En engulfment analysen: En protokoll for å vurdere samspillet mellom CNS Fagocytter og Neuroner
Summary
Mikroglia er beboeren immunceller i sentralnervesystemet (CNS) med en høy kapasitet til å phagocytose eller sluker materiale i sitt ekstracellulære miljø. Her blir en bredt anvendbar, pålitelig og meget kvantitativ analyse for å visualisere og måle microglia-mediert engulfment av synaptiske komponenter beskrevet.
Abstract
Fagocytose er en prosess hvor en celle omslutter materialet (hel celle, deler av en celle, rusk etc.) i sin omliggende ekstracellulære miljø og deretter fordøyer dette materialet, vanligvis gjennom lysosomal degradering. Mikroglia er beboeren immunceller i sentralnervesystemet (CNS) som fagocytisk funksjon er blitt beskrevet i en lang rekke forhold fra nevrodegenerative sykdommer (for eksempel beta-amyloid klaring i Alzheimers sykdom) til utvikling av det friske hjernen (f.eks synaptiske beskjæring) 1-6. Følgende protokoll er en engulfment analyse utviklet for å visualisere og kvantifisere microglia-mediert engulfment av presynaptiske innganger i den tredje muse retinogeniculate system 7. Selv om denne assay ble brukt for å vurdere microglia funksjon i denne spesielle sammenheng, kan en lignende tilnærming brukes til å vurdere andre fagocytter i hele hjernen (f.eks astrocytter) og resten av legemet(f.eks perifere makrofager) samt andre sammenhenger der oppstår synaptic ombygging (f.eks hjerneskade / sykdom).
Introduction
Synaptiske kretser remodel gjennom hele livet av et dyr. I utviklingen av hjernen, synapser dannes i overkant og må gjennomgå synaptiske beskjæring som innebærer selektiv fjerning av en undergruppe av synapser og opprettholdelse og forsterkning av disse synapser som forblir 8-10. Denne prosess er nødvendig for å oppnå den nøyaktige tilkoblings karakteristisk for den voksne nervesystemet. I den voksne, kan synapser også være plast, særlig i sammenheng med læring og hukommelse. De strukturelle korrelater med denne plastisitet er tenkt å omfatte tilsetning og / eller fjerning av dendrittutløperne og presynaptiske boutons 11-13. I tillegg til disse roller i sunt nervesystem, er synaptiske ombygging også involvert i nervesystem sykdommer / skader 12,14,15. For eksempel, etter ryggmargsskade, avkuttede axons må deretter renovere og danne nye synapser å oppnå funksjonelle utvinning 16-19.
nt "> Emerging som en viktig del av synaptisk plastisitet er prosessen med fagocytose eller engulfment av synapser bestemt for fjerning 3,5,20. Vi har nylig viste dette fenomenet i sammenheng med synaptiske beskjæring i sunn, postnatal mus hjernen 7. Spesielt , microglia, bosatt CNS immunceller og fagocytter, ble vist å sluke presynaptiske inngangene under en topp periode og i et område av utviklings synaptiske beskjæring, barsel dorsal lateral geniculate nucleus (dLGN) i thalamus. Genetisk eller farmakologisk blokade av denne engulfment resulterte i vedvarende underskudd i synaptiske tilkobling.I denne protokollen, beskriver vi en pålitelig og svært kvantitativ analyse for å måle phagocyte-mediert engulfment av presynaptiske innganger. Ved anvendelsen av denne artikkelen, vil denne analysen bli presentert i sammenheng med utviklings retinogeniculate system, som inkluderer retinal ganglion celler (RGCs) bosatt i netthinnen somprojisere presynaptiske innganger til dLGN (figur 1A). Til å begynne med vil en lysosomal degradering bestandig antero merking strategi beskrives, som brukes til å visualisere RGC-spesifikke presynaptiske innganger i dLGN (figur 1) 7,21. Etter denne beskrivelse, en detaljert metode for avbildning og kvantitativt måle engulfment ved hjelp av konfokal mikroskopi i kombinasjon med 3-dimensjonal (3D) overflatevolumgjengivelse vil bli gitt. Denne metode er basert på fast vevspreparat, men kan også tilpasses for anvendelse i levende bildediagnostikk. Viktigere, mens analysen er blitt validert i sammenheng med den friske, postnatal retinogeniculate system, kan man anvende de samme teknikkene for å vurdere andre fagocytt-neuron interaksjoner i hele hjernen og i løpet av sykdommen, så vel som phagocyte funksjon i andre organsystemer.
Protocol
Representative Results
Discussion
For å måle fagocytose, må omsluttet materiale være merket på en slik måte at forskeren kan visualisere det en gang lysosomal degradering har oppstått. I tillegg er høy oppløsning kreves, etterfulgt av bruk av programvare som vil gjøre det mulig for forskeren til å visualisere volumet av hele cellen og kvantifisere innholdet. I denne protokollen, beskriver vi en svært pålitelig og kvantitativ metode for å måle phagocyte-mediert engulfment hjelp CTB konjugert til Alexa fargestoffer til å merke oppslukt mat…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Arbeidet ble støttet med tilskudd fra Smith Family Foundation (BS), Dana Foundation (BS), John Merck Scholars Program (BS), ninds (RO1-NS-07100801, BS), NRSA (F32-NS-066698, DPS), Nancy Lurie Marks Foundation (DPS), NIH (P30-HD-18655; MRDDRC Imaging Core).
Materials
| Heat pad | Vet Equip, Inc. | 965500 | |
| Warm water source for heat pad | Kent Scientific | TP-700 | |
| Stereo microscope | DSC Optical | Zeiss Opmi -6 Surgical Microscope | |
| Sliding microtome with freezing stage | Leica | SM2010 R | |
| Microtome blade | Leica | 14021607100 | |
| Fluorescent dissecting microscope | Nikon | SMZ800 with Epi-fluorescence attachment | |
| Spinning disk confocal microscope | Perkin Elmer | UltraView Vox Spinning Disk Confocal | |
| 10 µl Hamilton gas tight syringes | Hamilton | 80030 | Use a different syringe for each color dye/tracer |
| Hamilton needles | Hamilton | 7803-05, specifications: blunt, 1.5" | |
| Alexa-conjugated cholera toxin β subunit (CTB) | Invitrogen | 488: C22841 | Reconstitute in sterile saline, 80 µl (488), 100 µl (594), 20 µl (647) |
| 594: C22842 | |||
| 647: C34778 | |||
| Phosphate Buffered Saline (PBS) | Sigma | P4417-50TAB | |
| Neomycin and Polymyxin B Sulfates and Bacitracin Zinc Ophthalmic Ointment USP (antibiotic ointment) | Bausch & Lomb | 24208-780-55 | |
| 30.5 gauge needle | Becton Dickinson | 305106 | |
| Spring scissors | Roboz | RS-5630 | |
| Cotton-tipped applicator | Fisher | 23-400-125 | |
| Paraformaldeyde (PFA) | Electron Microscopy Sciences | 15710 | Dilute 16%to 4% in PBS. Paraformaldehye is toxic, use in a fume hood and wear personal protective equipment. |
| Dissection tools – scissors, forceps, spatula | Small scissors: Fine Science Tools | Small scissors:14370-22 | |
| Large scissors: Roboz | Large scissors: RS-6820 | ||
| #55 forceps: Fine Science Tools | #55 forceps: 11255-20 | ||
| Spatula: Ted Pella, Inc. | Spatula: 13504 | ||
| Sucrose | Sigma | S8501-5KG | Make 30% sucrose in PBS (weight/vol) |
| OCT Compound | VWR | 25608-930 | |
| Weigh boat | USA Scientific | 2347-1426 | |
| 24-well plates | BD Biosciences | 353047 | |
| Sodium phosphate monobasic | Sigma | S6566-500G | Make 0.2 M sodium phosphate monobasic (PB-A) in ddH20 and 0.2 M sodium phosphate dibasic (PB-B) in ddH20. To make 0.1 M PB, combine 19 ml PB-A and 81 ml PB-B, fill to 200 ml with ddH20 |
| Sodium phosphate dibasic | Sigma | S5136-500G | |
| Coverslips, 22 X 50 mm, No. 1.5 | VWR | 48393 194 | |
| Charged microscope slide | VWR | 48311-703 | |
| Vectasheild | Vector Laboratories | H-1200 |
References
- Ransohoff, R. M., Perry, V. H. Microglial physiology: unique stimuli, specialized responses. Annu Rev Immunol. 27, 119-145 (2009).
- Aguzzi, A., et al. Microglia: scapegoat, saboteur, or something else. Science. 339 (6116), 156-161 (2013).
- Tremblay, M. E., et al. The role of microglia in the healthy brain. J Neurosci. 31 (45), 16064-16069 (2011).
- Hanisch, U. K., Kettenmann, H. Microglia: active sensor and versatile effector cells in the normal and pathologic brain. Nat. Neurosci. 10 (11), 1387-1394 (2007).
- Sierra, A., et al. Janus-faced microglia: beneficial and detrimental consequences of microglial phagocytosis. Front Cell Neurosci. 7, (2013).
- Dheen, S. T., et al. Microglial activation and its implications in the brain diseases. Curr Med Chem. 14 (11), 1189-1197 (2007).
- Schafer, D. P., et al. Microglia sculpt postnatal neural circuits in an activity and complement-dependent manner. Neuron. 74 (4), 691-705 (2012).
- Katz, L., Shatz, C. Synaptic activity and the constuction of cortical circuits. Science. 274 (5290), 1133-1138 (1996).
- Sanes, J. R., Lichtman, J. W. Development of the vertebrate neuromuscular junction. Annu Rev Neurosci. 22, 389-442 (1999).
- Hua, J. Y., Smith, S. J. Neural activity and the dynamics of central nervous system development. Nat Neurosci. 7 (4), 327-332 (2004).
- Holtmaat, A., Svoboda, K. Experience-dependent structural synaptic plasticity in the mammalian brain. Nat Rev Neurosci. 10 (9), 647-658 (2009).
- Butz, M., et al. Activity-dependent structural plasticity. Brain Res Rev. 60 (2), 287-305 (2009).
- Bruel-Jungerman, E., et al. Brain plasticity mechanisms and memory: a party of four. Neuroscientist. 13 (5), 492-505 (2007).
- Schafer, D. P., Stevens, B. Synapse elimination during development and disease: immune molecules take centre stage. Biochem Soc Trans. 38 (2), 476-481 (2010).
- Alexander, A., et al. The complement system: an unexpected role in synaptic pruning during development and disease. Annu Rev Neurosci. 35, 369-389 (2012).
- Brown, A., Weaver, L. C. The dark side of neuroplasticity. Exp Neurol. 235 (1), 133-141 (2012).
- Navarro, X. Chapter 27: Neural plasticity after nerve injury and regeneration. Int Rev Neurobiol. 87, 483-505 (2009).
- Tan, A. M., Waxman, S. G. Spinal cord injury, dendritic spine remodeling, and spinal memory mechanisms. Exp Neurol. 235 (1), 142-151 (2012).
- Wolpaw, J. R., Tennissen, A. M. Activity-dependent spinal cord plasticity in health and disease. Annu Rev Neurosci. 24, 807-843 (2001).
- Schafer, D. P., et al. The "quad-partite" synapse: Microglia-synapse interactions in the developing and mature CNS. Glia. 61 (1), 24-36 (2013).
- Mukhopadhyay, S., et al. Manganese-induced trafficking and turnover of the cis-Golgi glycoprotein GPP130. Mol Biol Cell. 21 (7), 1282-1292 (2010).
- Jung, S., et al. Analysis of fractalkine receptor CX(3)CR1 function by targeted deletion and green fluorescent protein reporter gene insertion. Mol Cell Biol. 20, 4106-4114 (2000).
- Knobloch, M., Mansuy, I. M. Dendritic spine loss and synaptic alterations in Alzheimer’s disease. Mol Neurobiol. 37 (1), 73-82 (2008).
- Masliah, E., et al. Synaptic remodeling during aging and in Alzheimer’s disease. J Alzheimers Dis. 9 (3 Suppl), 91-99 (2006).
- Yoshiyama, Y., et al. Synapse loss and microglial activation precede tangles in a P301S tauopathy mouse model. Neuron. 53 (3), 337-351 (1016).
- Milnerwood, A. J., Raymond, L. A. Early synaptic pathophysiology in neurodegeneration: insights from Huntington’s disease. Trends Neurosci. 33 (11), 513-523 (2010).
- Noda, M., Suzumura, A. Sweepers in the CNS: Microglial Migration and Phagocytosis in the Alzheimer Disease Pathogenesis. Int J Alzheimers Dis. , (2012).
- Rotshenker, S. Microglia and macrophage activation and the regulation of complement-receptor-3 (CR3/MAC-1)-mediated myelin phagocytosis in injury and disease. J Mol Neurosci. 21 (1), 65-72 (2003).
- Smith, M. E. Phagocytosis of myelin in demyelinative disease: a review. Neurochem Res. 24 (2), 261-268 (1999).
