Summary
Microglia são as células do sistema imunológico residentes do sistema nervoso central (SNC), com uma elevada capacidade de fagocitar ou engolir o material no seu ambiente extracelular. Aqui, um ensaio amplamente aplicável, confiável e altamente quantitativa para visualizar e medir engulfment mediada por microglia de componentes sinápticas é descrito.
Abstract
A fagocitose é um processo em que uma célula engole o material (célula inteira, as peças de uma célula, de detritos, etc) no seu ambiente extracelular circundante e subsequentemente digere este material, normalmente, através da degradação lisossomal. Microglia são as células do sistema imunológico residentes do sistema nervoso central (SNC), cuja função fagocítica tenha sido descrito em uma ampla gama de condições de doença neurodegenerativa (por exemplo, depuração da beta-amilóide na doença de Alzheimer), para o desenvolvimento do cérebro saudável (por exemplo, sináptica poda) 1-6. O protocolo a seguir é um ensaio engulfment desenvolvido para visualizar e quantificar engulfment mediada por microglia de entradas pré-sinápticos no sistema retinogeniculate rato em desenvolvimento 7. Embora este ensaio foi utilizado para avaliar a função da microglia, neste contexto, em particular, uma abordagem similar pode ser utilizado para avaliar outros fagócitos em todo o cérebro (por exemplo, astrócitos) e o resto do corpo(por exemplo, macrófagos periférica), bem como outros contextos em que a remodelação ocorre sináptica (por exemplo, lesão cerebral / doença).
Introduction
Circuitos sinápticos remodelar ao longo da vida de um animal. No cérebro em desenvolvimento, formam sinapses em excesso e devem ser submetidos a poda sináptica, que envolve a remoção seletiva de um subconjunto de sinapses e para a manutenção e fortalecimento das sinapses que permanecem 8-10. Este processo é necessário para conseguir a característica de conectividade precisa do sistema nervoso adulto. No adulto, as sinapses também pode ser de plástico, em particular no contexto da aprendizagem e da memória. As correlações estruturais desta plasticidade são pensados para incluir a adição e / ou eliminação das espinhas dendriticas e boutons pré-sinápticos 11-13. Em adição a estes papéis no sistema nervoso saudável, remodelação sináptica também está envolvido em doenças do sistema nervoso 12,14,15 / lesão. Por exemplo, após a lesão medular, os axônios cortados posteriormente deve remodelar e formar novas sinapses para alcançar funcional 16-19 recuperação.
nt "> Emergindo como um aspecto importante da plasticidade sináptica é o processo de fagocitose ou imersão das sinapses destinados à remoção 3,5,20. Recentemente, mostrou esse fenômeno no contexto de poda sináptica no saudável, pós-natal do rato do cérebro 7. Especificamente , microglia, os residentes do SNC células do sistema imunológico e fagócitos, foram mostrados para engolir entradas pré-sinápticas durante um período de pico e em uma região de poda sináptica de desenvolvimento, o pós-natal geniculado lateral dorsal núcleo (dLGN) do tálamo. bloqueio genética ou farmacológica deste engulfment resultou em déficits contínuos na conectividade sináptica.Neste protocolo, descrevemos um ensaio confiável e altamente quantitativa para medir engulfment mediada por fagócitos de entradas pré-sinápticas. Para os fins deste artigo, este ensaio será apresentado no contexto do sistema de desenvolvimento de retinogeniculate, que inclui as células ganglionares da retina (CGRs) residente na retina queprojectar entradas pré-sinápticas ao dLGN (Figura 1A). Para começar, uma estratégia de marcação anterógrada degradação resistentes lisossomal irá ser descrito, o qual é usado para visualizar as entradas pré-sinápticos específicos RGC-no dLGN (Figura 1) 7,21. Depois desta descrição, uma metodologia detalhada para imagem e medir quantitativamente engulfment usando microscopia confocal combinado com 3 dimensões (3D) superfície de processamento de volume será dado. Esta metodologia baseia-se na preparação de tecido fixo, mas pode também ser adaptado para uso em estudos de imagem ao vivo. É importante, quando o ensaio foi validado no contexto do, sistema de pós-natal retinogeniculate saudável, pode-se aplicar as mesmas técnicas para avaliar outras interacções fagócitos para neurónios em todo o cérebro e durante a doença, assim como a função de fagócitos em outros sistemas orgânicos.
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Protocol
1. Anterógrada Rotulagem de RGC pré-sinápticos Entradas
Nota: Todos os experimentos envolvendo o uso de animais foram revistos e supervisionado pelo cuidado com os animais e uso comitê institucional (IACUC), de acordo com todas as diretrizes do NIH.
- Campo e instrumentos Esterilizar.
- Anestesiar rato com 4 vol% de isoflurano em uma câmara de indução Plexiglas (este isoflurano vol% trabalha para ratos neonatal-adulto). Observe atentamente os ratos para evitar o excesso de anestesiante. CUIDADO: Evitar a inalação de uma evacuação de gás residual de vácuo.
- Depois de 1-3 min, (ratos mais velhos exigirá menos tempo) garantir nível adequado de anestesia é alcançado por beliscar a cauda (ausência de reacção deve ser observado) e observando a taxa de respiração (taxa deve ser lenta e constante).
- Coloque o mouse sob o microscópio estéreo de lado e colocar o nariz cone entrega 3-4 vol% de isoflurano sobre o focinho (recém-nascidos <dia pós-natal 10 (P10) a 4% vol;> P10 ~ 3 vol%).
- Expor a esclera. Para a injecção de recém-nascidos antes da abertura dos olhos, use um par de tesouras pequenas mola para abrir a pálpebra e puxar para trás a pele para expor a esclera. Para ratos mais velhos, use os dedos para puxar a pele ao redor do olho para expor a esclera. ATENÇÃO: Em recém-nascidos, por vezes, um outro corte perpendicular no canto do olho é necessário. Tome cuidado ao cortar o canto da pálpebra como há um vaso sanguíneo que, se cortar, vai sangrar excessivamente.
- Usar uma solução estéril 30,5 L da agulha para perfurar um pequeno furo no lado do olho na linha onde começa a esclerótica. Tome cuidado para não danificar a lente através da inserção da agulha apenas o suficiente para que o chanfro vai para o olho.
- Permitir que o vítreo a fluir para fora do orifício e utilizar um aplicador com ponta de algodão esterilizado para absorver o líquido.
- Uma vez que o vítreo parou fluindo para fora do buraco, inserir uma agulha ended brusco ligado a uma seringa Hamilton pré-carregado com corante rastreamento anterógradono orifício. CUIDADO: Inserir a agulha lentamente para evitar a perfuração do outro lado do olho ou danificar as lentes.
- Lentamente injetar corante no olho. Tipicamente, a toxina da cólera β subunidade conjugado com Alexa 594, 647, ou 488 (CTB-594, CTB-647, ou CTB-488, 5-6 mg / mL) é utilizada para anterogradamente entradas RGC vestigiais. Para recém-nascidos (P10 ≤) 1-2 mL é suficiente e para os ratos> P10 ~ 3 mL é suficiente. Nota: corantes Alexa são particularmente resistentes à degradação lisossomal
- Deixar a agulha no orifício durante alguns segundos e, em seguida, remover-se lentamente.
- Use um aplicador com ponta de algodão para absorver o excesso de líquido e evitar corante vaze.
- Aplicar uma pequena quantidade de pomada antibiótica ao olho. Se olho foi aberto cirurgicamente, reposicione suavemente as pálpebras juntas.
- Se injetar ambos os olhos, repita procedimento no outro olho.
- Após a injecção (s), deixar o mouse em uma lâmpada de calor ou em uma almofada de calor até que ele começa a se recuperar da AnesthAIAS.
- Retorno do mouse para uma gaiola casa limpa e monitorar para ter certeza que está totalmente desperto, antes de voltar para a colônia.
2. Prepare Tissue for Imaging
Este protocolo de preparação do tecido é utilizado para ratinhos repórter em que os fagócitos são marcados com marcadores fluorescentes (por exemplo, CX3CR1-EGFP para microglia). Se uma linha repórter não está disponível, o investigador pode immunostain secções de tecido (ver discussão).
- ~ 24 horas após a injeção, sacrificar o mouse e dissecar o cérebro.
- Gota fixar o cérebro num tubo Falcon cheio com 4% de paraformaldeído (PFA) durante a noite a 4 ° C. CUIDADO: PFA é tóxico. Evitar a inalação e exposição da pele por meio de um exaustor ou em uma mesa de corrente descendente e vestindo equipamentos de proteção individual. Notas: A fixação pode ser mais curto (≥ 4 h). Além disso, em vez de fixação gota, 4% PFA perfusão pode ser usado seguido de uma solução de 2-24 horas gota. No entanto, a comparação de aspergird cair cérebros neonatais e adultos fixos não revelou nenhuma diferença na qualidade da imagem ou quantificação.
- Lavar as 3x cerebrais em tampão fosfato (PBS).
- Despeje o cérebro e PFA em um barco pesar vazio.
- Usar uma espátula para transferir o cérebro a outra pesar barco cheio com PBS.
- Wash cérebro mais duas vezes em PBS (transferência cérebro para mais dois barcos cheios de pesar PBS).
- Transferir o cérebro para um tubo Falcon preenchido com uma solução de sacarose a 30%. Deixar o cérebro em sacarose a 4 ° C até que o cérebro afunda para o fundo do tubo (24-48 h).
- Uma vez que o cérebro se afunda, preparar o cérebro para o corte. Os passos seguintes são a preparação de 40 mM secções flutuantes, utilizando um micrótomo deslizante com um estágio de congelamento (criostato também pode ser utilizado).
- Use uma lâmina de barbear para remover partes do cérebro que não são necessários (para o dLGN, remover as partes rostral e caudal do cérebro).
- Congelar o sutiãdentro em folha de alumínio sobre gelo seco. Durante este tempo, congelar a fase micrótomo e encher cada poço de uma placa de 24 poços com 0,5 ml de 0,1 M de tampão fosfato (PB).
- Monte o cérebro congelado (ele deve aparecer opaco) no palco de congelamento.
- Aplicar uma pequena quantidade de composto a temperatura óptima de corte (OCT) para a fase.
- Uma vez que a outubro começa a congelar, coloque o cérebro nos PTU. O fim do cérebro que vai ser cortado deve estar voltado para cima (por exemplo, para o dLGN, enfrentar o lado caudal para cima).
- Cubra o cérebro e outubro com gelo seco muito finamente picado.
- Deixe gelo seco sobre o cérebro / outubro para ~ 30 seg.
- Utilizar um grande pincel para remover o gelo seco. O cérebro e outubro devem ser congelados para o palco.
- Comece seccionamento através do tecido até que a região de interesse (ROI) é alcançado.
- Uma vez que o ROI é atingido, usar um pequeno pincel para remover seções da lâmina e transferi-los para a 24 poços plate contendo 0,1 M PB (passo 2.5.2). Manter o pincel húmido molhando-o em 0,1 M PB o antes de remover secções da lâmina. Nota: As secções podem ser deixados em 0,1 M PB durante a noite a 4 ° C.
- Uma vez que as seções tenham sido recolhidos, visualizar a marcação anterógrada sob um microscópio de dissecação fluorescente e escolher as seções que contêm o ROI.
- Monte seções em um slide com um pequeno pincel.
- Aplique uma pequena piscina de 0,1 M PB para uma lâmina de microscópio cobrado.
- Transfira a secção de tecido para a piscina de PB.
- Use o PB e pincel para orientar e difundir o tecido.
- Use um Kimwipe para pavio o excesso de PB. Tome cuidado para evitar absorção fora da seção.
- Deixe secar completamente.
- Aplicar uma pequena gota de meio de montagem para cada secção e (22 x 50 mm, N ° 1.5) montar uma lamela por cima.
- Selar bordas de slides com unha polonês e armazenar a -20 ° C até a sessão de imagens. Nota: Embora as imagens comem uma semana de preparação é aconselhada, as lâminas podem ser mantidos à temperatura de -20 ° C durante várias semanas antes da imagiologia.
3. Tissue imagem
Todas as imagens são adquiridas em um disco giratório microscópio confocal (UltraView Vox disco giratório microscópio confocal equipado com lasers de diodo (405 nm, 445 nm, 488 nm, 514 nm, 561 nm e 640 nm)). As imagens também podem ser adquiridos em qualquer microscópio, com a capacidade de adquirir de alta resolução z pilhas (por exemplo, varrimento de laser microscópio confocal, microscopia de epifluorescência seguido de desconvolução, etc.) O tamanho do quadro é tipicamente 1.000 x 1.000 pixels.
- Encontre ROI em aumento de 10x e adquirir uma imagem. For Imaging microglia no sistema retinogeniculate, o ROI é as seções dlgn mais medial.
- Shift para maior ampliação (um objetivo 60X Plano de Apo, NA = 1.4, é normalmente usado).
- Adquirir primeiro campo de visão contendo fagócitos com 0,2 m z-passos.
- Adquirir mais 15-19 campos contendo fagócitos por animal.
4. Preparar imagens para Quantificação (ImageJ)
- Abrir z-stack em ImageJ.
- Vá para o menu Imagem, selecione Cor e Canais Split.
- Subtrair fundo do canal (s) contendo o material engolido.
- Selecione a janela do canal que contém o material engolido (por exemplo, entradas pré-sinápticos).
- Vá para o menu de processos e selecionar Fundo subtrair. Use um raio bola rolar de 10 pixels para o traçado anterógrado de entradas pré-sinápticas no dLGN. Nota: O raio bola rolar é determinado empiricamente. No entanto, este deverá ser tão grande que o raio do maior objecto na imagem que não é parte do fundo.
- Suavizar o canal que contém a fagócitos.
- Selecione a janela do canal que contém a fagócitos (por exemplo, microglia).
- Vá para o menu de processos e select Filtros, média. Use um filtro de média de 1.5 (este suaviza a imagem para a renderização de superfície em etapas posteriores).
- Subtrair fundo do canal que contém a fagócitos.
- Selecione a janela do canal que contém a fagócitos (por exemplo, microglia).
- Vá para o menu Processo, selecione fundo subtrair (configurações terá de ser determinada empiricamente). Use um raio bola rolar de 50 pixels para microglia EGFP-positivo.
- Mesclar canais, indo para o menu Imagem e selecionar cores, Mesclar Canais.
- ROI de culturas contendo fagócitos de arquivo mesclado (isso faz com que a superfície tornando mais rápido, veja o passo 5).
- Desenhe uma caixa em torno do ROI usando a ferramenta seleções retangular na barra de ferramentas.
- Vá para o menu Imagem e selecione Cortar.
- Dividir canais novamente (veja o passo 4.2).
- Salve cada canal como seu próprio arquivo TIFF.
5. Prepare Imagem para Quantificaçãoem Imaris
- Abertas Imaris e certifique-se de que o ícone de volume é selecionado no menu superior esquerdo (Figura 2).
- Abra primeiro canal de imagem recortada (qualquer um dos canais pode ser aberto pela primeira vez, basta ser consistente).
- Adicionar o outro canal (s). Vá para o menu Editar, selecione Adicionar de canais e selecione o canal seguinte no arquivo. (Repita este passo para todos os restantes canais). Nota: Para mudar a cor, vá para a janela de Ajuste de exibição e clique no nome do canal (Figura 3A). Isso fará com que uma caixa de diálogo para ajustar a cor. Se a janela de Ajuste de exibição não estiver visível, vá ao menu Editar e selecione Ajuste de Display.
- Ajuste os valores de pixel. Vá para o menu Editar e selecione Propriedades da imagem. Nesta janela, ajustar x, y, z e os valores de pixel (Estes valores dependem do microscópio, o objectivo, da câmara, e aquisição z-passo e pode ser encontrada no software utilizado para captar a imagem).
- Passo 5.5 irá resultar numa muitopequena imagem. Para redimensionar, clique no ícone do Fit no canto inferior direito (Figura 2).
- Na janela de Ajuste de Display, ajustar o brilho eo contraste para cada canal usando os triângulos da esquerda e do meio.
6. 3 Dimensões (3D) Rendering Superfície do Fagócito
- Na barra de ferramentas superior, verifique se o modo de Ultrapasse é selecionada (Figura 3C).
- Na janela de Ajuste de exibição, desmarque todos os canais, exceto o canal de fagócitos. Isto irá removê-los do campo de visão.
- Clique no ícone de superfície de processamento (Figura 2).
- Uma janela de criar será exibida no canto inferior esquerdo (Figura 4A), certifique-se ROI Segmento está desmarcada nesta primeira janela. Clique no botão azul para a frente na parte inferior.
- Ajuste o alisamento.
- Na janela seguinte, escolha o canal de fagócitos do menu suspenso (Figura 4B). Isto ajusta oquantidade de detalhes que serão tona e deve ser determinado empiricamente (0,1 um alisamento é normalmente usado para microglia).
- Selecione thresholding Absoluto.
- Clique no botão azul para a frente na parte inferior.
- Limiar da imagem.
- Clique no histograma e arraste até que a imagem está à tona de forma adequada (Figura 4C). Esta é determinada empiricamente através da rotação da imagem para garantir as superfícies cinza sobrepostos na imagem fluorescente são uma representação exacta da superfície. Notas: Para rodar, selecione Navegar no menu Pointer no lado superior direito da tela (Figura 3B), clique e segure para girar imagem. Para retornar imagem para orientação original, selecione inferior esquerdo de Origem a partir do menu View.
- Clique no botão azul para a frente na parte inferior.
- Na janela seguinte, há uma opção para filtrar todas as superfícies por tamanho, etc menos que imagem é muito barulhento, não filtrar e eliminar umafiltros y que aparecem automaticamente. Clique na seta verde na parte inferior para terminar superfície tornando a fagócitos. Um novo conjunto de guias aparecerá (Figura 5)
- Se necessário, apagar todas as superfícies que não fazem parte do fagócitos de interesse.
- Certifique-se de que a opção Selecionar é selecionado no menu Pointer (Figura 3B).
- Clique em qualquer superfície a ser eliminado para que ele fica amarelo. Para apagar várias superfícies, clique sobre as superfícies enquanto mantém pressionado o botão de controlo.
- Clique em Excluir na guia Pencil.
- Selecione e mesclar todas as superfícies do fagócitos em uma superfície.
- Clique no funil (ie guia Filtro; Figura 5C).
- Clique em Adicionar.
- Escolha qualquer filtro, arraste o histograma para a extrema esquerda (as superfícies devem ser amarela).
- Volte para a guia Lápis e clique Unify.
- Vá até a aba Gráfico (Figura 5A (Figura 5D). Para exibir vários parâmetros, vá até o ícone de chave inglesa no canto inferior esquerdo (Figura 2) e selecionar parâmetros para gravar.
- Anote o volume da fagócitos e salvar o arquivo antes de continuar.
7. Prestação de superfície 3D de Engulfed material
- Crie um novo canal para o material que foi engolida pelo fagócitos.
- Enquanto a superfície do fagócito estiver selecionada, clique na guia lápis.
- Clique Máscara Tudo.
- No diálogo que aparece, selecione o canal correspondente ao material engolida (por exemplo, o traçado anterógrado de entradas pré-sinápticas; Figura 5B).
- Verifique canal duplicado antes de aplicar a máscara e clique em OK.
- Um novo canal será exibido na janela de Ajuste de exibição que contém apenas o material que foi engolido e está dentro dafagócitos.
- Superfície tornar o canal que contém material de tragado e nonengulfed total.
- Desmarque todos os canais na janela de Ajuste de exibição, exceto para o canal a tona e desmarque a superfície criada para o fagócitos.
- Clique no ícone de renderização de superfície novamente (veja o passo 6.3) e criar uma superfície para o canal usando os mesmos passos descritos para o fagócitos (passos 6,4-6,11). Notas: Não se esqueça de selecionar o canal correto antes da regularização e limiar (passo 6.5; Figura 4B). Anote o valor limite (veja o passo 6.6; Figura 4C). Este valor também pode ser obtida após o processamento da superfície está completa (separador Wand, Figura 5A).
- Anote o volume do material total engolida e não engoliu e salvar o arquivo antes de continuar.
- Superfície tornar o material engolido (material dentro do fagócito).
- Visualizar fluorescência de apenaso novo canal de material engolido (veja o passo 7.2.1).
- Siga os mesmos passos acima (passos 7,2-7,3). Notas: Não se esqueça de selecionar o canal correto no menu suspenso antes de suavização (escolher o novo canal criado no passo 7.1). Na janela do limiar, digite manualmente o valor limite que foi definido para o processamento do material total engolida e não engoliu (veja o passo 7.2.2).
- Anote o volume do material engolido e salvar o arquivo antes de continuar.
8. Calcule o volume total do Campo de Visão
- Criar uma nova superfície para qualquer canal.
- Na janela de limiar (passo 6.6), deslize o histograma todo o caminho para a esquerda de modo que o campo está completamente à tona.
- Termine tona todo o campo e registrar o volume (passos 6,7-6,11).
- Salve o arquivo.
9. Calcular a quantidade de material fagocitado
- Calcula-se a densidade docanal engolida e não engolida total de materiais usando o seguinte algoritmo:
Volume total de Engulfed e não tragou material (passo 7.3) / Volume de campo (etapa 8). - Calcular a% de imersão por célula usando o algoritmo seguinte:
(Volume de Engulfed material (passo 7.5) / volume total do Fagócito (passo 6.11)) x 100
Notas: Para representam variações no tamanho da célula, os dados são normalizados para o volume total do fagócito. Se os números de passo 9.1 é altamente variável entre os campos, pode ser necessária para normalizar os dados a partir do passo 9.2 para o cálculo em 9.1.
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Representative Results
Recentemente, utilizou-se este ensaio de imersão para visualizar e quantificar imersão mediada por microglia de entradas pré-sinápticos no sistema retinogeniculate desenvolvimento (Figura 1) 7. CGR de CX3CR1-EGFP camundongos heterozigotos foram anterogradamente traçada com CTB-594 e CTB-647 para os olhos esquerdo e direito, respectivamente. Após este traçado, microglia EGFP-positivos dentro do dLGN foram fotografadas. Essas imagens foram posteriormente superfície-renderizados para medições de volume.
Usando esta técnica, verificou-se que durante um período de pico de remodelação sináptica de desenvolvimento dentro da dLGN (P5), entradas pré-sinápticas são engolidos por microglia (Figura 6). Como poucos quanto 4 dias mais tarde, quando uma grande quantidade de remodelação é quase completa (P9), existe uma redução dramática na quantidade de entradas tragadas. Além disso, a imersão e poda são interrompidas em ratinhos deficientes em proteínas presentes na cascata clássica do complemento(Figura 6), bem como após a manipulação de disparo neuronal (dados não mostrados) 7.
Figura 1. Estratégia para avaliar engulfment mediada por microglia de RGC entradas pré-sinápticas 7. A) Esquema da estratégia de rastreamento anterógrado. Inputs olho esquerdo e direito RGC são rastreados com CTB-647 (azul) e CTB-594 (vermelho), respectivamente. Mediada por Microglia (verde) imersão dos insumos é posteriormente Uma imagem de baixa ampliação representante do dia pós-natal 5 (P5) do mouse dLGN avaliada. B), após rastreamento anterógrado da esquerda (azul) e direito (vermelho) entradas de olho. Barra de escala = 100 mm. Ci) A microglia (EGFP, verde) amostradas da região de fronteira de esquerda (azul) e direito (vermelho) entradas olho (inserção em B). CII) Ciii) renderização Superfície microglia e engoliu entradas RGC. Incrementos de linha de grade = 5 mm. Di) A microglia representante (verde, EGFP) a partir de P5 dLGN. Inputs RGC são rotulados com CTB-594 (vermelho) e os lisossomos são rotulados com anti-CD68 (azul). Dii) Todos CTB fluorescência fora o volume microglia foi removido revelando engolida entradas RGC (vermelho) e lisossomos (azuis) dentro da microglia . (verde) Diii) A maioria das entradas RGC (vermelho) são completamente localizada dentro de CD68-positive lisossomos (azuis; setas brancas) Div-V) CD68 (Div) e CTB (DV) canais sozinho.. Barra de escala = 10 m. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 2. Ícones do software Imaris.
Figura 3. Janelas de navegação gerais no software. A) A janela de Ajuste de exibição. B) A Janela Pointer. Selecione vai permitir a seleção de superfícies específicas. Navegar permitirá a rotação de uma imagem no campo de vista. C) É necessário estar em modo Surpass superfície para render o volume.
Rendering Figura 4. Superfície em software. A) Na janela de Criar. B) Suaveing janela. Selecione o canal a surgir a partir do menu suspenso (destacado em amarelo). C) limiarização da superfície para a imagem fluorescente. Destaque pela caixa vermelha é o valor limite que deve ser registrado para material total engolida e não engolida. Este número será aplicado depois de limiar e da superfície do material engolido. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 5. Obtenção de medidas de volume em software. A) Guias que aparecem a seguir a renderização de superfície. Observe o Wand, Lápis, Funil e guias Gráfico que são identificados no texto. B) A Máscara todos dispõem de visualizar o material engolido dentro do fagócito. Observe o canal selecionado (yelLow box). C) O recurso sob a guia do funil / filtro permite a seleção de todas as superfícies do campo, fazendo deslizar o histograma todo o caminho para a esquerda para que ele apareça amarelo. Qualquer filtro pode ser escolhido para isso. D) Na guia Gráfico, medidas de volume podem ser obtidas e registradas. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 6. Dados representativos 7. UM) microglia-rendido superfície representativas de P5 (imagem fluorescente é mostrado na Figura 1), P9, P30 e dLGN rato. Inserções aumentados denotada com uma linha pontilhada preto.Incrementos de linha de grade = 5 mm. B) imersão de insumos RGC é significativamente maior durante a poda pico no dLGN (P5) versus idades mais avançadas (P9 e P30). * P <0,001 por ANOVA one-way, n = 3 ratos / idade. C) Microglia de camundongos deficientes em receptor de complemento 3 (KO, barra preta) engolfar significativamente menos insumos RGC, em comparação com ninhada WT (barra branca). Todos os dados são normalizados para os valores de controlo WT. * P <0,04 pelo teste t de Student, n = 3 ratos / genótipo. Todas as barras de erro representam SEM Clique aqui para ver imagem ampliada.
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Discussion
A fim de medir com precisão a fagocitose, material engolido devem ser rotulados de tal forma que o pesquisador possa visualizá-lo uma vez degradação lisossomal ocorreu. Além disso, a elevada resolução de imagem é necessário, seguindo-se a utilização de software que permita o investigador para visualizar o volume de toda a célula e quantificar o seu conteúdo. Neste protocolo, descrevemos um método altamente confiável e quantitativo para medir engulfment mediada por fagócitos usando CTB conjugado com tinturas de Alexa para rotular o material engolido combinado com microscopia confocal de alta resolução e reconstrução 3D. Esta metodologia tem sido utilizada no nosso laboratório para análise com sucesso microglia mediada por imersão de entradas pré-sinápticos em remodelação sináptica no cérebro do rato em desenvolvimento (sistema retinogeniculate) 7. Além disso, ele provou ser uma técnica altamente sensível, que pode distinguir mudanças sutis em imersão em diferentes idades de desenvolvimento under condições não patológicas e entre tipo selvagem e knockout camundongos. Com pequenos ajustes, este protocolo pode ser adaptado para estudar imersão em tecidos vivos por lapso de tempo de imagem. Além disso, este protocolo pode ser aplicado para estudar as interações fagócitos-neurônios na doença.
Advertências
Um dos aspectos mais úteis deste ensaio é a capacidade para rotular projecções neuronais, de tal forma que eles permanecem visíveis depois de entrar numa via de degradação lisossomal. No entanto, porque o neurónio é etiquetado, pode ser difícil distinguir o que parte da célula tem sido fagocitados. Isto requer uma análise muito cuidadosa regional (por exemplo, a região sináptica contra uma região não-sináptica do dLGN), combinada com microscopia eletrônica de 7. Além disso, isso pode revelar-se mais difícil em outras regiões do cérebro onde os corpos celulares neuronais e projecções residem na mesma área. No entanto, podem utilizar-se estratégias alternativas de rotulagem (ver below). Além disso, devido aos limites de resolução de microscopia de luz, existe uma possibilidade de que pode sobrestimar a quantidade de material engolida. Como resultado, é preciso ter cuidado para validar que o material é engolida dentro dos lisossomos. Por esta razão, usamos anti-CD68 para rotular lisossomos dentro microglia, renderização em 3D, e vistas ortogonais para validar os parâmetros do ensaio.
Tipos de células
Além microglia, esta metodologia também pode ser aplicado para analisar o papel de outros fagócitos no cérebro (por exemplo, astrócitos) e nos sistemas nervoso e imunológico periférico (por exemplo, células de Schwann perisynaptic, macrófagos, etc.) Além disso, porque a CTB conjugada com corantes Alexa é tão prontamente absorvido pela maioria das células, uma estratégia de marcação semelhante pode ser usado para marcar o material engolida por todo o cérebro e outros órgãos e sistemas.
Rotulagem de Engulfed material
Como uma alternative a CTB conjugado com corantes Alexa, utilizamos as seguintes estratégias para rotular o material engolido 7: 1) ratos repórter fluorescentes em que CGR foram marcadas com uma proteína fluorescente (por exemplo, tdTomato, EGFP, etc.) 2) rotulagem Anterógrada com um corante pHrodo conjugado com dextrano, um corante fluorescente que só uma vez que ele está em um lisossomo. Usando essas diferentes estratégias, visualização e quantificação dos insumos pré-sinápticos engoliram dentro microglia pode ser performedwith as mesmas técnicas de imagem e quantificação. No entanto, os conjugados de corante Alexa são as mais robusto, devido à alta resistência de corante Alexa para hidrolases lisossomais 7,21. Além disso, a marcação de material engolida com anticorpos (por exemplo, anti-VGLUT2, uma proteína vesicular pré-sináptica) foi tentada. No entanto, este é um método relativamente pouco fiáveis de detecção uma vez que a maioria das proteínas são rapidamente discriminadas uma vez em lisossomas. É difícil distinguir baixa fluorescência devidoa degradação da proteína sobre o fundo.
Animais usados
No protocolo atual, microglia são fluorescente etiquetado utilizando camundongos geneticamente repórter fluorescentes (CX3CR1-EGFP) 22. No entanto, há casos em que é necessária marcação de anticorpos contra a expressão genética das construções repórter fluorescentes. Por exemplo, quando os ratinhos repórter fluorescentes não estão disponíveis para o fagócito de interesse, o uso de ratos é necessário, ou o investigador pretende olhar para ratinhos knockout sem cruzá-los em uma linha de ratinho repórter fluorescente. Para casos como esses, os fagócitos podem ser rotulados com imunohistoquímica e os dados são comparáveis aos resultados de experimentos com camundongos repórter fluorescente 7. Após o corte do tecido, que normalmente usam um protocolo padrão para imunocoloração seções flutuantes 7. É importante escolher um anticorpo criado contra uma proteína que irá marcar a célula inteira eseus processos. Por exemplo, a microglia etiqueta, anti-Iba1 pode ser usado.
Aplicações mais amplas: ao vivo de imagem e Doença
Embora este protocolo é baseado na análise de tecido fixo, pequenas modificações permitiria a mesma análise em imagens obtidas por imagens ao vivo. Após uma sessão de lapso de tempo de imagem, o Z-stacks subsequentes podem ser processados idênticos aos passos 4-9 neste protocolo. Além disso, enquanto nós aplicamos esse protocolo para visualizar engulfment de sinapses durante a remodelação sináptica desenvolvimento no SNC saudável, este protocolo pode também ser aplicada em modelos de doenças. Em particular, o protocolo pode ser utilizado para estudar as doenças em que se submetem as sinapses remodelação substancial, como no caso de perda de sinapses e a regeneração após a lesão da medula espinal, perda de sinapse precoce associada com a doença de Alzheimer, etc 12,14-19,23 - 26. Além disso, pode também adaptar-se esta técnica para estudar as doenças em que phagocytosis de outro material que não tenha sido descrito sinapses, tais como microglia / imersão mediada por macrófagos de mielina em doenças desmielinizantes (por exemplo, esclerose múltipla) e englobamento de beta-amilóide na doença de Alzheimer 5,6,27-29.
Em conclusão, o ensaio de imersão descrito aqui oferece uma técnica conveniente, reprodutível, sensível e para estudar as interacções de fagócitos com o seu ambiente extracelular. Importante, este ensaio tem uma ampla gama de utilizações e capacidades, que servirá a comunidade neuroscience, bem como aqueles que trabalham em outros sistemas orgânicos.
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Disclosures
Não há conflitos de interesse declarados.
Acknowledgments
O trabalho foi suportado por concessões do Smith Family Foundation (BS), Dana Foundation (BS), John Merck Scholars Program (BS), NINDS (SR1-NS-07100801; BS), NRSA (F32-NS-066698; SAD), Nancy Lurie Fundação Marcas (SAD), NIH (P30-HD-18655; MRDDRC imagem Core).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Heat pad | Vet Equip, Inc. | 965500 | |
| Warm water source for heat pad | Kent Scientific | TP-700 | |
| Stereo microscope | DSC Optical | Zeiss Opmi -6 Surgical Microscope | |
| Sliding microtome with freezing stage | Leica | SM2010 R | |
| Microtome blade | Leica | 14021607100 | |
| Fluorescent dissecting microscope | Nikon | SMZ800 with Epi-fluorescence attachment | |
| Spinning disk confocal microscope | Perkin Elmer | UltraView Vox Spinning Disk Confocal | |
| 10 µl Hamilton gas tight syringes | Hamilton | 80030 | Use a different syringe for each color dye/tracer |
| Hamilton needles | Hamilton | 7803-05, specifications: blunt, 1.5" | |
| Alexa-conjugated cholera toxin β subunit (CTB) | Invitrogen | 488: C22841 | Reconstitute in sterile saline, 80 µl (488), 100 µl (594), 20 µl (647) |
| 594: C22842 | |||
| 647: C34778 | |||
| Phosphate Buffered Saline (PBS) | Sigma | P4417-50TAB | |
| Neomycin and Polymyxin B Sulfates and Bacitracin Zinc Ophthalmic Ointment USP (antibiotic ointment) | Bausch & Lomb | 24208-780-55 | |
| 30.5 G needle | Becton Dickinson | 305106 | |
| Spring scissors | Roboz | RS-5630 | |
| Cotton-tipped applicator | Fisher | 23-400-125 | |
| Paraformaldeyde (PFA) | Electron Microscopy Sciences | 15710 | Dilute 16% to 4% in PBS. Paraformaldehye is toxic, use in a fume hood and wear personal protective equipment. |
| Dissection tools – scissors, forceps, spatula | Small scissors: Fine Science Tools | Small scissors:14370-22 | |
| Large scissors: Roboz | Large scissors: RS-6820 | ||
| #55 forceps: Fine Science Tools | #55 forceps: 11255-20 | ||
| Spatula: Ted Pella, Inc. | Spatula: 13504 | ||
| Sucrose | Sigma | S8501-5KG | Make 30% sucrose in PBS (weight/vol) |
| OCT Compound | VWR | 25608-930 | |
| Weigh boat | USA Scientific | 2347-1426 | |
| 24-well plates | BD Biosciences | 353047 | |
| Sodium phosphate monobasic | Sigma | S6566-500G | Make 0.2 M sodium phosphate monobasic (PB-A) in ddH2O and 0.2 M sodium phosphate dibasic (PB-B) in ddH2O. To make 0.1 M PB, combine 19 ml PB-A and 81 ml PB-B, fill to 200 ml with ddH2O |
| Sodium phosphate dibasic | Sigma | S5136-500G | |
| Coverslips, 22 X 50 mm, No. 1.5 | VWR | 48393 194 | |
| Charged microscope slide | VWR | 48311-703 | |
| Vectasheild | Vector Laboratories | H-1200 |
References
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