Summary
La microglía son las células inmunes residentes del sistema nervioso central (SNC) con una alta capacidad de fagocitar o material de envolver en su entorno extracelular. Aquí, se describe un ensayo ampliamente aplicable, fiable, y altamente cuantitativo para visualizar y medir la microglia mediada por inmersión de componentes sinápticas.
Abstract
La fagocitosis es un proceso en el que una célula envuelve el material (célula entera, partes de una célula, escombros, etc) en su entorno extracelular que rodea y posteriormente se digiere este material, comúnmente a través de la degradación lisosomal. La microglía son las células inmunes residentes del sistema nervioso central (SNC) cuya función fagocítica se ha descrito en una amplia gama de condiciones de enfermedad neurodegenerativa (por ejemplo, aclaramiento de beta-amiloide en la enfermedad de Alzheimer) para el desarrollo del cerebro sano (por ejemplo, sináptica poda) 1-6. El siguiente protocolo es un ensayo de inmersión desarrollado para visualizar y cuantificar inmersión microglia mediada de insumos presinápticas del sistema retinogeniculadas ratón en desarrollo 7. Mientras que se utilizó este ensayo para evaluar la función microglia en este contexto particular, un enfoque similar se puede utilizar para evaluar otros fagocitos en todo el cerebro (por ejemplo, astrocitos) y el resto del cuerpo(por ejemplo, macrófagos periféricos), así como otros contextos en los que ocurre la remodelación sináptica (por ejemplo, lesión cerebral / enfermedad).
Introduction
Circuitos sinápticos remodelar largo de la vida de un animal. En el cerebro en desarrollo, las sinapsis se forman en exceso y deben someterse a la poda sináptica que consiste en la eliminación selectiva de un subconjunto de las sinapsis y el mantenimiento y fortalecimiento de esas sinapsis que permanecen 8-10. Este proceso es necesario para lograr la conectividad característica precisa del sistema nervioso adulto. En el adulto, las sinapsis también pueden ser de plástico, en particular en el contexto del aprendizaje y la memoria. Las correlaciones estructurales de esta plasticidad se cree que incluyen la adición y / o eliminación de las espinas dendríticas y presináptica boutons 11-13. Además de estas funciones en el sistema nervioso saludable, remodelación sináptica también está implicada en la enfermedad del sistema nervioso 12,14,15 / lesión. Por ejemplo, después de una lesión de la médula espinal, los axones cortados deben posteriormente remodelar y formar nuevas sinapsis para lograr la recuperación funcional 16-19.
nt "> Emergiendo como un aspecto importante de la plasticidad sináptica es el proceso de la fagocitosis o la inmersión de las sinapsis con destino a la eliminación 3,5,20. Recientemente, hemos mostrado este fenómeno en el contexto de la poda sináptica en el sano, el cerebro postnatal ratón 7. Específicamente , microglía, las células inmunes residentes del SNC y los fagocitos, se muestra para engullir entradas presinápticas durante un período de pico y en una región de la poda sináptica de desarrollo, el dorsal posnatal núcleo geniculado lateral (dLGN) del tálamo. bloqueo genética o farmacológica de esta inmersión traducido en déficits sostenidos en la conectividad sináptica.En este protocolo, se describe un ensayo fiable y altamente cuantitativo para medir la inmersión fagocítica mediada de insumos presináptica. A los efectos de este artículo, este ensayo se presentará en el marco del sistema de desarrollo de retinogeniculadas, que incluye las células ganglionares de la retina (CGR) que reside en la retina queproyectar entradas presináptica a la dLGN (Figura 1A). Para empezar, una estrategia de marcaje anterógrado resistente a la degradación lisosomal se describirá, que se utiliza para visualizar entradas presinápticas RGC-específicos en la dLGN (Figura 1) 7,21. Después de esta descripción, una metodología detallada para la imagen y la medición cuantitativa de inmersión utilizando microscopía confocal combinadas con 3 dimensiones (3D) de superficie representación de volumen se le dará. Esta metodología se basa en la preparación del tejido fija, pero también puede ser adaptado para su uso en estudios de formación de imágenes en vivo. Es importante destacar que, mientras que el ensayo ha sido validado en el contexto del sistema de retinogeniculadas saludable, posnatal, se podría aplicar las mismas técnicas para evaluar otras interacciones fagocito-neuronas en todo el cerebro y durante la enfermedad, así como la función fagocítica en otros sistemas de órganos.
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Protocol
1. Anterógrada etiquetado de CGR Presinápticos Entradas
Nota: Todos los experimentos que implican el uso de animales fueron revisados y supervisados por el cuidado de los animales y el uso comité institucional (IACUC) de conformidad con todas las directrices de NIH.
- Campo y los instrumentos Esterilizar.
- Anestesie ratón con 4 vol% de isoflurano en una cámara de inducción de plexiglás (este volumen% isoflurano funciona para los ratones-neonatal adulto). Observar los ratones de cerca para evitar el exceso de anestesiante. ATENCIÓN: Evitar la inhalación de una evacuación de gases residuales de vacío.
- Después de 1-3 minutos, (los ratones más viejos requerirán menos tiempo) garantizar el nivel adecuado de anestesia se logra apretando la cola (debe ser observado ninguna reacción) y la observación de la frecuencia respiratoria (tasa debe ser lenta y constante).
- Coloque ratón bajo el microscopio estéreo en su lado y el lugar de la nariz cono entrega de 3-4% en volumen de isoflurano sobre el hocico (neonatos <día posnatal 10 (P10) ~ 4% en volumen;> P10 ~ 3% en volumen).
- Exponer la esclerótica. Para la inyección de los recién nacidos antes de la apertura de los ojos, utilice un par de pequeñas tijeras de primavera para abrir el párpado y tirar hacia atrás la piel para exponer la esclerótica. Para los ratones de edad avanzada, utilice los dedos para tirar de la piel que rodea el ojo para exponer la esclerótica. PRECAUCIÓN: En los recién nacidos, a veces otro corte perpendicular en la esquina del ojo es necesario. Tenga cuidado al cortar la esquina de los párpados, ya que es un vaso sanguíneo que, si cortar, sangrará excesivamente.
- Utilice un 30,5 g aguja estéril para perforar un pequeño agujero en el lado del ojo en la línea donde comienza la esclerótica. Tener cuidado de no dañar la lente mediante la inserción de la aguja justo lo suficiente para que el bisel entra en el ojo.
- Permitir que el vítreo fluya fuera del agujero y el uso de un aplicador con punta de algodón estéril para absorber el líquido.
- Una vez que el vítreo se ha dejado de fluir por el agujero, inserte una aguja sin punta unida a una jeringa Hamilton precargado con anterógrada rastreo tinteen el agujero. PRECAUCIÓN: Inserte la aguja lentamente para evitar perforar el otro lado del ojo o dañar la lente.
- Lentamente inyecte un colorante en el ojo. Típicamente, la toxina del cólera subunidad β conjugado con Alexa 594, 647, o 488 (CTB-594, CTB-647, o CTB-488, 5-6 g / l) se utiliza para anterogradely entradas RGC traza. Para los recién nacidos (≤ P10) 1-2 l es suficiente y para los ratones> P10 ~ 3 l es suficiente. Nota: colorantes de Alexa son particularmente resistentes a la degradación lisosomal
- Deje la aguja en el agujero durante unos segundos y luego retire lentamente.
- Utilice un aplicador con punta de algodón para absorber el exceso de líquido y prevenir tinte se escape.
- Aplicar una pequeña cantidad de pomada antibiótica al ojo. Si el ojo se abre quirúrgicamente, vuelva a colocar suavemente los párpados juntos.
- Si la inyección de los dos ojos, repita el procedimiento en el otro ojo.
- Inyección (s) Siguiendo, deje ratón bajo una lámpara de calor o en una almohadilla de calor hasta que comience a recuperarse de la AnesthEIAS.
- Ratón Regreso a una jaula hogar limpio y vigilar para asegurarse de que esté completamente despierto antes de regresar a la colonia.
2. Preparar Tissue for Imaging
Este protocolo de preparación de tejido se utiliza para reportero ratones en los que los fagocitos se etiquetan con marcadores fluorescentes (por ejemplo, CX3CR1-EGFP para la microglía). Si un reportero línea no está disponible, el investigador puede immunostain secciones de tejido (ver Discusión).
- ~ 24 horas después de la inyección, sacrifica el ratón y diseccionar el cerebro.
- Caiga solucionar el cerebro en un tubo Falcon lleno de 4% de paraformaldehído (PFA) durante la noche a 4 ° C. PRECAUCIÓN: PFA es tóxico. Evitar la inhalación y la exposición de la piel mediante el uso de una campana de extracción o en una mesa de corriente descendente y el uso de equipo de protección personal. Notas: La fijación puede ser más corto (≥ 4 h). Además, en lugar de fijación gota, 4% de PFA de perfusión puede ser utilizado seguido de una solución gota 2-24 h. Sin embargo, la comparación de perfused caer cerebros neonatales y adultas fijos reveló ninguna diferencia en la calidad de la imagen o la cuantificación.
- Enjuague las 3x cerebrales en tampón fosfato salino (PBS).
- Vierta el cerebro y la PFA en un peso bote vacío.
- Utilice una espátula para transferir el cerebro a otro sopesar barco llena con PBS.
- Lavado de cerebro dos veces más en PBS (cerebro transferencia a dos más pesan barcos llenos de PBS).
- Transferir el cerebro a un tubo Falcon de llenado con una solución de sacarosa al 30%. Deje el cerebro en sacarosa a 4 ° C hasta el cerebro se hunde hasta el fondo del tubo (24-48 h).
- Una vez que el cerebro se hunde, preparar el cerebro para seccionar. Los siguientes pasos son preparación de 40 micras secciones flotantes utilizando un microtomo de deslizamiento con una etapa de congelación (un criostato también se puede utilizar).
- Utilice una hoja de afeitar para quitar las partes del cerebro que no son necesarios (para el dLGN, eliminar las partes rostral y caudal del cerebro).
- Congelar el sujetadoren el papel de aluminio sobre hielo seco. Durante este tiempo, congelar la etapa microtomo y llenar cada pocillo de una placa de 24 pocillos con 0,5 ml de 0,1 M de tampón fosfato (PB).
- Monte el cerebro congelado (debe aparecer opaco) en la etapa de congelación.
- Aplique una pequeña cantidad de compuesto de la temperatura óptima de corte (OCT) para el escenario.
- Una vez que el octubre comienza a congelarse, poner el cerebro en la OCT. El final del cerebro que se va a cortar debe estar hacia arriba (por ejemplo, para la dLGN, enfrentar el lado caudal hacia arriba).
- Cubra el cerebro y octubre con hielo seco finamente picado.
- Agregar hielo seco en el cerebro / octubre de ~ 30 seg.
- Utilice un pincel grande para quitar el hielo seco. El cerebro y octubre se deben congelar a los escenarios.
- Comience el corte a través del tejido hasta que se alcanza la región de interés (ROI).
- Una vez alcanzado el ROI, use un pincel pequeño para eliminar secciones de la hoja y transferirlos a la plataforma de 24 pocillose que contiene 0,1 M PB (paso 2.5.2). Mantenga el cepillo de pintura húmeda mojándolo en el PB 0,1 M antes de retirar secciones de la hoja. Nota: las secciones se pueden dejar en PB 0,1 M durante la noche a 4 ° C.
- Una vez que se han recogido las secciones, visualice el etiquetado anterógrada bajo un microscopio de disección fluorescente y elegir las secciones que contienen el ROI.
- Montar las secciones en un portaobjetos con un pequeño pincel.
- Aplique una pequeña piscina de 0,1 M PB a un portaobjetos cargado.
- Transfiera la sección de tejido a la piscina de PB.
- Utilice el PB y pincel para orientar y difundir el tejido.
- Utilice un Kimwipe para absorber el exceso de PB. Tenga cuidado para evitar que absorbe de la sección.
- Deje que se seque al aire.
- Aplicar una pequeña gota de medio de montaje para cada sección de montaje y un cubreobjetos en la parte superior (22 x 50 mm, N º 1.5).
- Selle los bordes de la diapositiva con esmalte de uñas y se almacenan a -20 ° C hasta su sesión de imágenes. Nota: Aunque de formación de imágenes conen una semana de preparación se aconseja, las diapositivas pueden ser mantenidas a -20 ° C durante varias semanas antes de la formación de imágenes.
3. Tejido Imaging
Todas las imágenes se adquieren en un disco giratorio microscopio confocal (disco giratorio UltraView Vox microscopio confocal equipado con láseres de diodo (405 nm, 445 nm, 488 nm, 514 nm, 561 nm y 640 nm)). Las imágenes también se pueden adquirir en cualquier microscopio con la capacidad de adquirir de alta resolución z-pilas (por ejemplo, escaneo láser confocal microscopio, microscopio de epifluorescencia seguido por deconvolución, etc). Tamaño de la trama suele ser 1000 x 1000 píxeles.
- Encontrar el ROI en un aumento de 10X y adquirir una imagen. Para obtener imágenes de la microglía en el sistema retinogeniculadas, el retorno de la inversión es de las secciones dlgn más mediales.
- Cambie a un aumento mayor (un objetivo 60X Plan de Apo, NA = 1,4, se utiliza por lo general).
- Adquirir primer campo de vista que contiene fagocitos utilizando 0,2 micras z pasos.
- Adquirir 15-19 más campos que contienen los fagocitos por animal.
4. Preparar Imágenes para la cuantificación (ImageJ)
- Abrir z-stack en ImageJ.
- Vaya al menú Imagen, seleccione Color y Canales de Split.
- Reste fondo del canal (s) que contiene el material engullido.
- Seleccione la ventana del canal que contiene el material engullido (por ejemplo, insumos presináptica).
- Ir al menú de proceso y seleccione Fondo Reste. Use un radio de balanceo de la bola de 10 píxeles para anterógrada rastreo de insumos presináptica en la dLGN. Nota: El radio de la esfera rodante se determina empíricamente. Sin embargo, debe generalmente ser tan grande como el radio del objeto más grande en la imagen que no es parte de la de fondo.
- Suavizar el canal que contiene la fagocitos.
- Seleccione la ventana del canal que contiene el fagocito (por ejemplo, la microglía).
- Ir al menú de proceso y select Filtros, significan. Utilice un filtro de media de 1,5 (esto suaviza la imagen de representación en superficie en pasos posteriores).
- Reste fondo del canal que contiene la fagocitos.
- Seleccione la ventana del canal que contiene el fagocito (por ejemplo, la microglía).
- Vaya al menú Proceso, seleccione fondo de resta (ajustes tendrán que ser determinada empíricamente). Use un radio de balanceo de la bola de 50 píxeles para microglia EGFP-positivas.
- Combinar canales yendo al menú Imagen y seleccionar color, combinar canales.
- ROI Crop contiene fagocitos del archivo fusionado (esto hace que la superficie de representación más rápida, consulte el paso 5).
- Dibuje un cuadro alrededor del retorno de la inversión mediante la herramienta de selección rectangular en la barra de herramientas.
- Vaya al menú Imagen y seleccione Recortar.
- Canales Dividir de nuevo (consulte el paso 4.2).
- Guarde cada canal como su propio archivo TIFF.
5. Preparar imagen para la cuantificaciónen Imaris
- Abrir Imaris y asegúrese de que está seleccionado el icono de Volumen en el menú de arriba a la izquierda (Figura 2).
- Abrir primer canal de imagen recortada (cualquiera de los canales se puede abrir en primer lugar, sólo ser coherente).
- Añadir el otro canal (s). Vaya al menú Editar, seleccione Agregar canales y seleccionar el siguiente canal en el archivo. (Repita este paso para todos los canales restantes). Nota: Para cambiar el color, vaya a la ventana de ajuste de la pantalla y haga clic en el nombre del canal (Figura 3A). Con ello se abre un cuadro de diálogo para ajustar el color. Si la ventana de ajuste de la pantalla no está visible, vaya al menú Editar y seleccione Pantalla de Ajuste.
- Ajuste los valores de los píxeles. Vaya al menú Editar y seleccione Propiedades de la imagen. En esta ventana, ajuste x, y, y los valores de píxeles z (Estos valores dependen del microscopio, el objetivo, la cámara, y la adquisición de z a paso y se puede encontrar en el software que se utiliza para adquirir la imagen).
- Paso 5.5 se traducirá en una muypequeña imagen. Para cambiar el tamaño, haga clic en el icono apropiado en la esquina inferior derecha (Figura 2).
- En la ventana de ajuste de la pantalla, ajustar el brillo y el contraste para cada canal utilizando los triángulos izquierdo y medias.
6. 3 dimensiones (3D) Representación superficial del Fagocito
- En la barra de herramientas superior, asegúrese de que el modo de Surpass está seleccionada (Figura 3C).
- En la ventana de ajuste de visualización, desactive todos los canales excepto el canal de fagocitos. Esto eliminarlos del campo de visión.
- Haga clic en el icono de la representación de la superficie (Figura 2).
- Una ventana de crear aparecerá en la parte inferior izquierda (Figura 4A), asegúrese de retorno de la inversión del segmento no está marcada en esta primera ventana. Haga clic en el botón azul hacia adelante en la parte inferior.
- Ajuste el suavizado.
- En la siguiente ventana, seleccione el canal de fagocitos en el menú desplegable (Figura 4B). Esto ajusta elcantidad de detalle que se salió a la superficie y debe ser determinada empíricamente (0,1 micras de suavizado se utiliza típicamente para la microglía).
- Seleccione umbral absoluto.
- Haga clic en el botón azul hacia adelante en la parte inferior.
- Umbral de la imagen.
- Haga clic en el histograma y arrastre hasta que la imagen se apareció apropiadamente (Figura 4C). Esto se determina empíricamente mediante la rotación de la imagen para asegurar las superficies grises superpuestas sobre la imagen fluorescente son una representación de la superficie precisa. Notas: Para girar, pulse sobre Navegar en el menú del puntero en la parte superior derecha de la pantalla (Figura 3B), haga clic y mantenga la imagen que desea rotar. Para devolver la imagen a la orientación original, seleccione Inferior Origen Izquierda en el menú View.
- Haga clic en el botón azul hacia adelante en la parte inferior.
- En la siguiente ventana, hay una opción que se corten las superficies por tamaño, etc A menos que la imagen es muy ruidoso, no filtrar y eliminar unaY filtros que aparecen automáticamente. Haga clic en la flecha verde en la parte inferior para terminar la superficie haciendo que el fagocito. Aparecerá (Figura 5) Un nuevo conjunto de pestañas
- Si es necesario, elimine las superficies que no son parte de la fagocito de interés.
- Asegúrese de que está seleccionada la opción Seleccionar en el menú Pointer (Figura 3B).
- Haga clic en cualquier superficie que desea eliminar de forma que se vuelve amarillo. Para eliminar varias superficies, haga clic en las superficies mientras se mantiene pulsado el botón de control.
- Haga clic en Eliminar en la ficha Lápiz.
- Seleccionar y combinar todas las superficies de la fagocito en una sola superficie.
- Haga clic en el embudo (es decir ficha Filtro, Figura 5C).
- Haga clic en Agregar.
- Elija cualquier filtro, arrastrar el histograma hacia la izquierda (todas las superficies deben ser de color amarillo).
- Volver a la ficha Lápiz y haga clic Unify.
- Vaya a la pestaña gráfico (Figura 5A (Figura 5D). Para la visualización de múltiples parámetros, vaya al icono de llave inglesa en la parte inferior izquierda (Figura 2) y seleccionar los parámetros para registrar.
- Registrar el volumen del fagocito y guarde el archivo antes de continuar.
7. Rendering 3D Surface de Engulfed material
- Crear un nuevo canal para el material que ha sido engullido por el fagocito.
- Mientras esté seleccionada la superficie de los fagocitos, haga clic en la ficha lápiz.
- Haga clic en Máscara de Todos.
- En el diálogo que aparece, seleccione el canal correspondiente al material de envuelta (por ejemplo, anterógrada rastreo de insumos presináptica; Figura 5B).
- Compruebe canal duplicado antes de aplicar la máscara y pulsa en Aceptar.
- Aparecerá un nuevo canal en la ventana de ajuste de la pantalla que contiene sólo el material que ha sido envuelto y está dentro de lafagocitos.
- Superficie hacer el canal que contiene material Engulfed y nonengulfed total.
- Desactive todos los canales en la ventana de ajuste de visualización excepto por el canal que se va a la superficie y desmarque la superficie creada por los fagocitos.
- Haga clic en el icono de la representación de la superficie de nuevo (consulte el paso 6.3) y crear una superficie para el canal usando los mismos pasos que se describen para el fagocito (pasos 6.4 a 6.11). Notas: Asegúrese de seleccionar el canal correcto antes de alisar y umbral (paso 6.5; Figura 4B). Tome nota del valor de umbral (véase el paso 6.6, Figura 4C). Este valor también puede obtenerse a partir de la presentación de la superficie es completa (pestaña Varita; Figura 5 A).
- Registrar el volumen del total del material engullido y no envuelto y guarde el archivo antes de continuar.
- Superficie prestando asistencia material engullido (material dentro del fagocito).
- Visualizar la fluorescencia de sóloel nuevo canal de material engullido (vea el paso 7.2.1).
- Siga los mismos pasos que el anterior (pasos 7.2 a 7.3). Notas: Asegúrese de seleccionar el canal correcto en el menú desplegable antes de alisar (elija el nuevo canal creado en el paso 7.1). En la ventana de umbral, introducir manualmente el valor de umbral que se fijó para la prestación total del material sumergido y no sumergido (ver paso 7.2.2).
- Registrar el volumen del material engullido y guardar el archivo antes de continuar.
8. Calcular el volumen total del campo de visión
- Crear una nueva superficie para cualquier canal.
- En la ventana de umbral (paso 6.6), deslice el histograma todo el camino a la izquierda, para que todo el campo se salió a la superficie.
- Termine la superficie todo el campo y anotar el volumen (pasos 6.7 a 6.11).
- Guarde el archivo.
9. Calcular la cantidad de material fagocitado
- Calcular la densidad de lacanal total de material engullido y no envuelto utilizando el siguiente algoritmo:
Volumen del total Engulfed y no Engulfed material (paso 7.3) / Volumen de campo (paso 8). - Calcular el% de inmersión por célula utilizando el siguiente algoritmo:
(Volumen de Engulfed material (paso 7.5) / Volumen total de la Fagocito (paso 6,11)) x 100
Notas: Para dar cuenta de las variaciones en el tamaño celular, los datos se normalizaron con el volumen total del fagocito. Si los números de la etapa 9.1 son muy variables a través de campos, puede ser necesario normalizar los datos de la etapa 9.2 para el cálculo en 9.1.
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Representative Results
Recientemente, se utilizó este ensayo de inmersión para visualizar y cuantificar inmersión microglia mediada de entradas presinápticas en el sistema retinogeniculadas en desarrollo (Figura 1) 7. CGR de ratones heterocigotos CX3CR1-EGFP fueron anterogradely remontar con CTB-594 y CTB-647 en los ojos izquierdo y derecho, respectivamente. A raíz de esta localización, se obtuvieron imágenes de microglia EGFP-positivas dentro de la dLGN. Estas imágenes fueron posteriormente superficie prestados por las mediciones de volumen.
Mediante esta técnica, se encontró que en un período máximo de remodelación sináptica de desarrollo dentro de la dLGN (P5), entradas presinápticas son engullidos por la microglía (Figura 6). Tan pocos como 4 días más tarde, cuando una gran cantidad de remodelación es casi completa (P9), hay una reducción dramática en la cantidad de entradas envueltos. Además, inmersión y la poda se interrumpen en ratones deficientes en proteínas que pertenecen a la cascada del complemento clásica(Figura 6), así como después de la manipulación de la descarga neuronal (datos no mostrados) 7.
Figura 1. Estrategia para evaluar inmersión microglia mediada RGC entradas presinápticas 7. A) Esquema de la estrategia de rastreo anterógrada. Entradas izquierda y el ojo derecho de CGR se trazan con CTB-647 (azul) y CTB-594 (rojo), respectivamente. La microglia mediada (verde) inmersión de insumos es una imagen poco aumento representante de día postnatal dLGN 5 (P5) del ratón evaluada posteriormente. B) siguiente anterógrada trazado de la izquierda (azul) y derecho (rojo) Entradas oculares. Barra de escala = 100 micras. Ci) A microglia (EGFP, verde) en la muestra de la región fronteriza de la izquierda (azul) y derecho (rojo) Entradas de los ojos (inserción en B). Cii) Ciii) de renderizado de superficie de la microglia y engullido entradas RGC. Incrementos de línea de malla = 5 micras. Di) Un representante de la microglía (verde, EGFP) de P5 dLGN. Entradas de CGR se etiquetan con CTB-594 (rojo) y los lisosomas son etiquetados con anti-CD68 (azul). Dii) Todo CTB fluorescencia fuera del volumen microglia se ha eliminado revelando engullido entradas RGC (rojo) y los lisosomas (azul) dentro del microglia . (verde) DIII) La mayoría de las entradas de CGR (rojo) están completamente localizados dentro de los lisosomas CD68-positivo (azul, flechas blancas) Div-v) El CD68 (Div) y CTB (Dv) canales solo.. Barra de escala = 10 micras. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Figura 2. Iconos del software Imaris.
Figura 3. Ventanas de navegación general en el software. A) La ventana de ajuste de visualización. B) La Ventana Puntero. Seleccione permitirá la selección de superficies específicas. Navegar permitirá la rotación de una imagen en el campo de visión. C) Es necesario estar en el modo Surpass de superficie de representación del volumen.
Figura 4. Representación de superficie en el software. A) La ventana de crear. B) Smoothventana ing. Seleccione el canal a la superficie en el menú desplegable (resaltado en amarillo). C) Thresholding la superficie de la imagen fluorescente. Destacado por la caja roja es el valor umbral que debe registrar la total del material engullido y no sumergido. Este número se aplicó más tarde con el umbral y la superficie del material engullido. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Figura 5. Obtención de mediciones de volumen de software. A) aquí que aparecen siguiente representación en superficie. Tenga en cuenta la varita, Lápiz, Embudo y fichas gráficas que se identifican en el texto. B) La máscara Todos disponen de visualizar el material engullido dentro del fagocito. Tenga en cuenta el canal seleccionado (yellow recuadro). C) La función de la ficha Funnel / filtro permite la selección de todas las superficies en el campo deslizando el histograma hasta el final a la izquierda por lo que parece amarillo. Cualquier filtro puede ser elegido para esto. D) En la pestaña Gráfico, medidas de volumen se pueden obtener y registrados. Por favor, haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Figura 6. Los datos representativos 7. Una) microglia-prestados superficie Representante de P5 (imagen fluorescente se muestra en la Figura 1), P9, P30 y dLGN ratón. Recuadros ampliados denotan con una línea de puntos de color negro.Incrementos de línea de malla = 5 m. B) Inmersión en las entradas de CGR se incrementa significativamente durante la poda de pico en el dLGN (P5) frente a las edades mayores (P9 y P30). * P <0,001 por ANOVA de una vía, n = 3 ratones / edad. C) La microglía de ratones deficientes en receptor del complemento 3 (KO, bar negro) engullir significativamente menos insumos de CGR, en comparación con sus compañeros de camada WT (barras blancas). Todos los datos están normalizados a valores de control WT. * P <0,04 por la prueba t de Student, n = 3 ratones / genotipo. Todas las barras de error representan sem Haga clic aquí para ver la imagen más grande.
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Discussion
Con el fin de medir con precisión la fagocitosis, el material engullido debe etiquetarse de tal manera que el investigador puede visualizar una vez se ha producido la degradación lisosomal. Además, se requiere formación de imágenes de alta resolución, seguido por el uso de software que permita el investigador para visualizar el volumen de toda la célula y cuantificar su contenido. En este protocolo, se describe un método altamente fiable y cuantitativa para medir la inmersión de los fagocitos mediada por el uso de CTB conjugada con colorantes de Alexa para etiquetar material de envuelta combinada con la microscopía confocal de alta resolución y la reconstrucción 3D. Esta metodología se ha utilizado en nuestro laboratorio para analizar con éxito la microglia mediada por inmersión de entradas presinápticas sometidos a remodelación sináptica en el cerebro de ratón en desarrollo (sistema de retinogeniculadas) 7. Además, se ha demostrado ser una técnica altamente sensible que puede distinguir cambios sutiles en inmersión a través de diferentes edades de desarrollo under condiciones no patológicas y entre los ratones de tipo salvaje y knockout. Con ajustes menores, este protocolo se puede adaptar para estudiar inmersión en los tejidos en vivo por imágenes de lapso de tiempo. Además, este protocolo se puede aplicar para estudiar las interacciones de los fagocitos de neuronas en la enfermedad.
Advertencias
Uno de los aspectos más útiles de este ensayo es la capacidad para etiquetar proyecciones neuronales de tal manera que permanecen visibles después de entrar en una ruta de degradación lisosomal. Sin embargo, debido a que la neurona se etiqueta, puede ser difícil distinguir qué parte de la célula ha sido fagocitado. Esto requiere un análisis muy cuidadoso regional (por ejemplo, región sináptica frente a una región no-sináptica de la dLGN) combinado con microscopía electrónica 7. Además, esto puede resultar más difícil en otras regiones del cerebro donde los cuerpos de células neuronales y proyecciones residen en la misma zona. Sin embargo, las estrategias alternativas de etiquetado se pueden emplear (ver below). Además, debido a los límites de resolución de la microscopía de luz, hay una posibilidad de que uno puede sobrestimar la cantidad de material de envuelta. Como resultado, se debe tener cuidado para validar que el material de envuelta está dentro de los lisosomas. Por esta razón, se utiliza anti-CD68 para etiquetar lisosomas dentro de microglia, 3D y vistas ortogonales para validar los parámetros del ensayo.
Tipos de células
Además de la microglía, esta metodología también podría aplicarse para analizar el papel de otros fagocitos en el cerebro (por ejemplo, astrocitos) y en los sistemas nervioso e inmunológico periféricas (por ejemplo, células de Schwann perisynaptic, macrófagos, etc.) Además, debido a la CTB conjugada con colorantes Alexa es tan fácilmente absorbido por la mayoría de las células, una estrategia de etiquetado similar puede ser utilizada para etiquetar el material envuelto a lo largo de la de otros sistemas de órganos y cerebro.
Etiquetado de Engulfed material
Como colalternativa a CTB conjugada con tintes de Alexa, hemos utilizado las siguientes estrategias para etiquetar el material engullido 7: 1) reportero ratones fluorescentes en los que la CGR se marcaron con una proteína fluorescente (por ejemplo, tdTomato, EGFP, etc.) 2) anterógrada etiquetado con un tinte pHrodo conjugado con dextrano, un colorante que sólo emite fluorescencia una vez que está en un lisosoma. El uso de estas diferentes estrategias, visualización y cuantificación de los insumos presináptica envueltos dentro de microglia pueden ser performedwith las mismas técnicas de imagen y cuantificación. Sin embargo, los conjugados de colorante de Alexa son los más robusto debido a la alta resistencia del colorante Alexa para lisosomales hidrolasas 7,21. Además, el etiquetado de material envuelto con anticuerpos (por ejemplo, anti-VGLUT2, una proteína presináptica vesicular) se ha intentado. Sin embargo, este es un método relativamente poco fiables de detección, dado que la mayoría de las proteínas se descomponen rápidamente hacia abajo una vez en los lisosomas. Es difícil distinguir baja fluorescencia debidaa la degradación de proteínas sobre el fondo.
Los animales utilizados
En el protocolo actual, microglia están marcados con fluorescencia genéticamente utilizando reportero ratones fluorescentes (CX3CR1-EGFP) 22. Sin embargo, hay casos en los que es necesario el etiquetado de anticuerpos frente a la expresión genética de construcciones indicadoras fluorescentes. Por ejemplo, cuando los ratones reportero fluorescentes no están disponibles para el fagocito de interés, es necesario el uso de ratas, o el investigador desea mirar en ratones knockout sin cruzar ellos en una línea de ratones reportero fluorescente. Para casos como estos, los fagocitos pueden ser etiquetados mediante inmunohistoquímica y los datos son comparables a los resultados de los experimentos que utilizan ratones reportero fluorescente 7. Tras seccionar los tejidos, por lo general utilizamos un protocolo de inmunotinción estándar para secciones flotantes 7. Es importante elegir un anticuerpo generado contra una proteína que etiquetar toda la célula ysus procesos. Por ejemplo, a la microglía de la etiqueta, anti-Iba1 se puede utilizar.
Aplicaciones más amplias: en vivo de imágenes y Enfermedad
Mientras que este protocolo se basa en el análisis de tejido fijado, ligeras modificaciones permitirían el mismo análisis en imágenes adquiridas por imágenes en vivo. Después de una sesión de imágenes de lapso de tiempo, los posteriores z-pilas se pueden procesar idénticos a los pasos 4-9 en este protocolo. Además, aunque hemos aplicado este protocolo para visualizar inmersión de las sinapsis durante la remodelación sináptica del desarrollo en el SNC sano, este protocolo también se puede aplicar en modelos de enfermedad. En particular, este protocolo puede ser utilizado para estudiar enfermedades en las que se someten a la remodelación de las sinapsis sustancial, como en el caso de la pérdida de sinapsis y la regeneración después de la lesión de la médula espinal, la pérdida de sinapsis temprana asociada con la enfermedad de Alzheimer, etc 12,14-19,23 - 26. Además, también se puede adaptar esta técnica para estudiar enfermedades en las que PhaGocytosis de material distinto de las sinapsis se ha descrito, tales como la microglía / macrófagos mediada por inmersión de la mielina en la enfermedad desmielinizante (por ejemplo, esclerosis múltiple) y atrapamiento de beta-amiloide en la enfermedad de Alzheimer 5,6,27-29.
En conclusión, el ensayo de inmersión descrito aquí ofrece una técnica conveniente, reproducible y sensible para estudiar las interacciones de los fagocitos con su entorno extracelular. Es importante destacar que este ensayo tiene una amplia gama de usos y capacidades que servirán a la comunidad de las neurociencias, así como los que trabajan en otros sistemas de órganos.
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Disclosures
No hay conflictos de interés declarado.
Acknowledgments
El trabajo fue apoyado por becas de la Fundación Smith Family (BS), la Fundación Dana (BS), John Merck Scholars Program (BS), NINDS (SR1-NS-07100801; BS), NRSA (F32-NS-066698; DPS), Nancy Fundación Lurie Marks (DPS), el NIH (P30-HD-18655; MRDDRC Imaging Core).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Heat pad | Vet Equip, Inc. | 965500 | |
| Warm water source for heat pad | Kent Scientific | TP-700 | |
| Stereo microscope | DSC Optical | Zeiss Opmi -6 Surgical Microscope | |
| Sliding microtome with freezing stage | Leica | SM2010 R | |
| Microtome blade | Leica | 14021607100 | |
| Fluorescent dissecting microscope | Nikon | SMZ800 with Epi-fluorescence attachment | |
| Spinning disk confocal microscope | Perkin Elmer | UltraView Vox Spinning Disk Confocal | |
| 10 µl Hamilton gas tight syringes | Hamilton | 80030 | Use a different syringe for each color dye/tracer |
| Hamilton needles | Hamilton | 7803-05, specifications: blunt, 1.5" | |
| Alexa-conjugated cholera toxin β subunit (CTB) | Invitrogen | 488: C22841 | Reconstitute in sterile saline, 80 µl (488), 100 µl (594), 20 µl (647) |
| 594: C22842 | |||
| 647: C34778 | |||
| Phosphate Buffered Saline (PBS) | Sigma | P4417-50TAB | |
| Neomycin and Polymyxin B Sulfates and Bacitracin Zinc Ophthalmic Ointment USP (antibiotic ointment) | Bausch & Lomb | 24208-780-55 | |
| 30.5 G needle | Becton Dickinson | 305106 | |
| Spring scissors | Roboz | RS-5630 | |
| Cotton-tipped applicator | Fisher | 23-400-125 | |
| Paraformaldeyde (PFA) | Electron Microscopy Sciences | 15710 | Dilute 16% to 4% in PBS. Paraformaldehye is toxic, use in a fume hood and wear personal protective equipment. |
| Dissection tools – scissors, forceps, spatula | Small scissors: Fine Science Tools | Small scissors:14370-22 | |
| Large scissors: Roboz | Large scissors: RS-6820 | ||
| #55 forceps: Fine Science Tools | #55 forceps: 11255-20 | ||
| Spatula: Ted Pella, Inc. | Spatula: 13504 | ||
| Sucrose | Sigma | S8501-5KG | Make 30% sucrose in PBS (weight/vol) |
| OCT Compound | VWR | 25608-930 | |
| Weigh boat | USA Scientific | 2347-1426 | |
| 24-well plates | BD Biosciences | 353047 | |
| Sodium phosphate monobasic | Sigma | S6566-500G | Make 0.2 M sodium phosphate monobasic (PB-A) in ddH2O and 0.2 M sodium phosphate dibasic (PB-B) in ddH2O. To make 0.1 M PB, combine 19 ml PB-A and 81 ml PB-B, fill to 200 ml with ddH2O |
| Sodium phosphate dibasic | Sigma | S5136-500G | |
| Coverslips, 22 X 50 mm, No. 1.5 | VWR | 48393 194 | |
| Charged microscope slide | VWR | 48311-703 | |
| Vectasheild | Vector Laboratories | H-1200 |
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