اجتاحت وغير اجتاحت القنوات المواد باستخدام الخوارزمية التالية:
حجم إجمالي اجتاحت وغير اجتاحت المواد (الخطوة 7.3) / حجم الحقل (الخطوة 8). - حساب الإحاطة٪ لكل خلية باستخدام الخوارزمية التالية:
(حجم اجتاحت المواد (الخطوة 7.5) / الحجم الإجمالي للبلعمية (الخطوة 6.11)) × 100
ملاحظات: لمراعاة الاختلافات في حجم الخلية، ويتم تطبيع البيانات إلى إجمالي حجم بلعمية. إذا الأرقام من الخطوة 9.1 تختلف اختلافا كبيرا عبر الحقول، قد يكون من الضروري لتطبيع البيانات من الخطوة 9.2 إلى 9.1 في الحساب.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
في الآونة الأخيرة، استخدمنا هذه الإحاطة مقايسة لتصور وقياس بوساطة الخلايا الدبقية الصغيرة بابتلاعها قبل المشبكي المدخلات في النظام retinogeniculate النامية (الشكل 1) 7. RGCs من CX3CR1-EGFP الفئران متخالف تم ارجاعه anterogradely مع CTB-594-647 وCTB في عيون اليسار واليمين، على التوالي. تتبع هذا التتبع، تم تصوير الخلايا الدبقية الصغيرة EGFP إيجابية داخل dLGN. هذه الصور تم في وقت لاحق السطحية المقدمة للقياسات الحجم.
باستخدام هذه التقنية، وجدنا أنه خلال فترة الذروة من إعادة عرض متشابك التنموية داخل dLGN (P5)، واجتاحت المدخلات قبل المشبكي بواسطة الخلايا الدبقية الصغيرة (الشكل 6). في وقت لاحق عدد قليل من 4 أيام عندما كمية كبيرة من إعادة عرض كاملة تقريبا (P9)، هناك انخفاض كبير في كمية المدخلات اجتاحت. بالإضافة إلى ذلك، تتعطل الإحاطة والتقليم في الفئران نقص في البروتينات التي تنتمي إلى تكملة سلسلة الكلاسيكية(الشكل 6)، وكذلك التلاعب التالية من إطلاق الخلايا العصبية (لا تظهر البيانات) 7.
الشكل 1. استراتيجية لتقييم بوساطة الخلايا الدبقية الصغيرة الإحاطة من قبل المشبكي RGC المدخلات 7. A) تخطيطي لتقدمي استراتيجية البحث عن المفقودين. يتم تتبع اليسرى والعين اليمنى RGC المدخلات مع CTB-647 (الازرق) وCTB-594 (الأحمر)، على التوالي. ويتم تقييم بوساطة الخلايا الدبقية الصغيرة (الأخضر) الإحاطة المدخلات في وقت لاحق. ب) منخفضة التكبير صورة ممثل يوم ما بعد الولادة 5 (P5) الماوس dLGN التالية تتبع تقدمي من اليسار (الازرق) والحق (الحمراء) مدخلات العين. شريط النطاق = 100 ميكرومتر. تسى) والخلايا الدبقية الصغيرة (EGFP والأخضر) أخذ عينات من المنطقة الحدودية من ترك (الازرق) والحق (الحمراء) مدخلات العين (أقحم في B). CII) أونج> جميع CTB مضان خارج حجم دبقية تم طرح المدخلات كاشفة RGC (الأحمر والأزرق) التي تم اجتاحت (السهام، وتضخم في الشكل). CIII) جعل سطح الخلايا الدبقية الصغيرة واجتاحت المدخلات RGC. زيادات خط الشبكة = 5 ميكرون. دي) والخلايا الدبقية الصغيرة ممثل (الأخضر وEGFP) من P5 dLGN. وصفت المدخلات RGC مع CTB-594 (الحمراء) ويطلق عليها الجسيمات الحالة مع anti-CD68 (الازرق). الجاذبة) تمت إزالة جميع CTB مضان خارج حجم الخلايا الدبقية الصغيرة كاشفا اجتاحت المدخلات RGC (الحمراء)، والجسيمات الحالة (الازرق) داخل الخلايا الدبقية الصغيرة (الأخضر) وجدت عندهم) معظم مدخلات RGC (الحمراء) ومترجمة بالكامل في غضون-CD68 إيجابي الجسيمات الحالة (الأزرق؛ السهام البيضاء) الدرجة-V) وCD68 (الدرجة) وCTB (DV) القنوات وحدها. شريط النطاق = 10 ميكرومتر. الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم.
"jove_content" FO: المحافظة على together.within صفحة = "دائما"> 
الشكل 2. أيقونات البرامج Imaris.
الرقم 3. النوافذ الملاحة عامة في مجال البرمجيات. A) نافذة عرض التعديل. B) نافذة المؤشر. حدد سيسمح اختيار الأسطح محددة. وسوف تنقل تسمح للدوران من صورة في مجال الرؤية. C) ومن الضروري أن يكون في وضع فق السطح مما يجعل وحدة التخزين.
الشكل 4. تقديم السطحية في مجال البرمجيات. أ) إنشاء النافذة. ب) السلسنافذة جي. حدد القناة إلى السطح من القائمة المنسدلة (باللون الأصفر). C) مستوى العتبة السطح إلى صورة الفلورسنت. أبرزتها المربع الأحمر هو قيمة العتبة التي يجب أن تسجل لمجموع المواد اجتاحت وغير اجتاحت. سيتم تطبيق هذا العدد فيما بعد إلى عتبة السطحية والمواد اجتاحت. الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم.
الرقم 5. الحصول على قياسات حجم في مجال البرمجيات. أ) علامات التبويب التي تظهر جعل السطح التالي. لاحظ العصا، رصاص، القمع، وعلامات الرسم البياني التي يتم تحديدها في النص. ب) قناع تتميز جميعها لتصور المواد اجتاحت داخل بلعمية. لاحظ القناة المختارة (أنتمllow مربع). C) الميزة ضمن علامة التبويب القمع / تصفية يسمح اختيار جميع الأسطح في مجال عن طريق تحريك الرسم البياني على طول الطريق إلى اليسار بحيث يظهر الأصفر. ويمكن اختيار أي مرشح لهذا الغرض. D) ضمن علامة التبويب الرسم البياني، وقياسات حجم يمكن الحصول عليها وتسجيلها. الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم.
الرقم 6. البيانات الممثل 7. A) الخلايا الدبقية الصغيرة، المقدمة من السطح الممثل P5 (يظهر صورة الفلورسنت في الشكل 1)، P9، P30 وdLGN الماوس. إدراجات الموسع تدل مع خط منقط السوداء.يتم زيادة العلاوات خط الشبكة = 5 ميكرون. ب) الإحاطة المدخلات RGC بشكل ملحوظ خلال التقليم الذروة في dLGN (P5) مقابل الأعمار المتقدمة (P9 وP30). * P <0.001 من جانب واحد في اتجاه وأنوفا، ن = 3 الفئران / العمر. C) الخلايا الدبقية الصغيرة من الفئران نقص في تكملة مستقبلات 3 (KO، شريط أسود) تبتلع المدخلات RGC أقل بكثير بالمقارنة مع تتزاحم WT (شريط أبيض). جميع البيانات هي تطبيع مع القيم تحكم WT. * P <0.04 عن طريق اختبار t الطالب، ن = 3 الفئران / النمط الجيني. جميع أشرطة الخطأ تمثل SEM اضغط هنا لمشاهدة صورة أكبر.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
من أجل قياس بدقة البلعمة، ويجب أن يكون المسمى المواد غارقة في مثل هذه الطريقة التي يمكن للباحث تصور مرة واحدة حدث تدهور الليزوزومية. بالإضافة إلى ذلك، مطلوب عالية الدقة والتصوير، تليها استخدام البرمجيات التي تمكن الباحث لتصور حجم الخلية بأكملها وتحديد محتوياته. في هذا البروتوكول، ونحن تصف طريقة موثوق بها للغاية وكمي لقياس بوساطة بلعمية الغمر باستخدام CTB مترافق إلى الأصباغ اليكسا لتسمية المواد اجتاحت جنبا إلى جنب مع ارتفاع القرار متحد البؤر المجهري وإعادة الإعمار 3D. وقد استخدمت هذه المنهجية في المختبر لتحليل الخلايا الدبقية الصغيرة بوساطة الإحاطة المدخلات قبل المشبكي فيخضع لعمليات متشابك في مخ الفأر النامية (نظام retinogeniculate) 7 بنجاح. بالإضافة إلى ذلك، وقد ثبت أن تكون تقنية حساسة للغاية التي يمكن تمييز التغييرات الطفيفة في الإحاطة عبر العصور التنموية المختلفة undeص الظروف غير المرضية وبين wildtype وخروج المغلوب الفئران. مع تعديلات طفيفة، وهذا البروتوكول يمكن تكييفها لدراسة الغمر في الأنسجة الحية قبل مرور وقت التصوير. بالإضافة إلى ذلك، هذا البروتوكول يمكن تطبيقها على دراسة التفاعلات بلعمية الخلايا العصبية في مرض.
المحاذير
أحد الجوانب الأكثر فائدة من هذا الاختبار هو القدرة على تسمية التوقعات العصبية في مثل هذه الطريقة أنها تبقى مرئية بعد دخول الليزوزومية تدهور المسار. ومع ذلك، لأنه يتم تسمية الخلايا العصبية، فإنه قد يكون من الصعب التمييز بين ما جزءا من خلية تم المبتلعة. هذا يتطلب تحليلا دقيقا جدا الإقليمية (على سبيل المثال، المنطقة متشابك مقابل منطقة غير متشابك من dLGN) جنبا إلى جنب مع المجهر الإلكتروني 7. بالإضافة إلى ذلك، وهذا قد تكون أكثر صعوبة في مناطق الدماغ الأخرى التي يقيم فيها أجسام الخلايا العصبية والتوقعات في نفس المنطقة. ومع ذلك، يمكن استخدام استراتيجيات بديلة وضع العلامات (انظر بيلآه). وعلاوة على ذلك، ويرجع ذلك إلى حدود القرار من المجهر الضوئي، وهناك احتمال أن يجوز لأحد أن نبالغ في تقدير كمية المواد اجتاحت. ونتيجة لذلك، يجب الحرص على التحقق من أن المواد اجتاحت ضمن الجسيمات الحالة. لهذا السبب، ونحن نستخدم مكافحة CD68 لتسمية الجسيمات الحالة داخل الخلايا الدبقية الصغيرة، 3D التقديم، والآراء متعامد للتحقق من صحة المعلمات من الفحص.
أنواع الخلايا
بالإضافة إلى الخلايا الدبقية الصغيرة، ويمكن أيضا أن تطبق هذه المنهجية لتحليل دور البالعات أخرى في الدماغ (مثل الخلايا النجمية) وفي الجهاز العصبي والمناعي الطرفية (مثل خلايا شوان perisynaptic، الضامة، الخ). بالإضافة إلى ذلك، لأن CTB مترافق إلى الأصباغ اليكسا يؤخذ بهذه السهولة من قبل معظم الخلايا، وهي استراتيجية وضع العلامات مماثلة يمكن أن تستخدم لتسمية المواد اجتاحت جميع أنحاء الدماغ وأجهزة الجسم الأخرى.
وسم المواد اجتاحت
باعتبارها آلternative إلى CTB مترافق لاليكسا الأصباغ، وقد استخدمنا الاستراتيجيات التالية لتسمية المواد اجتاحت 7: 1) الفئران مراسل الفلورسنت التي وصفت RGCs مع بروتين فلوري (على سبيل المثال، tdTomato، EGFP، الخ). 2) وضع العلامات تقدمي مع صبغة pHrodo مترافق إلى ديكستران، صبغة تتفلور مرة واحدة فقط بل هو في يحلول. باستخدام هذه الاستراتيجيات المختلفة، والتصور وتقدير من المدخلات قبل المشبكي اجتاحت داخل الخلايا الدبقية الصغيرة يمكن أن يكون performedwith نفس تقنيات التصوير والكمي. ومع ذلك، فإن تقارن صبغ اليكسا هي أقوى بسبب مقاومة عالية من الصبغة اليكسا لالليزوزومية hydrolases 7،21. بالإضافة إلى ذلك، تم الشروع في وضع العلامات على المواد اجتاحت مع الأجسام المضادة (على سبيل المثال، ومكافحة VGlut2، وهو بروتين الحويصلي قبل المشبكي). ومع ذلك، وهذا هو أسلوب لا يمكن الاعتماد عليها نسبيا من الكشف نظرا لأن معظم البروتينات يتم كسر بسرعة إلى أسفل مرة واحدة في الجسيمات الحالة. فمن الصعب التمييز مضان منخفضة بسببإلى تدهور البروتين على الخلفية.
الحيوانات المستخدمة
في البروتوكول الحالي، والخلايا الدبقية الصغيرة fluorescently المسمى وراثيا باستخدام الفئران مراسل فلوري (CX3CR1-EGFP) 22. ومع ذلك، هناك الحالات التي وضع العلامات الضد مقابل التعبير الجيني للبنيات مراسل الفلورسنت ضروري. على سبيل المثال، عند الفئران مراسل الفلورسنت ليست متاحة للبلعمية من الفائدة، واستخدام الفئران أمر ضروري، أو يود الباحث أن ننظر إلى الفئران خروج المغلوب دون عبور لهم إلى مراسل خط الماوس الفلورسنت. لحالات مثل هذه، البالعات يمكن أن توصف باستخدام المناعية والبيانات قابلة للمقارنة مع النتائج من التجارب باستخدام الفئران مراسل فلوري 7. باجتزاء الأنسجة التالية، ونحن عادة استخدام بروتوكول المناعية القياسية لأقسام العائمة 7. فمن المهم لاختيار الأجسام المضادة التي أثيرت ضد البروتين الذي سوف تسمية الخلية بأكملها وعملياتها. على سبيل المثال، لتسمية الخلايا الدبقية الصغيرة، ومكافحة Iba1 يمكن استخدامها.
أوسع التطبيقات: يعيش التصوير والأمراض
في حين يستند هذا البروتوكول على تحليل الأنسجة الثابتة، فإن تعديلات طفيفة تمكين نفس التحليل في الصور التي حصل عليها التصوير الحي. عقب جلسة التصوير مرور الوقت، وبعد ذلك ض مداخن يمكن معالجتها متطابقة إلى الخطوات 4-9 في هذا البروتوكول. وعلاوة على ذلك، في حين أن لدينا تطبيق هذا البروتوكول لتصور بابتلاعها من نقاط الاشتباك العصبي خلال إعادة عرض متشابك التنموية في الجهاز العصبي المركزي صحية، وهذا البروتوكول يمكن أن تطبق أيضا في نماذج المرض. على وجه الخصوص، هذا البروتوكول يمكن استخدامها لدراسة الأمراض التي تخضع لنقاط الاشتباك العصبي إعادة عرض كبيرة، كما هو الحال في حالة فقدان المشبك والتجديد التالية اصابات الحبل الشوكي، وفقدان المشبك المبكرة المرتبطة بمرض الزهايمر، وغيرها 12،14-19،23 - 26. بالإضافة إلى ذلك، يمكن للمرء أيضا التكيف مع هذه التقنية لدراسة الأمراض التي phagوقد وصفت ocytosis من المواد الأخرى من نقاط الاشتباك العصبي، مثل الخلايا الدبقية الصغيرة / بوساطة البلاعم الإحاطة المايلين في مرض المزيل (على سبيل المثال، والتصلب المتعدد) والإحاطة بيتا اميلويد في مرض الزهايمر 5،6،27-29.
في الختام، مقايسة الإحاطة الموصوفة هنا تقدم تقنية مريحة، واستنساخه، وحساسة لدراسة التفاعلات بلعمية مع بيئتهم خارج الخلية. الأهم من ذلك، هذا الاختبار لديها مجموعة واسعة من الاستخدامات والقدرات التي من شأنها خدمة المجتمع الأعصاب فضلا عن أولئك الذين يعملون في أجهزة الجسم الأخرى.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
أعلن عن أي تضارب في المصالح.
Acknowledgments
وأيد العمل من المنح المقدمة من مؤسسة سميث الأسرة (BS)، ومؤسسة دانا (BS)، جون برنامج علماء ميرك (BS)، NINDS (RO1-NS-07100801؛ BS)، NRSA (F32-NS-066698؛ DPS)، نانسي لوري ماركس مؤسسة (DPS)، المعاهد الوطنية للصحة (P30-HD-18655؛ MRDDRC التصوير الأساسية).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Heat pad | Vet Equip, Inc. | 965500 | |
| Warm water source for heat pad | Kent Scientific | TP-700 | |
| Stereo microscope | DSC Optical | Zeiss Opmi -6 Surgical Microscope | |
| Sliding microtome with freezing stage | Leica | SM2010 R | |
| Microtome blade | Leica | 14021607100 | |
| Fluorescent dissecting microscope | Nikon | SMZ800 with Epi-fluorescence attachment | |
| Spinning disk confocal microscope | Perkin Elmer | UltraView Vox Spinning Disk Confocal | |
| 10 µl Hamilton gas tight syringes | Hamilton | 80030 | Use a different syringe for each color dye/tracer |
| Hamilton needles | Hamilton | 7803-05, specifications: blunt, 1.5" | |
| Alexa-conjugated cholera toxin β subunit (CTB) | Invitrogen | 488: C22841 | Reconstitute in sterile saline, 80 µl (488), 100 µl (594), 20 µl (647) |
| 594: C22842 | |||
| 647: C34778 | |||
| Phosphate Buffered Saline (PBS) | Sigma | P4417-50TAB | |
| Neomycin and Polymyxin B Sulfates and Bacitracin Zinc Ophthalmic Ointment USP (antibiotic ointment) | Bausch & Lomb | 24208-780-55 | |
| 30.5 G needle | Becton Dickinson | 305106 | |
| Spring scissors | Roboz | RS-5630 | |
| Cotton-tipped applicator | Fisher | 23-400-125 | |
| Paraformaldeyde (PFA) | Electron Microscopy Sciences | 15710 | Dilute 16% to 4% in PBS. Paraformaldehye is toxic, use in a fume hood and wear personal protective equipment. |
| Dissection tools – scissors, forceps, spatula | Small scissors: Fine Science Tools | Small scissors:14370-22 | |
| Large scissors: Roboz | Large scissors: RS-6820 | ||
| #55 forceps: Fine Science Tools | #55 forceps: 11255-20 | ||
| Spatula: Ted Pella, Inc. | Spatula: 13504 | ||
| Sucrose | Sigma | S8501-5KG | Make 30% sucrose in PBS (weight/vol) |
| OCT Compound | VWR | 25608-930 | |
| Weigh boat | USA Scientific | 2347-1426 | |
| 24-well plates | BD Biosciences | 353047 | |
| Sodium phosphate monobasic | Sigma | S6566-500G | Make 0.2 M sodium phosphate monobasic (PB-A) in ddH2O and 0.2 M sodium phosphate dibasic (PB-B) in ddH2O. To make 0.1 M PB, combine 19 ml PB-A and 81 ml PB-B, fill to 200 ml with ddH2O |
| Sodium phosphate dibasic | Sigma | S5136-500G | |
| Coverslips, 22 X 50 mm, No. 1.5 | VWR | 48393 194 | |
| Charged microscope slide | VWR | 48311-703 | |
| Vectasheild | Vector Laboratories | H-1200 |
References
- Ransohoff, R. M., Perry, V. H. Microglial physiology: unique stimuli, specialized responses. Annu Rev Immunol. 27, 119-145 (2009).
- Aguzzi, A., et al. Microglia: scapegoat, saboteur, or something else. Science. 339 (6116), 156-161 (2013).
- Tremblay, M. E., et al. The role of microglia in the healthy brain. J Neurosci. 31 (45), 16064-16069 (2011).
- Hanisch, U. K., Kettenmann, H. Microglia: active sensor and versatile effector cells in the normal and pathologic brain. Nat. Neurosci. 10 (11), 1387-1394 (2007).
- Sierra, A., et al. Janus-faced microglia: beneficial and detrimental consequences of microglial phagocytosis. Front Cell Neurosci. 7, (2013).
- Dheen, S. T., et al. Microglial activation and its implications in the brain diseases. Curr Med Chem. 14 (11), 1189-1197 (2007).
- Schafer, D. P., et al. Microglia sculpt postnatal neural circuits in an activity and complement-dependent manner. Neuron. 74 (4), 691-705 (2012).
- Katz, L., Shatz, C. Synaptic activity and the constuction of cortical circuits. Science. 274 (5290), 1133-1138 (1996).
- Sanes, J. R., Lichtman, J. W. Development of the vertebrate neuromuscular junction. Annu Rev Neurosci. 22, 389-442 (1999).
- Hua, J. Y., Smith, S. J. Neural activity and the dynamics of central nervous system development. Nat Neurosci. 7 (4), 327-332 (2004).
- Holtmaat, A., Svoboda, K. Experience-dependent structural synaptic plasticity in the mammalian brain. Nat Rev Neurosci. 10 (9), 647-658 (2009).
- Butz, M., et al. Activity-dependent structural plasticity. Brain Res Rev. 60 (2), 287-305 (2009).
- Bruel-Jungerman, E., et al. Brain plasticity mechanisms and memory: a party of four. Neuroscientist. 13 (5), 492-505 (2007).
- Schafer, D. P., Stevens, B. Synapse elimination during development and disease: immune molecules take centre stage. Biochem Soc Trans. 38 (2), 476-481 (2010).
- Alexander, A., et al. The complement system: an unexpected role in synaptic pruning during development and disease. Annu Rev Neurosci. 35, 369-389 (2012).
- Brown, A., Weaver, L. C. The dark side of neuroplasticity. Exp Neurol. 235 (1), 133-141 (2012).
- Navarro, X. Chapter 27: Neural plasticity after nerve injury and regeneration. Int Rev Neurobiol. 87, 483-505 (2009).
- Tan, A. M., Waxman, S. G. Spinal cord injury, dendritic spine remodeling, and spinal memory mechanisms. Exp Neurol. 235 (1), 142-151 (2012).
- Wolpaw, J. R., Tennissen, A. M. Activity-dependent spinal cord plasticity in health and disease. Annu Rev Neurosci. 24, 807-843 (2001).
- Schafer, D. P., et al. The "quad-partite" synapse: Microglia-synapse interactions in the developing and mature CNS. Glia. 61 (1), 24-36 (2013).
- Mukhopadhyay, S., et al. Manganese-induced trafficking and turnover of the cis-Golgi glycoprotein GPP130. Mol Biol Cell. 21 (7), 1282-1292 (2010).
- Jung, S., et al. Analysis of fractalkine receptor CX(3)CR1 function by targeted deletion and green fluorescent protein reporter gene insertion. Mol Cell Biol. 20, 4106-4114 (2000).
- Knobloch, M., Mansuy, I. M. Dendritic spine loss and synaptic alterations in Alzheimer's disease. Mol Neurobiol. 37 (1), 73-82 (2008).
- Masliah, E., et al. Synaptic remodeling during aging and in Alzheimer's disease. J Alzheimers Dis. 9 (3 Suppl), 91-99 (2006).
- Yoshiyama, Y., et al. Synapse loss and microglial activation precede tangles in a P301S tauopathy mouse model. Neuron. 53 (3), 337-351 (1016).
- Milnerwood, A. J., Raymond, L. A. Early synaptic pathophysiology in neurodegeneration: insights from Huntington's disease. Trends Neurosci. 33 (11), 513-523 (2010).
- Noda, M., Suzumura, A. Sweepers in the CNS: Microglial Migration and Phagocytosis in the Alzheimer Disease Pathogenesis. Int J Alzheimers Dis. , (2012).
- Rotshenker, S. Microglia and macrophage activation and the regulation of complement-receptor-3 (CR3/MAC-1)-mediated myelin phagocytosis in injury and disease. J Mol Neurosci. 21 (1), 65-72 (2003).
- Smith, M. E. Phagocytosis of myelin in demyelinative disease: a review. Neurochem Res. 24 (2), 261-268 (1999).
