Summary
Mikrogliazellen sind die residenten Immunzellen des zentralen Nervensystems (ZNS) mit hoher Kapazität, in ihren extrazellulären Umgebung phagozytieren oder verschlingen Material. Hier ist eine breit anwendbare, zuverlässige und hoch quantitativen Assay für die Visualisierung und Messung Mikroglia-vermittelte Phagozytose von synaptischen Komponenten beschrieben.
Abstract
Phagozytose ist ein Prozess, in dem eine Zelle verschlingt Material (gesamte Zelle, Zellteile, Schutt, etc.) in der extrazellulären Umgebung umgibt und dieses Material anschließend verdaut, allgemein durch lysosomalen Abbau. Mikrogliazellen sind die residenten Immunzellen des zentralen Nervensystems (ZNS), deren phagozytierenden Funktion in einem breiten Bereich von Bedingungen, die an neurodegenerativen Erkrankungen (z. B. beta-Amyloid-Clearance bei Alzheimer-Krankheit), um die Entwicklung von gesunden Gehirn (zB synaptischen beschrieben Beschneiden) 1-6. Das folgende Protokoll ist ein Einwirkung Assay entwickelt, zu visualisieren und zu quantifizieren Mikroglia-vermittelten Phagozytose von präsynaptischen Eingänge in den Entwicklungs Maus retinogeniculate System 7. Während dieser Assay wurde verwendet, um Mikroglia-Funktion in diesem Zusammenhang zu bewerten, kann ein ähnlicher Ansatz verwendet werden, um andere Phagozyten im Gehirn (beispielsweise Astrozyten) und dem Rest des Körpers zu beurteilen(Z. B. peripheren Makrophagen) sowie andere Kontexte, in denen die synaptische Umbau auftritt (z. B. Hirnverletzung / Krankheit).
Introduction
Synaptischen Schaltungen umzu während der gesamten Lebensdauer des Tieres. In der sich entwickelnden Gehirn, Synapsen im Überschuss und muss synaptischen Beschneidung, die die selektive Entfernung einer Teilmenge von Synapsen und die Erhaltung und Stärkung dieser Synapsen, die 8-10 bleiben beinhaltet zu unterziehen. Dieser Vorgang ist notwendig, um die genaue Verbindungscharakteristik des adulten Nervensystems zu erreichen. Beim Erwachsenen kann Synapsen auch Kunststoff sein, insbesondere im Zusammenhang mit Lernen und Gedächtnis. Die strukturellen Korrelate dieser Plastizität sind gedacht, um das Hinzufügen und / oder Beseitigung von dendritischen Dornen und präsynaptischen Boutons 11-13 enthalten. Zusätzlich zu diesen Rollen in der gesunden Nervensystems, wird synaptischen Umbau auch im Nervensystem Krankheit / Verletzung 12,14,15 beteiligt. Zum Beispiel, nach Rückenmarksverletzungen, abgetrennten Axone müssen anschließend umzugestalten und bilden neue Synapsen, um die funktionelle Erholung von 16 bis 19 zu erreichen.
nt "> Schwellen als ein wichtiger Aspekt der synaptischen Plastizität ist der Prozess der Phagozytose oder Einwirkung von Synapsen für die Entfernung 3,5,20 bestimmt. Wir haben kürzlich gezeigt, dieses Phänomen im Rahmen der synaptischen Rebschnitt in der gesunden, postnatalen Gehirn der Maus 7. Insbesondere Mikroglia, die ansässige ZNS Immunzellen und Fresszellen, wurde gezeigt, präsynaptischen Eingänge während einer Spitzenzeit und in einem Bereich von Entwicklungs synaptischen Rebschnitt, der postnatalen dorsalen seitlichen Kniehöcker (dCGL) des Thalamus zu verschlingen. genetische oder pharmakologische Blockade dieser Einwirkung führte zu anhaltenden Defizite in der synaptischen Verbindungen.In diesem Protokoll beschreiben wir eine zuverlässige und hoch quantitative Assay Phagozyten-vermittelte Phagozytose von präsynaptischen Eingänge messen. Für die Zwecke dieses Artikels wird dieser Test im Rahmen der Entwicklungs retinogeniculate System, das Netzhautganglienzellen beinhalten (RGCs), die sich in der Netzhaut angebracht werden, dassprojizieren präsynaptische Eingänge des dCGL (Fig. 1A). Um zu beginnen, wird ein lysosomalen Degradation beständigen anterograde Markierungsstrategie beschrieben, die verwendet wird, um RGC-spezifischen präsynaptischen Eingänge im dCGL (Fig. 1) 7,21 visualisieren. Nach dieser Beschreibung wird eine detaillierte Methode zur Bildgebung und quantitativen Messung Einwirkung mittels konfokaler Mikroskopie in Kombination mit der 3-dimensionalen (3D) Volumen-Rendering Oberfläche gegeben werden. Diese Methodik basiert auf fixierten Gewebepräparation kann aber auch zur Verwendung bei Echtzeit-Bildgebung Studien angepasst werden. Wichtig ist, während der Test wurde im Rahmen des gesunden, postnatale retinogeniculate Systems validiert worden sind, könnte man die gleichen Verfahren anzuwenden, um andere Phagozyten-Neuron-Interaktionen im Gehirn und während Krankheit sowie Phagozytenfunktion in anderen Organsystemen zu beurteilen.
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Protocol
1. Anterograde Markierung von RGC Präsynaptische Eingänge
Hinweis: Alle Experimente, die die Verwendung von Tieren wurden in Übereinstimmung mit allen NIH-Richtlinien überprüft und durch die institutionelle Pflege der Tiere und die Verwendung Ausschuss (IACUC) überwacht.
- Sterilisieren Feld und Instrumente.
- Anesthetize Maus mit 4 Vol% Isofluran in einem Plexiglas-Induktionskammer (dies Vol% Isofluran arbeitet für Neugeborenen-erwachsenen Mäusen). Beachten Mäuse eng mit Über betäubende vermeiden. VORSICHT: Vermeiden Inhalation mit einer Vakuum Abgas Evakuierung.
- Nach 1-3 min, (älteren Mäusen weniger Zeit benötigen) eine angemessene Höhe der Anästhesie wird durch Kneifen der Schwanz (keine Reaktion zu beachten) und unter Berücksichtigung der Atemfrequenz (Rate sollte langsam und stetig sein) erreicht.
- Zeigen Maus unter dem Stereomikroskop auf die Seite und Ort Nasenkegel liefern 4.3 Vol% Isofluran über der Schnauze (Neugeborenen <postnatalen Tag 10 (P10) ~ 4 Vol.%> P10 ~ 3 Vol.%).
- Setzen Sie die Lederhaut. Für die Injektion von Neugeborenen vor der Augenöffnung, verwenden Sie ein Paar kleine Feder Schere, um die Augenlider zu öffnen, und ziehen Sie die Haut, um die Lederhaut freizulegen. Bei älteren Mäusen, verwenden Sie die Finger, die Haut um die Augen, um die Lederhaut freizulegen zurückziehen. VORSICHT: Bei Neugeborenen, manchmal ein weiterer Schnitt senkrecht an der Ecke des Auges erforderlich ist. Vorsicht beim Schneiden der Ecke des Augenlids, da es ein Blutgefäß, das, wenn geschnitten wird, übermäßig bluten.
- Verwenden Sie eine sterile 30,5 G Nadel ein kleines Loch in der Seite des Auges an der Linie, wo die Lederhaut beginnt zu punktieren. Achten Sie darauf, um eine Beschädigung der Linse, die durch die Nadel gerade weit genug, dass die Kegel geht ins Auge.
- Lassen Sie den Glaskörper, um aus dem Loch fließen, und eine sterile Wattestäbchen, um die Flüssigkeit zu absorbieren.
- Sobald die Glaskörper aus dem Loch mehr fließt, legen Sie eine stumpfe digen Nadel zu einer Hamilton-Spritze mit anterograde Tracing Farbstoff vorinstalliert befestigtin das Loch. ACHTUNG: Setzen Sie die Nadel langsam zu vermeiden Punktion der anderen Seite des Auges oder Beschädigung der Linse.
- Langsam spritzen Farbstoff in das Auge. Typischerweise wird die Choleratoxin β-Untereinheit mit Alexa 594, 647 oder 488 (CTB-594, 647-CTB oder CTB-488, 5-6 ug / ul), konjugiert an anterograd Spur RGC Eingänge verwendet. Für Neugeborene (≤ P10) 1-2 ul ausreichend und für Mäuse> P10 ~ 3 ul ist ausreichend. Hinweis: Alexa-Farbstoffe sind besonders beständig gegen lysosomale Abbau
- Lassen Sie die Nadel in das Loch für ein paar Sekunden und dann langsam zu entfernen.
- Verwenden Sie ein Wattestäbchen, um überschüssige Flüssigkeit zu absorbieren und Farbstoff verhindern ein Auslaufen.
- Eine kleine Menge der Antibiotika-Salbe für die Augen. Wenn Augen wurde operativ geöffnet, die Augenlider leicht zusammen neu zu positionieren.
- Wenn die Injektion beide Augen, wiederholen Verfahren auf anderen Auge.
- Nach der Injektion (en), lassen Maus unter einer Wärmelampe oder auf einem Heizkissen, bis sie beginnt, sich von der Anesth erholenESIA.
- Zurück Maus auf eine saubere Heimkäfig und zu überwachen, um sicherzustellen, dass es ganz wach vor der Rückkehr in der Kolonie.
2. Bereiten Sie für Tissue Imaging
Dieses Gewebe Vorbereitung Protokoll wird für Reporter Mäusen, in denen die Fresszellen mit fluoreszierenden Markern (zB CX3CR1-EGFP für Mikroglia) gekennzeichnet sind, verwendet. Wenn ein Reporter Leitung nicht verfügbar ist, kann der Forscher Gewebeschnitte Immunfärbung (siehe Diskussion).
- ~ 24 Stunden nach der Injektion, opfern die Maus und sezieren das Gehirn.
- Lassen Sie beheben das Gehirn in ein Falcon-Röhrchen mit 4% Paraformaldehyd (PFA) über Nacht bei 4 ° C gefüllt ACHTUNG: PFA ist giftig. Einatmen und Hautkontakt durch Verwendung in einem Abzug oder einem Wartungstisch und das Tragen der persönlichen Schutzausrüstung. Hinweise: Fixation kürzer (≥ 4 h) betragen. Zusätzlich kann anstelle von Tropfenfixierung, 4% PFA Perfusion kann von einem 2-24 Stunden Abgabe fix folgen. Allerdings Vergleich perfused feste Neugeborenen und Erwachsenen Gehirne fallen ergab keinen Unterschied in der Bildqualität oder Quantifizierung.
- Spülen der Gehirn 3x in phosphatgepufferter Salzlösung (PBS).
- Gießen Sie das Gehirn und PFA in ein leeres Boot wiegen.
- Verwenden Sie einen Spachtel, um das Gehirn zu einem anderen zu übertragen wiegen Boot mit PBS gefüllt.
- Wash Gehirn zweimal in PBS (Transfer Gehirn, zwei weitere Boote wiegen mit PBS gefüllt).
- Übertragen des Gehirns zu einem Falcon-Röhrchen mit einer 30% igen Saccharoselösung gefüllt. Das Gehirn verlassen Saccharose bei 4 ° C, bis das Gehirn sinkt auf den Boden des Rohres (24-48 h).
- Sobald das Gehirn sinkt, bereiten das Gehirn für das Schneiden. Die folgenden Schritte sind Herstellung von 40 um unter Verwendung eines schwimmenden Abschnitte Schlittenmikrotom mit einer Gefrierstufe (a Kryostaten kann auch verwendet werden).
- Verwenden einer Rasierklinge Teile des Gehirns, die nicht benötigt werden, zu entfernen (für den dCGL, entfernen Sie die rostralen und kaudalen Teile des Gehirns).
- Frieren Sie den BHin auf Alufolie über Trockeneis. Während dieser Zeit einfrieren des Mikrotoms Bühne und füllen jedes Well einer 24-Well-Platte mit 0,5 ml 0,1 M Phosphatpuffer (PB).
- Montieren Sie den gefrorenen Gehirn (es sollte undurchsichtig erscheinen) über das Einfrieren der Bühne.
- Eine kleine Menge der optimalen Schneidtemperatur Verbindung (OCT) auf die Bühne.
- Nachdem der Oktober beginnt zu frieren, lag das Gehirn im Oktober Das Ende des Gehirns, die geschnitten werden sollte nach oben (zB für die dCGL, das Gesicht der Schwanzseite nach oben).
- Decken Sie das Gehirn und Oktober mit sehr fein gemahlen Trockeneis.
- Lassen Trockeneis auf das Gehirn / Oktober für ~ 30 sek.
- Verwenden Sie eine große Pinsel, um das Trockeneis entfernen. Das Gehirn und Oktober sollte auf der Bühne eingefroren werden.
- Beginnen Schneiden durch das Gewebe, bis der interessierende Bereich (ROI) erreicht wird.
- Sobald der ROI erreicht ist, mit einem kleinen Pinsel auf Abschnitte von der Klinge zu entfernen und sie auf der 24-Loch-Plattforme 0,1 M PB (Schritt 2.5.2). Halten Sie den Pinsel feucht vor dem Entfernen von Abschnitten von der Klinge Netz es in der 0,1 M PB. Hinweis: Profile können in 0,1 M PB über Nacht bei 4 ° C belassen werden
- Sobald Abschnitte gesammelt wurden, visualisieren die anterograde Kennzeichnung unter einem Fluoreszenz-Binokular und wählen Sie Abschnitte, die den ROI enthalten.
- Montieren Abschnitte auf einer Folie mit einem kleinen Pinsel.
- Tragen Sie einen kleinen Pool von 0,1 M PB auf eine geladene Objektträger.
- Übertragen Sie die Gewebeschnitt in den Pool der PB.
- Verwenden Sie die PB und Pinsel zu orientieren und die Ausbreitung der Gewebe.
- Verwenden Sie einen Kimwipe Docht überschüssige PB. Achten Sie darauf, um zu vermeiden, Feuchtigkeitsregulierung von der Sektion.
- Lassen Sie die Luft vollständig trocken.
- Eine kleine Tropfen Eindeckmedium zu jedem Abschnitt und montieren Ein Deckglas (22 x 50 mm, Nr. 1.5).
- Siegel Kanten der Folie mit Nagellack und bei -20 ° C bis Bildgebungssitzung. Hinweis: Obwohl Bildgebung mitin einer Woche der Herstellung ratsam, können Folien bei -20 ° C für mehrere Wochen vor der Bilderzeugung erhalten werden.
3. Tissue Imaging
Alle Bilder werden auf einer drehenden Scheibe konfokalen Mikroskop (Ultra Vox Kreiselscheibenapplikators Konfokalmikroskop mit Diodenlaser (405 nm, 445 nm, 488 nm, 514 nm, 561 nm und 640 nm) ausgestattet ist) erworben. Bilder können auch auf jedem Mikroskop mit der Fähigkeit, hohe Auflösung z-Stapel zu erwerben (z. B. konfokalen Laserrastermikroskop, Epifluoreszenz-Mikroskop, gefolgt durch Entfaltung, etc.) erworben werden. Rahmengröße ist in der Regel 1000 x 1000 Pixel.
- Finden ROI bei 10-facher Vergrößerung und erwerben Sie ein Bild. Zum Abbilden Mikroglia im retinogeniculate System ist der ROI Die mediale dCGL Abschnitte.
- Verschiebung zu höheren Vergrößerung (60X ein Plan Apo Ziel, NA = 1.4, wird in der Regel verwendet wird).
- Erwerben erstes Sichtfeld enthält Phagozyten unter Verwendung von 0,2 &mgr; m z-Schritts.
- Erwerben 15-19 mehr Felder mit Fresszellen pro Tier.
4. Bereiten Sie Bilder für Quantifizierung (ImageJ)
- Öffnen Z-Stapel in ImageJ.
- Gehen Sie zu dem Bild-Menü, wählen Sie Farbe und Split Kanäle.
- Subtrahieren Hintergrund aus dem Kanal (n) mit der Material verschlungen.
- Wählen Sie den Kanal-Fenster den verschlungen Material (z. B. präsynaptischen Eingänge).
- Zum Prozess-Menü und wählen Subtrahieren Hintergrund. Verwenden Sie eine rollende Kugel Radius von 10 Pixeln für anterograde Tracing von präsynaptischen Eingänge im dCGL. Hinweis: Die rollende Kugel Radius wird empirisch ermittelt. Es sollte jedoch im allgemeinen so groß wie der Radius des größten Objektes in dem Bild, die nicht Teil des Hintergrundes.
- Glätten Sie den Kanal mit der Phagozyten.
- Wählen Sie den Kanal-Fenster den Phagozyten (zB Mikroglia).
- Gehen Sie auf die Menü-und Prozess select Filter, Mittelwert. Verwenden Sie eine mittlere Filter von 1,5 (das Bild für die Oberflächen-Rendering in späteren Schritten glättet).
- Subtrahieren Hintergrund aus dem Kanal mit der Phagozyten.
- Wählen Sie den Kanal-Fenster den Phagozyten (zB Mikroglia).
- Zum Prozess-Menü subtrahieren Hintergrund (Einstellungen müssen empirisch bestimmt). Verwenden Sie eine rollende Kugel Radius von 50 Pixeln für EGFP-positiven Mikroglia.
- Merge-Kanäle, indem Sie auf dem Bild-Menü und wählen Sie Farbe, Kanäle zusammenfügen.
- Crop ROI enthält Phagozyten aus zusammengeführt Datei (das macht Oberflächen-Rendering schneller, siehe Schritt 5).
- Zeichnen Sie ein Rechteck um den ROI mit dem rechteckigen Auswahlwerkzeug in der Werkzeugleiste.
- Gehen Sie zu dem Bild-Menü und wählen Sie Zuschneiden.
- Split Kanäle wieder (siehe Schritt 4.2).
- Speichern Sie jeden Kanal als eigene TIFF-Datei.
5. Bereiten Bild für Quantifizierungin Imaris
- Offene Imaris und stellen Sie sicher, dass die Lautstärke-Symbol in der linken oberen Menü (Abbildung 2) ausgewählt.
- Offene ersten Kanal zugeschnittene Bild (jeder der Kanäle geöffnet werden, nur konsequent sein).
- In den anderen Kanal (n). Wählen Sie im Menü Bearbeiten die Option Kanäle hinzufügen, und wählen Sie den nächsten Kanal in der Datei. (Wiederholen Sie diesen Schritt für die restlichen Kanäle). Hinweis: Um die Farbe zu ändern, gehen Sie zur Anzeige Einstellung Fenster und klicken Sie auf den Kanalnamen (Abbildung 3A). Dadurch öffnet sich ein Dialogfeld, um die Farbe anzupassen. Wenn die Anzeige Einstellung nicht angezeigt wird, gehen Sie im Menü Bearbeiten und wählen Sie Anzeige Einstellung.
- Passen Sie die Pixelwerte. Öffnen Sie das Menü Bearbeiten und wählen Sie Image-Eigenschaften. In diesem Fenster einstellen x, y, und z-Pixelwerte (Diese Werte hängen von dem Mikroskop, Ziel-, Kamera-, und z-Schritt-Akquisition und können in der verwendet wird, um das Bild zu erwerben, Software zu finden).
- Schritt 5.5 wird in einer sehr Ergebniskleines Bild. Um zu ändern, klicken Sie auf das Fit-Symbol in der unteren rechten Ecke (Abbildung 2).
- In der Anzeige Einstellung Fenster, die Helligkeit und den Kontrast für jeden Kanal mit der linken und mittleren Dreiecke.
6. 3 Dimensional (3D) Oberflächendarstellung des Phagozyten
- In der oberen Werkzeugleiste sicher, dass die Surpass-Modus ausgewählt (Abbildung 3C).
- In der Anzeige Einstellung Fenster, deaktivieren Sie alle Kanäle mit Ausnahme der Phagozyten-Kanal. Dadurch wird sie aus dem Sichtfeld zu entfernen.
- Klicken Sie auf das Symbol Oberflächen-Rendering (Abbildung 2).
- Ein erstellen Fenster wird in der linken unteren (4A) angezeigt werden, stellen Sie sicher Segment ROI deaktiviert ist in diesem ersten Fenster. Klicken Sie auf die blaue Taste vorne an der Unterseite.
- Stellen Sie die Glättung.
- Im nächsten Fenster wählen Sie die Phagozyten-Kanal aus dem Pull-Down-Menü (Abbildung 4B). Dieser passt dieMenge an Details, die taucht werden und sollte empirisch ermittelt werden (0,1 um Glättung wird in der Regel für Mikroglia verwendet wird).
- Wählen Absolute Schwellen.
- Klicken Sie auf den blauen Knopf vorne an der Unterseite.
- Threshold ist das Bild.
- Klicken Sie auf Histogramm und ziehen Sie, bis Bild wird entsprechend aufgetaucht (4C). Dies wird empirisch durch Drehen des Bildes um sicherzustellen, dass die auf dem Fluoreszenzbild überlagert grauen Flächen sind eine genaue Oberflächendarstellung bestimmt. Hinweise: Um zu drehen, wählen Navigieren Sie im Pointer-Menü auf der rechten oberen Seite des Bildschirms (3B), klicken und halten Bild zu drehen. Um das Bild zu ursprünglichen Ausrichtung zurückzukehren, wählen Origin unten im Menü Ansicht die Linke.
- Klicken Sie auf den blauen Knopf vorne an der Unterseite.
- Im nächsten Fenster gibt es eine Option, um herauszufiltern, keine Flächen nach Größe, etc. Sofern nicht Bild ist sehr laut, nicht filtern und löschen einy-Filter, die automatisch angezeigt. Klicken Sie auf den grünen Pfeil an der Unterseite zum Rendern der Oberfläche beenden Phagozyten. Eine neue Gruppe von Tabs angezeigt (Fig. 5)
- Falls erforderlich, löschen Sie alle Oberflächen, die nicht Teil des Phagozyten von Interesse sind.
- Stellen Sie sicher, dass die Option Wählen Sie im Menü Pointer (3B) ausgewählt.
- Klicken Sie auf die zu löschende Oberfläche, so dass es gelb wird. Um mehrere Flächen löschen, klicken Sie auf den Oberflächen, während Sie die Strg-Taste gedrückt halten.
- Klicken Sie auf der Registerkarte Bleistift Löschen.
- Auswählen und Zusammenführen aller Oberflächen des Phagozyten in einer Oberfläche.
- Klicken Sie auf den Trichter (dh Registerkarte Filter, 5C).
- Klicken Sie auf Hinzufügen.
- Wählen Sie eine beliebige Filter, ziehen Sie das Histogramm zu weit links (alle Oberflächen zu gelb sein).
- Gehen Sie auf der Registerkarte Bleistift und klicken Unify.
- Gehen Sie auf die Registerkarte Grafik (Abbildung 5A (5D). Für die Anzeige von mehreren Parametern, gehen Sie zum Schraubenschlüssel-Symbol unten links (Abbildung 2) und wählen Sie die Parameter für die Aufnahme.
- Nehmen Sie die Lautstärke des Phagozyten und speichern Sie die Datei, bevor Sie fortfahren.
7. 3D-Oberflächen-Rendering Engulfed Werkstoff
- Erstellen Sie einen neuen Kanal für Material, das durch die Phagozyten verschlungen wurde.
- Während die Phagozyten Oberfläche ausgewählt ist, klicken Sie auf der Registerkarte Bleistift.
- Klicken Sie auf Alle Maske.
- In dem Dialog, der erscheint, wählen Sie den Kanal entsprechend verschlungen Material (z. B. anterograde Tracing von präsynaptischen Eingänge; 5B).
- Prüfen Sie vor der Anwendung doppelter Kanal-Maske und klicken Sie auf OK.
- Ein neuer Kanal wird in der Anzeige Einstellung Fenster, die nur das Material, das versenkt wurde und enthält im Inneren die erscheinenPhagozyten.
- Oberfläche machen den Kanal mit insgesamt Engulfed und nonengulfed Material.
- Deaktivieren Sie alle Kanäle in der Anzeige Einstellung Fenster außer dem Kanal aufgetaucht werden, und deaktivieren Sie die Oberfläche für die Phagozyten erstellt.
- Klicken Sie auf das Symbol Oberflächen-Rendering wieder (siehe Schritt 6.3) und eine Fläche für den Kanal mit den gleichen Schritten wie für die Phagozyten beschrieben (Schritte von 6,4 bis 6,11). Hinweise: Achten Sie darauf, den richtigen Kanal vor dem Glätten und Schwellen (Schritt 6,5; 4B) zu wählen. Notieren Sie sich den Schwellenwert (siehe Schritt 6.6; 4C). Dieser Wert kann auch nach der Oberflächenwiedergabe erzielt werden abgeschlossen (Zauberstab Registerkarte, 5A).
- Nehmen Sie die Lautstärke des Gesamt verschlungen und nicht-Material verschlungen und speichern Sie die Datei, bevor Sie fortfahren.
- Oberflächen machen verschlungen Material (Material innerhalb der Phagozyten).
- Visualisieren Fluoreszenz nurder neue Kanal von Material verschlungen (siehe Schritt 7.2.1).
- Führen Sie die gleichen Schritte wie oben (Schritte von 7,2 bis 7,3). Hinweise: Achten Sie darauf, den richtigen Kanal aus dem Pull-Down-Menü vor dem Glätten wählen (wählen Sie den neuen Kanal in Schritt 7.1 erstellt). In den Schwellenfenster, geben Sie manuell den Schwellenwert, der für die Darstellung des Gesamt verschlungen und nicht verschlungen Material (siehe Schritt 7.2.2) festgelegt wurde.
- Nehmen Sie die Lautstärke des Material verschlungen und Datei speichern, bevor Sie fortfahren.
8. Berechnen Sie die Gesamtlautstärke des Field of View
- Erstellen Sie eine neue Oberfläche für jeden Kanal.
- In den Schwellen Fenster (Schritt 6.6), schieben Sie das Histogramm den ganzen Weg auf der linken Seite, so dass das gesamte Feld aufgetaucht.
- Beenden Auftauchen das gesamte Feld und notieren Sie die Lautstärke (Schritte von 6,7 bis 6,11).
- Speichern Sie die Datei.
9. Berechnen Sie die Anzahl der phagozytierten Werkstoff
- Berechnen der Dichte desGesamt verschlungen und nicht verschlungen Material-Kanal mit dem folgenden Algorithmus:
Volumen des Gesamt Engulfed und Non-Engulfed Werkstoff (Schritt 7.3) / Volume of Field (Schritt 8). - Berechnen% Einwirkung pro Zelle mit dem folgenden Algorithmus:
(Volumen der Engulfed Werkstoff (Schritt 7,5) / Gesamtvolumen der Phagozyten (Schritt 6.11)) x 100
Anmerkung: Um die Variationen in der Zellgröße zu berücksichtigen, werden Daten auf das Gesamtvolumen des Phagozyten normalisiert. Wenn Zahlen von Schritt 9.1 sind sehr variabel in Bereichen kann es erforderlich sein, die Daten aus Schritt 9.2 bis 9.1 in der Berechnung zu normalisieren.
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Representative Results
Kürzlich haben wir diesen Test Einwirkung zu visualisieren und zu quantifizieren Mikroglia-vermittelten Phagozytose von präsynaptischen Eingänge in den Entwicklungs retinogeniculate System (Abbildung 1) 7. RGCs von CX3CR1-EGFP heterozygote Mäuse wurden anterograd mit CTB-594 und CTB-647 zurückgeführt in die linke und rechte Auge. Nach dieser Verfolgung wurden EGFP-positiven Mikroglia im dCGL abgebildet. Diese Bilder wurden anschließend zur Volumenmessung Oberfläche gerendert.
Mit dieser Technik haben wir festgestellt, daß während einer Spitzenzeit der Entwicklungs synaptischen Umbau im dCGL (P5), präsynaptische Eingänge durch Mikroglia (6) verschlungen. So wenig wie nach 4 Tagen, wenn eine große Menge von Umbau ist fast vollständig (P9), gibt es eine dramatische Reduktion in der Menge von Eingängen verschlungen. Zusätzlich werden Einwirkung und Beschneiden in Mäusen in Proteinen der klassischen Komplementkaskade gehör defizienten gestört(6) sowie folgende Manipulation neuronale Aktivität (Daten nicht gezeigt) 7.
Abbildung 1. Strategie zur Mikroglia-vermittelten Phagozytose von RGC präsynaptischen Eingänge 7 zu beurteilen. A) Schematische Darstellung der anterograde Tracing-Strategie. Linke und rechte Auge RGC Eingänge sind mit CTB-647 (blau) und CTB-594 (rot), bzw. verfolgt. Mikroglia-vermittelten (grün) Einwirkung der Eingänge wird anschließend ein Vertreter Vergrößerung Bild der postnatalen Tag 5 (P5) Maus dCGL niedrigen folgenden anterograde Tracing von links (blau) und rechts (rot) Augen Eingänge B bewertet.). Maßstabsbalken = 100 um. Ci) Ein Mikroglia (EGFP, grün) aus der Grenzregion von links (blau abgetastet) und rechts (rot) Augen Eingänge (Einschub in B). CII) CIII) Oberflächen Rendering von Mikroglia subtrahiert und verschlungen RGC-Eingänge. Grid Linie Schritten = 5 um. Di) Ein Vertreter Mikroglia (grün, EGFP) von P5 dCGL. RGC Eingänge sind mit CTB-594 (rot) gekennzeichnet und Lysosomen sind mit Anti-CD68 (blau) markiert. Dii) Alle CTB Fluoreszenz außerhalb der Mikroglia Volumen entfernt wurde enthüllt verschlungen RGC-Eingänge (rot) und Lysosomen (blau) in der Mikroglia . weiße Pfeile) Div-v) Die CD68 (div) und CTB (DV)-Kanäle allein;. (grün) Diii) Der RGC-Eingänge (rot) vollständig in CD68-positiven Lysosomen (blau lokalisiert. Maßstabsbalken = 10 um. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Figur zu sehen.
Abbildung 2. Imaris Software Icons.
Abbildung 3. Allgemeine Navigationsfenster in der Software. A) Die Anzeige Einstellung Fenster. B) Der Pointer-Fenster. Wählen wird Auswahl von spezifischen Oberflächen zu ermöglichen. Navigieren ermöglicht die Drehung des Bildes in dem Sichtfeld. C) Es ist notwendig, in sein Surpass Modus für Wiedergabefläche der Lautstärke.
Abbildung 4. Oberflächenwiedergabe in der Software. A) Das Fenster erstellen. B) Glatteing-Fenster. Wählen Sie den Kanal an die Oberfläche aus dem Pull-Down-Menü (gelb markiert). C) Schwellen die Oberfläche der Fluoreszenzbild. Durch den roten Rahmen markiert ist der Schwellenwert, der für die Gesamt verschlungen verschlungen und nicht-Material aufgezeichnet werden soll. Diese Zahl wird später Schwelle angewandt werden und die Oberflächenmaterial verschlungen. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Figur zu sehen.
5. Beziehen Volumenmessungen in Software. A) Tabs, die folgenden Oberflächendarstellung angezeigt. Beachten Sie den Zauberstab, Bleistift, Trichter, und Graph Registerkarten, die im Text. B identifiziert werden) Die Maske verfügen, um verschlungen Material innerhalb der Phagozyten zu visualisieren. Beachten Sie den gewählten Kanal (yellow Kasten). C) Das Merkmal der Registerkarte Trichter / Filter erlaubt die Auswahl von allen Oberflächen im Bereich, indem das Histogramm den ganzen Weg auf der linken Seite, damit es gelb erscheint. Jeder Filter kann für diese. D) auf der Registerkarte Grafik gewählt werden, Lautstärke-Messungen erhalten und aufgezeichnet werden. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Figur zu sehen.
6. Repräsentative Daten 7. A) Repräsentative oberflächen gerendert Mikroglia von P5 (Fluoreszenzbild in Fig. 1 gezeigt), P9 und P30 der Maus dCGL. Grössere Einsätze mit einer schwarzen gestrichelten Linie gekennzeichnet.Grid Linie Schritten = 5 um. B) Engulfment von RGC Eingänge wird deutlich während der Spitzen Rebschnitt im dCGL (P5) gegenüber älteren Altersgruppen (P9 und P30) erhöht. * P <0,001 durch Einweg-ANOVA, n = 3 Mäuse / Alter. C) Mikroglia von Mäusen in Komplement-Rezeptor 3-Mangel (KO, schwarzer Balken) verschlingen deutlich weniger RGC Eingänge im Vergleich zu WT-Wurf (weißer Balken). Alle Daten sind normalisiert auf WT Kontrollwerte. * P <0,04 mit dem Student-t-Test, n = 3 Mäuse / Genotyp. Alle Fehlerbalken stellen sem Klicken Sie hier für eine größere Ansicht.
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Discussion
Um genau zu messen, Phagozytose, müssen verschlungen Material in einer Weise, dass der Forscher kann es einmal zu visualisieren lysosomalen Abbau aufgetreten gekennzeichnet werden. Außerdem wird eine hochauflösende Abbildung benötigt wird, gefolgt von der Verwendung von Software, die dem Forscher ermöglichen, das Volumen der gesamten Zell visualisieren und zu quantifizieren, dessen Inhalt. In diesem Protokoll beschreiben wir eine sehr zuverlässige und quantitative Verfahren zur Messung von Phagozyten-vermittelte Einwirkung mit CTB konjugiert mit Alexa Farbstoffe verschlungen Material kombiniert mit hochauflösenden konfokalen Mikroskopie und 3D-Rekonstruktion zu beschriften. Diese Methode wurde in unserem Labor verwendet worden, um Mikroglia vermittelt-Einwirkung der präsynaptischen Eingänge unterziehen synaptischen Umbau in den Entwicklungsmaushirn (retinogeniculate System) 7 erfolgreich zu analysieren. Darüber hinaus hat es sich als eine hochempfindliche Technik, die subtilen Veränderungen in Einwirkung in verschiedenen Entwicklungsalter unde unterscheiden kannr nicht-pathologischen Bedingungen und zwischen Wildtyp-und Knockout-Mäusen. Mit kleineren Anpassungen, kann dieses Protokoll angepasst, um Einwirkung Live-Gewebe durch Zeitraffer-Bildgebung zu untersuchen. Darüber hinaus kann dieses Protokoll angewendet werden, um Phagozyten-Neuron Wechselwirkungen Krankheit zu studieren.
Vorsichtsmaßnahmen
Eine der nützlichsten Aspekte dieses Assays ist die Fähigkeit, neuronale Projektionen in einer Weise, dass sie sichtbar nach Eingabe eines lysosomalen Abbauweg bleiben beschriften. Da jedoch der Neuronen markiert ist, kann es schwierig sein, zu unterscheiden, welcher Teil der Zelle phagozytiert worden ist. Dies erfordert eine sehr sorgfältige regionale Analyse (z. B. synaptische Region gegenüber einer Nicht-synaptischen Bereich des dCGL) in Kombination mit Elektronenmikroskopie 7. Zusätzlich sind schwieriger in anderen Hirnregionen, wo neuronalen Zellkörpern und Vorsprünge befinden sich in der Umgebung nachweisen können. Allerdings können alternative Markierungsstrategien eingesetzt werden (siehe below). Außerdem ist es aufgrund der Auflösungsgrenzen der Lichtmikroskopie, gibt es eine Möglichkeit, dass man die Menge an Material verschlungen zu überschätzen. Als Ergebnis ist darauf zu überprüfen, ob verschlungen Material innerhalb Lysosomen werden. Aus diesem Grund verwenden wir anti-CD68 zu den Lysosomen innerhalb Mikroglia beschriften, 3D-Rendering und orthogonalen Ansichten, um die Parameter des Tests zu überprüfen.
Zelltypen
Zusätzlich zu Mikrogliazellen, könnte diese Methode auch angewandt werden, um die Rolle von anderen Phagozyten im Gehirn (beispielsweise Astrozyten) und in den peripheren Nerven-und Immunsystem (z. B. perisynaptic Schwann-Zellen, Makrophagen, etc.) zu analysieren. Darüber hinaus, weil CTB Alexa-Farbstoffe konjugiert ist so leicht von den meisten Zellen eingenommen wird, kann eine ähnliche Strategie verwendet werden, um Markierungsmaterial verschlungen gesamten Gehirn und anderen Organsystemen zu markieren.
Kennzeichnung von Engulfed Werkstoff
Als alAlternative zu CTB Alexa-Farbstoffe konjugiert sind, haben wir die folgenden Strategien zur verschlungen Material 7 kennzeichnen: 1) Leuchtstoff Reporter Mäusen, in denen RGZ wurden mit einem fluoreszierenden Protein (zB tdTomato, EGFP, etc.) gekennzeichnet. 2) anterograde Markierung mit einem Farbstoff pHrodo Dextran konjugiert ist, ein Farbstoff, der fluoresziert, wenn es nur in einem Lysosom ist. Mit diesen unterschiedlichen Strategien können Visualisierung und Quantifizierung von verschlungen präsynaptischen Eingänge in Mikroglia performedwith den gleichen Bildgebung und Quantifizierung Techniken. Allerdings sind die Alexa-Farbstoff-Konjugate die robust durch den hohen Widerstand der Farbstoff Alexa Hydrolasen 7,21 lysosomalen. Zusätzlich Kennzeichnung verschlungen Material mit Antikörper (z. B. anti-VGLUT2, einem präsynaptischen vesikulären Protein) wurde versucht. Dies ist jedoch eine relativ unzuverlässige Nachweisverfahren angegeben, dass die meisten Proteine rasch auf einmal in Lysosomen gebrochen. Es ist schwierig, geringe Fluoreszenz aufgrund unterscheidenzum Proteinabbau über Hintergrund.
Verwendeten Tiere
In dem aktuellen Protokoll, Mikroglia fluoreszenz gentechnisch unter Verwendung von fluoreszierenden Reporter-Mäuse (CX3CR1-EGFP) 22 bezeichnet. Es gibt jedoch Fälle, in denen Antikörper-Markierung gegenüber genetischen Expression von fluoreszierenden Reporterkonstrukte notwendig ist. Zum Beispiel, wenn fluoreszierende Reportermäusen sind für den Phagozyten von Interesse verfügbar sind, ist die Verwendung von Ratten notwendig oder die Forscher möchte bei Knockout-Mäusen ohne Kreuzungen, in einer fluoreszierenden Reportermauslinie zu suchen. Für Fälle wie diesen, können Phagocyten mittels Immunhistochemie markiert werden und Daten sind vergleichbar mit den Ergebnissen von Experimenten unter Verwendung von fluoreszierenden Reportermäusen 7. Nach Gewebe Schnitte, wir verwenden in der Regel ein Standard-Protokoll für die Immunfärbung schwimmende Abschnitte 7. Es ist wichtig, einen Antikörper gegen ein Protein, das die gesamte Zelle Etikett angehoben wählen undihrer Prozesse. Um beispielsweise Etiketten Mikroglia können Anti Iba1 verwendet werden.
Breitere Anwendung: Live-Imaging und Krankheit
Während dieses Protokoll auf der Analyse von festen Gewebe basiert, würde leichten Modifikationen die gleiche Analyse in Bildern von Live-Bildgebung erworben zu ermöglichen. Nach einem Zeitablauf Imaging-Sitzung können die nachfolgenden z-Stapel identisch mit den Schritten in diesem Protokoll 9.4 verarbeitet werden. Hinzu kommt, dass wir dieses Protokoll angewendet, um Einwirkung von Synapsen während der Entwicklungs synaptischen Umbau im gesunden ZNS visualisieren, dieses Protokoll kann auch in Krankheitsmodelle angewendet werden. Insbesondere kann dieses Protokoll verwendet, um Krankheiten, in denen erhebliche Umbau Synapsen zogen, wie im Falle der Synapsenverlust und Regeneration nach Verletzungen des Rückenmarks, frühe Synapsenverlust Alzheimer-Krankheit, usw. 12,14-19,23 zugeordnet untersuchen - 26. Darüber hinaus kann man auch diese Technik anzupassen, um Krankheiten, in denen PHAG studierenocytosis aus anderem Material als Synapsen beschrieben wurde, wie Mikroglia / Makrophagen-vermittelte Phagozytose von Myelin in demyelinisierenden Erkrankungen (zB Multiple Sklerose) und Einwirkung von Beta-Amyloid bei Alzheimer-Krankheit 5,6,27-29.
Im Ergebnis ist die hier beschriebene Assay Einwirkung bietet eine bequeme, reproduzierbare und empfindliche Technik zu Phagozyten Interaktionen mit ihren extrazellulären Umgebung zu studieren. Wichtig ist, hat dieser Test eine breite Palette von Anwendungen und Funktionen, die die Neurowissenschaften als auch diejenigen, die in anderen Organsystemen dienen wird.
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Disclosures
Keine Interessenskonflikte erklärt.
Acknowledgments
, NRSA (F32-NS-066698; DPS); Arbeit wurde durch Zuschüsse aus der Smith Family Foundation (BS), Dana-Stiftung (BS), John Merck Scholars Program (BS), NINDS (BS RO1-NS-07100801) unterstützt wird, Nancy Lurie Marks Foundation (DPS), NIH (P30-HD-18655; MRDDRC Imaging Core).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Heat pad | Vet Equip, Inc. | 965500 | |
| Warm water source for heat pad | Kent Scientific | TP-700 | |
| Stereo microscope | DSC Optical | Zeiss Opmi -6 Surgical Microscope | |
| Sliding microtome with freezing stage | Leica | SM2010 R | |
| Microtome blade | Leica | 14021607100 | |
| Fluorescent dissecting microscope | Nikon | SMZ800 with Epi-fluorescence attachment | |
| Spinning disk confocal microscope | Perkin Elmer | UltraView Vox Spinning Disk Confocal | |
| 10 µl Hamilton gas tight syringes | Hamilton | 80030 | Use a different syringe for each color dye/tracer |
| Hamilton needles | Hamilton | 7803-05, specifications: blunt, 1.5" | |
| Alexa-conjugated cholera toxin β subunit (CTB) | Invitrogen | 488: C22841 | Reconstitute in sterile saline, 80 µl (488), 100 µl (594), 20 µl (647) |
| 594: C22842 | |||
| 647: C34778 | |||
| Phosphate Buffered Saline (PBS) | Sigma | P4417-50TAB | |
| Neomycin and Polymyxin B Sulfates and Bacitracin Zinc Ophthalmic Ointment USP (antibiotic ointment) | Bausch & Lomb | 24208-780-55 | |
| 30.5 G needle | Becton Dickinson | 305106 | |
| Spring scissors | Roboz | RS-5630 | |
| Cotton-tipped applicator | Fisher | 23-400-125 | |
| Paraformaldeyde (PFA) | Electron Microscopy Sciences | 15710 | Dilute 16% to 4% in PBS. Paraformaldehye is toxic, use in a fume hood and wear personal protective equipment. |
| Dissection tools – scissors, forceps, spatula | Small scissors: Fine Science Tools | Small scissors:14370-22 | |
| Large scissors: Roboz | Large scissors: RS-6820 | ||
| #55 forceps: Fine Science Tools | #55 forceps: 11255-20 | ||
| Spatula: Ted Pella, Inc. | Spatula: 13504 | ||
| Sucrose | Sigma | S8501-5KG | Make 30% sucrose in PBS (weight/vol) |
| OCT Compound | VWR | 25608-930 | |
| Weigh boat | USA Scientific | 2347-1426 | |
| 24-well plates | BD Biosciences | 353047 | |
| Sodium phosphate monobasic | Sigma | S6566-500G | Make 0.2 M sodium phosphate monobasic (PB-A) in ddH2O and 0.2 M sodium phosphate dibasic (PB-B) in ddH2O. To make 0.1 M PB, combine 19 ml PB-A and 81 ml PB-B, fill to 200 ml with ddH2O |
| Sodium phosphate dibasic | Sigma | S5136-500G | |
| Coverslips, 22 X 50 mm, No. 1.5 | VWR | 48393 194 | |
| Charged microscope slide | VWR | 48311-703 | |
| Vectasheild | Vector Laboratories | H-1200 |
References
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