Summary
Microglia sono le cellule immunitarie residenti del sistema nervoso centrale (CNS) con una elevata capacità di fagocitare o fagocitare materiale nel loro ambiente extracellulare. Qui, un saggio largamente applicabile, affidabile e altamente quantitativa per la visualizzazione e la misurazione microglia-mediata fagocitazione dei componenti sinaptiche è descritto.
Abstract
La fagocitosi è un processo in cui una cellula avvolge materiale (intera cella, parti di una cellula, detriti, ecc) nel suo ambiente extracellulare circostante e successivamente digerisce questo materiale, comunemente mediante degradazione lisosomiale. Microglia sono le cellule immunitarie residenti del sistema nervoso centrale (CNS) la cui funzione fagocitica è stata descritta in una vasta gamma di condizioni di malattia neurodegenerativa (es. pallone beta-amiloide nella malattia di Alzheimer) allo sviluppo del cervello sano (ad esempio, sinaptica potature) 1-6. Il protocollo che segue è un test fagocitazione sviluppato per visualizzare e quantificare microglia-mediata fagocitazione degli ingressi presinaptici nel sistema retinogeniculate topo in via di sviluppo 7. Mentre questo test è stato utilizzato per valutare la funzione microglia in questo particolare contesto, un approccio simile può essere utilizzato per valutare altri fagociti tutto il cervello (ad esempio, astrociti) e il resto del corpo(ad esempio, macrofagi periferici) nonché altri contesti in cui avviene il rimodellamento sinaptico (ad esempio, il trauma cranico / malattia).
Introduction
Circuiti sinaptici rimodellare tutta la vita di un animale. Nel cervello in via di sviluppo, le sinapsi si formano in eccesso e devono subire la potatura sinaptica che comporta la rimozione selettiva di un sottoinsieme di sinapsi e la manutenzione e il potenziamento di quelle sinapsi che rimangono 8-10. Questo processo è necessario per conseguire la connettività precisa caratteristica del sistema nervoso adulto. Nell'adulto, sinapsi possono anche essere di plastica, in particolare nel contesto di apprendimento e memoria. Le correlazioni strutturali di questa plasticità si pensa di includere l'aggiunta e / o l'eliminazione delle spine dendritiche e boutons presinaptici 11-13. Oltre a questi ruoli nel sistema nervoso sano, rimodellamento sinaptico è anche coinvolto nella nervoso 12,14,15 malattia del sistema / infortunio. Ad esempio, a seguito di lesioni del midollo spinale, gli assoni mozzate successivamente devono rimodellare e formare nuove sinapsi per raggiungere funzionale 16-19 recupero.
nt "> Emergendo come un aspetto importante della plasticità sinaptica è il processo di fagocitosi o fagocitazione delle sinapsi destinati per la rimozione 3,5,20. Abbiamo recentemente dimostrato questo fenomeno nel contesto della potatura sinaptica nel sano, postnatale cervello di topo 7. particolare , microglia, i residenti del SNC cellule immunitarie e fagociti, sono stati mostrati per inghiottire ingressi presinaptici nel corso di un periodo di picco e in una regione di sviluppo di potatura sinaptica, la postnatale dorsale nucleo genicolato laterale (dLGN) del talamo. blocco genetica o farmacologica di questa fagocitazione portato a disavanzi sostenuti nella connettività sinaptica.In questo protocollo, si descrive un test affidabile e altamente quantitativo per misurare fagociti-mediata fagocitazione degli ingressi presinaptici. Ai fini del presente articolo, questo saggio sarà presentato nel contesto del sistema di sviluppo retinogeniculate, che comprende le cellule gangliari retiniche (RGC) residenti nella retina cheproiettare ingressi presinaptici al dLGN (Figura 1A). Per iniziare, un anterograda strategia etichettatura degradazione resistente lisosomiale sarà descritto, che viene utilizzato per visualizzare RGC-specifici ingressi presinaptici nel dLGN (Figura 1) 7,21. A seguito di questa descrizione, una metodologia dettagliata per l'imaging e misurare quantitativamente fagocitazione usando la microscopia confocale in combinazione con 3 dimensioni (3D) della superficie volume rendering sarà dato. Questa metodologia si basa sulla preparazione del tessuto fisso, ma può anche essere adattato per l'utilizzo in studi di imaging dal vivo. È importante sottolineare che, mentre il test è stato convalidato nel contesto del sistema retinogeniculate sano, postnatale, si potrebbe applicare le stesse tecniche per valutare altre interazioni fagociti neuroni in tutto il cervello e durante la malattia, così come la funzione dei fagociti in altri organi.
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Protocol
1. Anterograda Etichettatura di RGC presinaptici ingressi
Nota: Tutti gli esperimenti che comportano l'uso di animali sono stati esaminati e supervisionate dalla cura degli animali e l'uso comitato istituzionale (IACUC) in conformità a tutte le direttive NIH.
- Sterilizzare campo e gli strumenti.
- Anestetizzare mouse con 4 vol% isoflurano in una camera di induzione plexiglas (questa vol% isoflurano lavora per topi neonati-adulti). Osservare i topi strettamente per evitare un eccesso di anestetizzante. ATTENZIONE: Evitare l'inalazione con una evacuazione dei gas di scarico sotto vuoto.
- Dopo 1-3 minuti, (topi anziani richiedono meno tempo) garantire un adeguato livello di anestesia viene ottenuta pizzicando la coda (senza reazione dovrebbe essere osservato) e osservando la frequenza respiratoria (tasso dovrebbe essere lento e costante).
- Posizionare il mouse sotto il microscopio stereo su un lato e posto ogiva consegna 3-4 vol% isoflurano sul muso (neonati <giorno postnatale 10 (P10) ~ 4% vol;> P10 ~ 3% vol).
- Esporre la sclera. Per l'iniezione dei neonati prima di aprire gli occhi, usare un paio di piccole forbici a molla per aprire la palpebra e tirare indietro la pelle per esporre la sclera. Per i topi più anziani, usare le dita per tirare indietro la pelle che circonda l'occhio per esporre la sclera. ATTENZIONE: Nei neonati, a volte un altro taglio perpendicolare all'angolo dell'occhio è necessario. Fate attenzione quando si taglia l'angolo della palpebra in quanto vi è un vaso sanguigno che, se tagliato, si sanguinare eccessivamente.
- Utilizzare una sterile 30,5 G dell'ago per perforare un piccolo foro nel lato dell'occhio nella riga dove inizia la sclera. Fate attenzione a non danneggiare la lente inserendo l'ago quanto basta che lo smusso va nell'occhio.
- Lasciare il vitreo di fuoriuscire dal foro e utilizzare un applicatore con punta di cotone sterile per assorbire il liquido.
- Una volta che il vitreo si è smesso di scorrere fuori dal buco, inserire un ago ended smussato attaccato ad una siringa Hamilton precaricato con anterograda tracciamento colorantenel foro. Attenzione: inserire l'ago lentamente per evitare la puntura all'altro lato dell'occhio o danneggiare la lente.
- Lentamente iniettare colorante nell'occhio. Tipicamente, tossina colerica subunità β coniugato con Alexa 594, 647, o 488 (CTB-594, CTB-647, o CTB-488, 5-6 mg / mL) viene utilizzato per anterogradely ingressi RGC traccia. Per i neonati (≤ P10) 1-2 microlitri è sufficiente e per i topi> P10 ~ 3 ml è sufficiente. Nota: coloranti Alexa sono particolarmente resistenti alla degradazione lisosomiale
- Lasciare l'ago nel foro per alcuni secondi e poi rimuovere lentamente.
- Usare un applicatore con punta di cotone per assorbire il liquido in eccesso e prevenire la tintura di fuoriuscire.
- Applicare una piccola quantità di pomata antibiotica per l'occhio. Se l'occhio è stato aperto chirurgicamente, riposizionare delicatamente le palpebre insieme.
- Se l'iniezione entrambi gli occhi, ripetere la procedura su altro occhio.
- Dopo iniezione (s), lasciare mouse sotto una lampada di calore o su un tappetino di calore fino a quando non comincia a recuperare dal AnesthESIA.
- Ritorno mouse per una gabbia casa pulita e controllare per assicurarsi che sia completamente sveglio prima di tornare alla colonia.
2. Preparare Tissue Imaging
Questo protocollo di preparazione dei tessuti viene utilizzato per topi transgenici in cui i fagociti sono etichettati con marcatori fluorescenti (ad esempio, CX3CR1-EGFP per microglia). Se una linea giornalista non è disponibile, il ricercatore può immunostain sezioni di tessuto (vedi discussione).
- ~ 24 ore dopo l'iniezione, sacrificare il mouse e sezionare il cervello.
- Goccia fissare il cervello in un tubo Falcon riempito con 4% paraformaldeide (PFA) notte a 4 ° C. ATTENZIONE: PFA è tossico. Evitare l'inalazione e l'esposizione della pelle utilizzando in una cappa aspirante o su un tavolo downdraft e indossare dispositivi di protezione individuale. Note: Fissazione può essere più breve (≥ 4 ore). Inoltre, invece di fissaggio goccia, 4% PFA perfusione può essere utilizzata seguito da una correzione 2-24 hr goccia. Tuttavia, il confronto di nei profumid far cadere il cervello neonatale e adulti fissi rivelato alcuna differenza nella qualità dell'immagine o la quantificazione.
- Sciacquare i 3x cerebrali in tampone fosfato (PBS).
- Versare il cervello e PFA in un peso barca vuota.
- Utilizzare una spatola per trasferire il cervello ad un altro pesare barca piena di PBS.
- Lavare cervello altre due volte in PBS (cervello trasferimento ad altri due pesare barche piene di PBS).
- Trasferire il cervello di un tubo Falcon riempito con una soluzione di saccarosio al 30%. Lasciare il cervello in saccarosio a 4 ° C fino al cervello scende sul fondo della provetta (24-48).
- Una volta che il cervello affonda, preparare il cervello per il sezionamento. Le seguenti operazioni sono la preparazione di 40 sezioni micron mobile usando un microtomo a slitta con una fase di congelamento (un criostato può anche essere utilizzato).
- Utilizzare una lama di rasoio per rimuovere le parti del cervello che non sono necessari (per la dLGN, rimuovere le parti rostrale e caudale del cervello).
- Congelare il reggisenoin su un foglio di alluminio in ghiaccio secco. Durante questo tempo, congelare la fase microtomo e riempire ciascun pozzetto di una piastra da 24 pozzetti con 0,5 ml di tampone fosfato 0,1 M (PB).
- Montare il cervello congelato (dovrebbe apparire opaco) sul palco di congelamento.
- Applicare una piccola quantità di mescola ottimale temperatura di taglio (OCT) per lo stadio.
- Una volta che l'ottobre comincia a congelare, porre il cervello in ottobre La fine del cervello che sarà tagliata deve essere rivolto verso l'alto (ad esempio, per il dLGN, rivolta verso la parte caudale up).
- Coprire il cervello e ottobre con ghiaccio secco molto finemente tritato.
- Lascia ghiaccio secco sul cervello / ottobre per ~ 30 sec.
- Utilizzare un grande pennello per rimuovere il ghiaccio secco. Il cervello e ottobre devono essere congelati allo stadio.
- Iniziare sezionamento attraverso il tessuto fino a raggiungere la regione di interesse (ROI).
- Una volta raggiunta la ROI, utilizzare un piccolo pennello per rimuovere sezioni dalla lama e trasferirli alla piattaforma 24 pozzettie contenente 0,1 M PB (passo 2.5.2). Mantenere il pennello umido bagnando nel 0,1 M PB prima di rimuovere sezioni dalla lama. Nota: Le sezioni possono essere lasciati in 0.1 M PB notte a 4 ° C.
- Una volta che le sezioni sono stati raccolti, visualizzare l'etichettatura anterograda sotto un microscopio a fluorescenza dissezione e scegliere le sezioni che contengono il ROI.
- Montare le sezioni su un vetrino con un piccolo pennello.
- Applicare una piccola piscina di 0,1 M PB ad un vetrino da microscopio carica.
- Trasferire la sezione di tessuto al pool di PB.
- Utilizzare il PB e pennello per orientare e diffondere il tessuto.
- Utilizzare un Kimwipe per favorire l'eccesso PB. Fare attenzione ad evitare traspirazione fuori la sezione.
- Lasciare asciugare completamente.
- Applicare una piccola goccia di soluzione di montaggio per ogni sezione e montare un coprioggetto sulla parte superiore (22 x 50 mm, No. 1.5).
- Sigillare i bordi di scorrimento con smalto e conservare a -20 ° C fino sessione di imaging. Nota: Anche se di imaging conin una settimana di preparazione è consigliata, vetrini possono essere mantenuti a -20 ° C per diverse settimane prima di imaging.
3. Tissue Imaging
Tutte le immagini sono acquisite su un disco rotante microscopio confocale (UltraView Vox disco rotante microscopio confocale equipaggiato con laser a diodi (405 nm, 445 nm, 488 nm, 514 nm, 561 nm e 640 nm)). Le immagini possono anche essere acquisite su qualsiasi microscopio con la capacità di acquisire ad alta risoluzione Z-stack (ad esempio, scansione laser microscopio confocale, microscopio epifluorescente seguita da deconvoluzione, ecc). Dimensione del frame è tipicamente 1.000 x 1.000 pixel.
- Trova ROI a 10X di ingrandimento e di acquisire un'immagine. Per l'imaging microglia nel sistema retinogeniculate, il ROI è sezioni dLGN più mediale.
- Passaggio a più alto ingrandimento (obiettivo 60X Plan Apo, NA = 1.4, viene di solito utilizzato).
- Acquisire primo campo visivo contenente fagociti utilizzando 0,2 micron z-passos.
- Acquisire 15-19 più campi contenenti fagociti per animale.
4. Preparare Immagini per Quantificazione (ImageJ)
- Aperto z-stack in ImageJ.
- Vai al menu Immagine, selezionare il colore e canali di Spalato.
- Sottrarre sfondo dal canale (s) contenente il materiale inghiottito.
- Selezionare la finestra del canale contenente il materiale inghiottito (ad esempio, ingressi presinaptici).
- Vai al menu Processo e selezionare Sfondo Sottrai. Utilizzare un raggio palla di 10 pixel per anterograda tracciamento degli ingressi presinaptici nel dLGN. Nota: Il raggio palla viene determinata empiricamente. Tuttavia, dovrebbe generalmente essere grande come il raggio del più grande oggetto nell'immagine che non fa parte dello sfondo.
- Smooth il canale contenente la fagociti.
- Selezionare la finestra contenente il canale fagociti (ad esempio, microglia).
- Vai al menu Processo e select Filtri, intendo. Utilizzare un filtro medio di 1,5 (questa leviga l'immagine per il rendering di superficie in fasi successive).
- Sottrarre da sfondo il canale contenente la fagociti.
- Selezionare la finestra contenente il canale fagociti (ad esempio, microglia).
- Vai al menu Process, selezionare sfondo sottrarre (impostazioni dovranno essere empiricamente determinato). Utilizzare un raggio palla di 50 pixel per microglia EGFP-positivi.
- Unisci canali andando al menu Immagine e selezionando colori, unione Canali.
- ROI Crop contenente fagocita da file unito (questo rende la superficie di rendering più veloce, punto 5).
- Tracciare un riquadro intorno al ROI utilizzando lo strumento di selezione rettangolare nella barra degli strumenti.
- Vai al menu Image e selezionare Ritaglia.
- Split nuovamente i canali (vedi punto 4.2).
- Salvare ogni canale come file TIFF.
5. Preparare Immagine per la quantificazionein Imaris
- Aprire Imaris e fare in modo che l'icona del volume è selezionato nel menu in alto a sinistra (Figura 2).
- Aperto primo canale immagine ritagliata di (uno qualsiasi dei canali può essere aperto prima, basta essere coerenti).
- Aggiungere l'altro canale (s). Vai al menu Modifica, selezionare Aggiungi canali e selezionare il canale successivo nel file. (Ripetere questo passaggio per tutti i rimanenti canali). Nota: Per cambiare il colore, andare alla finestra di regolazione del display e fare clic sul nome del canale (Figura 3A). Si aprirà una finestra di dialogo per regolare il colore. Se la finestra di regolazione del display non è visibile, andare al menu Modifica e selezionare Regolazione visualizzazione.
- Regolare i valori dei pixel. Vai al menu Modifica e selezionare Proprietà immagine. In questa finestra, regolare x, y, z ed i valori dei pixel (Questi valori dipendono dal microscopio, obiettivo, fotocamera e acquisizione z-passo e possono essere trovati nel software utilizzato per acquisire l'immagine).
- Fase 5.5 si tradurrà in unpiccola. Per ridimensionare, fare clic sull'icona Fit nell'angolo in basso a destra (Figura 2).
- Nella finestra di regolazione del display, regolare la luminosità e il contrasto per ciascun canale utilizzando i triangoli sinistro e centrale.
6. 3 dimensioni (3D) Rendering Superficie del Fagocita
- Nella barra degli strumenti in alto, assicurarsi che la modalità Superare è selezionato (Figura 3C).
- Nella finestra di Regolazione visualizzazione, deselezionare tutti i canali eccetto il canale fagociti. Questo rimuoverli dal campo visivo.
- Fare clic sull'icona di rendering di superficie (Figura 2).
- Una finestra creare verrà visualizzata nella parte sinistra in basso (Figura 4A), assicurarsi di settore ROI è deselezionata in questa prima finestra. Fare clic sul pulsante blu in avanti in basso.
- Regolare il livellamento.
- Nella finestra successiva, scegliere il canale phagocyte dal menu a discesa (Figura 4B). Consente di regolare laquantità di dettagli che verranno a galla e dovrebbe essere determinato in modo empirico (0,1 micron smoothing viene in genere utilizzato per microglia).
- Selezionare soglia assoluta.
- Fare clic sul pulsante blu in avanti in basso.
- Threshold l'immagine.
- Clicca su istogramma e trascinare fino immagine è emerso in modo appropriato (Figura 4C). Questo è determinato empiricamente ruotando l'immagine di garantire le superfici grigie sovrapposta all'immagine fluorescente sono una rappresentazione accurata superficie. Note: Per ruotare, selezionare Naviga nel menu puntatore sul lato superiore destro dello schermo (Figura 3B), cliccare e tenere premuto l'immagine da ruotare. Per tornare sull'immagine per orientamento originale, selezionare Fondo Origine sinistra dal menu Visualizza.
- Fare clic sul pulsante blu in avanti in basso.
- Nella finestra successiva, c'è la possibilità di filtrare tutte le superfici in base alle dimensioni, ecc Se l'immagine è molto rumoroso, non filtrare ed eliminare unI filtri y che appaiono automaticamente. Fare clic sulla freccia verde in basso per terminare superficie rendering del fagociti. Apparirà una nuova serie di schede (Figura 5)
- Se necessario, eliminare eventuali superfici che non fanno parte del fagociti di interesse.
- Assicurarsi che l'opzione Select è selezionato nel menu Pointer (Figura 3B).
- Clicca su qualsiasi superficie da eliminare in modo che diventa giallo. Per eliminare più superfici, fare clic sulle superfici tenendo premuto il pulsante di controllo.
- Fare clic su Elimina nella scheda Pencil.
- Selezionare e unire tutte le superfici del fagocita in una superficie.
- Clicca sul Funnel (ie scheda Filtro, Figura 5C).
- Fare clic su Aggiungi.
- Scegliere qualsiasi filtro, trascinare l'istogramma all'estrema sinistra (tutte le superfici devono essere di colore giallo).
- Torna alla scheda Matita e fare clic su Unify.
- Vai alla scheda grafico (Figura 5A (Figura 5D). Per la visualizzazione di più parametri, andare sull'icona della chiave inglese in basso a sinistra (Figura 2) e di selezionare i parametri da registrare.
- Registrare il volume del phagocyte e salvare il file prima di continuare.
7. Rendering 3D Surface di Engulfed Materiale
- Creare un nuovo canale per il materiale che è stato travolto dal fagociti.
- Mentre è selezionata la superficie dei fagociti, fare clic sulla scheda matita.
- Fare clic su Maschera tutto.
- Nella finestra di dialogo che appare, selezionare il canale corrispondente al materiale inghiottito (ad esempio, anterograda tracciamento degli ingressi presinaptici; la figura 5B).
- Controllare canale duplicato prima di applicare la maschera e premere OK.
- Un nuovo canale apparirà nella finestra di regolazione del display che contiene solo il materiale che è stato travolto ed è all'interno delphagocyte.
- Rendere la superficie del canale che contiene materiale Engulfed e nonengulfed totale.
- Deselezionare tutti i canali nella finestra di regolazione del display, tranne per il canale da asfaltata e deselezionare la superficie creata per il phagocyte.
- Fare clic sull'icona di rendering di superficie di nuovo (vedi punto 6.3) e creare una superficie per il canale utilizzando gli stessi passi descritti per la fagociti (passaggi 6,4-6,11). Note: Assicurarsi di selezionare il canale corretto prima di rasare e soglia (punto 6.5, figura 4B). Prendere nota del valore di soglia (vedere il punto 6.6; Figura 4C). Questo valore può essere ottenuto anche dopo il rendering superficie è completa (scheda bacchetta; Figura 5A).
- Registrare il volume del materiale totale inghiottito e non travolto e salvare il file prima di continuare.
- Render superficie del materiale fagocitato (materiale all'interno del fagociti).
- Visualizza fluorescenza soloil nuovo canale di materiale travolto (vedi punto 7.2.1).
- Seguire la stessa procedura come sopra (passi 7,2-7,3). Note: Assicurarsi di selezionare il canale corretto dal menu a discesa prima di rasare (scegliere il nuovo canale creato nel passaggio 7.1). Nella finestra di soglia, immettere manualmente il valore di soglia che è stato impostato per il rendering del materiale totale inghiottito e non travolto (vedi punto 7.2.2).
- Registrare il volume del materiale inghiottito e salvare il file prima di continuare.
8. Calcola il volume totale del campo visivo
- Creare una nuova superficie per ogni canale.
- Nella finestra thresholding (passo 6.6), far scorrere l'istogramma completamente verso sinistra in modo che l'intero campo è emerso.
- Termina emersione l'intero campo e registrare il volume (passaggi 6,7-6,11).
- Salvare il file.
9. Calcolare la quantità di materiale fagocitati
- Calcolare la densità deltotale canale materiale inghiottito e non inghiottito utilizzando il seguente algoritmo:
Volume di Total Engulfed e non Engulfed Material (punto 7.3) / Volume del campo (punto 8). - Calcola% fagocitazione per cella utilizzando il seguente algoritmo:
(Volume di Engulfed Material (punto 7.5) / Volume totale Fagocita (punto 6.11)) x 100
Note: per tenere conto di variazioni nelle dimensioni delle cellule, i dati vengono normalizzati per il volume totale della fagociti. Se i numeri di passo 9.1 sono molto variabili tra i campi, può essere necessario normalizzare i dati dal punto 9.2 al calcolo in 9.1.
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Representative Results
Recentemente, abbiamo utilizzato questo test fagocitazione per visualizzare e quantificare microglia-mediata fagocitazione degli ingressi presinaptici nel sistema retinogeniculate in via di sviluppo (Figura 1) 7. RGC da CX3CR1-EGFP topi eterozigoti sono stati rintracciati anterogradely con CTB-594 e CTB-647 negli occhi sinistro e destro rispettivamente. A seguito di tale tracciato, microglia EGFP-positivi all'interno del dLGN sono stati ripresi. Queste immagini sono state successivamente superficie-rendering per le misure di volume.
Usando questa tecnica, abbiamo scoperto che durante un periodo di picco di sviluppo rimodellamento sinaptico ai dLGN (P5), ingressi presinaptici sono inghiottiti dalla microglia (Figura 6). Un minimo di 4 giorni più tardi quando una grande quantità di rimodellamento è quasi completa (P9), vi è una drammatica riduzione della quantità di ingressi inghiottito. Inoltre, fagocitazione e la potatura sono interrotti nei topi con deficit di proteine appartenenti alla cascata del complemento classico(Figura 6), nonché a seguito di manipolazione neuronale (dati non mostrati) 7.
Figura 1. Strategia per valutare microglia-mediata fagocitazione degli ingressi presinaptici RGC 7. A) Schema di anterograda strategia di analisi. Ingressi sinistro e occhio destro RGC sono tracciate con CTB-647 (blu) e CTB-594 (rosso), rispettivamente. Microglia-mediata (verde) fagocitazione degli ingressi viene successivamente valutata. B) Una immagine rappresentativa basso ingrandimento del giorno postnatale 5 (P5) del mouse dLGN seguente anterograda tracciamento di sinistra (blu) e destra (rosso) ingressi occhi. Barra della scala = 100 micron. Ci) A microglia (EGFP, verde) campionati dalla regione di confine di sinistra (blu) e destro (rosso) ingressi degli occhi (riquadro in B). Cii) CIII) di rendering di superficie della microglia e inghiottito ingressi RGC. Incrementi linea della griglia = 5 micron. Di) A microglia rappresentante (verde, EGFP) dal P5 dLGN. Ingressi RGC sono etichettati con CTB-594 (rosso) e lisosomi sono etichettati con anti-CD68 (blu). Dii) Tutti CTB fluorescenza al di fuori del volume microglia è stata rimossa rivelando inghiottito ingressi RGC (rosso) e lisosomi (blu) all'interno della microglia . (verde) DIII) Record di ingressi RGC (rosso) sono completamente localizzati all'interno CD68-positive lisosomi (blu, frecce bianche) Div-v) Il CD68 (Div) e CTB (Dv) canali da solo.. Barra della scala = 10 micron. cliccate qui per vedere una versione più grande di questa figura.
Figura 2. Imaris icone del software.
Figura 3. Finestre di navigazione generali nel software. A) la finestra di regolazione del display. B) La Finestra Pointer. Selezionare consentirà la selezione di superfici specifiche. Passare consentirà la rotazione di un'immagine nel campo visivo. C) E 'necessario essere in modalità sorpassa superficie per rendere il volume.
Figura 4. Il rendering di superficie nel software. A) La finestra Create. B) Smoothfinestra ing. Selezionare il canale di superficie dal menu a discesa (evidenziato in giallo). C) Thresholding la superficie per l'immagine fluorescente. Evidenziata dal riquadro rosso è il valore di soglia che deve essere registrato per totale di materiale inghiottito e non inghiottito. Questo numero sarà applicata in seguito alla soglia di superficie e il materiale inghiottito. Cliccare qui per vedere una versione più grande di questa figura.
Figura 5. Ottenere misurazioni del volume nel software. A) schede che compaiono di seguito il rendering di superficie. Si noti la Bacchetta, Matita, Imbuto, e le schede grafico che si identificano nel testo. B) La maschera dispongono tutte di visualizzare materiale inghiottito nel fagociti. Notare il canale selezionato (yeLlow box). C) La caratteristica nella scheda Imbuto / filtro consente la selezione di tutte le superfici nel settore facendo scorrere l'istogramma completamente verso sinistra in modo che appaia gialla. Ogni filtro può essere scelto per questo. D) Nella scheda Grafico, misurazioni del volume possono essere ottenute e registrate. Cliccate qui per vedere una versione più grande di questa figura.
Figura 6. Dati rappresentativi 7. A) rappresentativa microglia-superficie resi da P5 (immagine fluorescente è mostrato in Figura 1), P9 e P30 dLGN topo. Inserti ingrandite contrassegnate da una linea nera tratteggiata.Incrementi linea della griglia = 5 micron. B) Engulfment degli ingressi RGC è significativamente aumentata nel corso di picco di potatura in dLGN (P5) rispetto a età più avanzata (P9 e P30). * P <0.001 per one-way ANOVA, n = 3 topi / età. C) Microglia da topi con deficit di complemento recettore 3 (KO, barra nera) fagocitare significativamente meno ingressi RGC, rispetto ai fratellini WT (barra bianca). Tutti i dati sono normalizzati ai valori di controllo WT. * P <0.04 per il test t di Student, n = 3 topi / genotipo. Tutte le barre di errore rappresentano sem Clicca qui per vedere l'immagine ingrandita.
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Discussion
Al fine di misurare con precisione la fagocitosi, materiale inghiottito deve essere etichettato in modo tale che il ricercatore può visualizzare una volta è verificato degradazione lisosomiale. Inoltre, è necessaria imaging ad alta risoluzione, seguito dall'uso di software che permetterà al ricercatore di visualizzare il volume dell'intera cella e quantificare il contenuto. In questo protocollo, si descrive un metodo altamente affidabile e quantitativo per la misurazione fagocitazione phagocyte-mediata con CTB coniugata ai coloranti Alexa etichettare il materiale inghiottito combinato con alta risoluzione microscopia confocale e la ricostruzione 3D. Questa metodologia è stata utilizzata nel nostro laboratorio per analizzare con successo microglia mediata-fagocitazione degli ingressi presinaptici in fase di rimodellamento sinaptico nel cervello di topo in via di sviluppo (sistema retinogeniculate) 7. Inoltre, ha dimostrato di essere una tecnica altamente sensibile in grado di distinguere i cambiamenti sottili nella fagocitazione attraverso diverse età evolutive under condizioni non patologiche e fra di tipo selvatico e topi knockout. Con piccole modifiche, questo protocollo può essere adattato per studiare engulfment in tessuti vivi da imaging lasso di tempo. Inoltre, questo protocollo può essere applicato per studiare le interazioni fagociti neuroni nella malattia.
Avvertenze
Uno degli aspetti più utili di questo test è la capacità di etichettare proiezioni neuronali in modo che rimangano visibili dopo aver inserito una via di degradazione lisosomiale. Tuttavia, poiché il neurone è etichettato, può essere difficile distinguere quale parte della cellula è stato fagocitato. Ciò richiede una attenta analisi regionale (ad esempio, nella regione sinaptica contro una regione non-sinaptica del dLGN) combinato con microscopia elettronica 7. Inoltre, puo 'risultare più difficile in altre regioni del cervello in cui corpi cellulari neuronali e proiezioni risiedono nella stessa zona. Tuttavia, le strategie in materia di etichettatura alternative possono essere impiegati (vedi belOW). Inoltre, a causa dei limiti di risoluzione di microscopia ottica, vi è la possibilità che si può sovrastimare la quantità di materiale inghiottito. Come risultato, la cura deve essere presa per verificare che il materiale inghiottito è all'interno dei lisosomi. Per questo motivo, usiamo anti-CD68 per etichettare lisosomi all'interno microglia, rendering 3D, e viste ortogonali per convalidare i parametri del test.
Tipi di cellulari
Oltre a microglia, questa metodologia può essere applicata anche ad analizzare il ruolo di altri fagociti nel cervello (ad esempio, astrociti) e nei sistemi nervosi e immunitari periferici (ad esempio, cellule di Schwann perisynaptic, macrofagi, ecc.) Inoltre, poiché CTB coniugata coloranti Alexa è così prontamente ripreso dalla maggior parte delle cellule, una strategia di etichettatura simile può essere utilizzato per etichettare materiale inghiottito tutto il altri organi e cervello.
Etichettatura di Engulfed Materiale
Come alternativa a CTB coniugata ai coloranti Alexa, abbiamo utilizzato le seguenti strategie per etichettare il materiale inghiottito 7: 1) topi transgenici fluorescenti in cui RGCs sono stati etichettati con una proteina fluorescente (per esempio, tdTomato, EGFP, ecc.) 2) etichettatura anterograda con un colorante pHrodo coniugato con destrano, un colorante fluorescente che solo una volta in un lisosoma. Utilizzando queste diverse strategie, la visualizzazione e la quantificazione degli ingressi presinaptici inghiottito all'interno microglia possono essere performedwith le stesse tecniche di imaging e di quantificazione. Tuttavia, i coniugati colorante Alexa sono le più robuste causa della elevata resistenza di Alexa colorante idrolasi lisosomiali 7,21. Inoltre, l'etichettatura del materiale avvolto con anticorpi (ad esempio anti-VGlut2, una proteina vescicolare presinaptica) è stato tentato. Tuttavia, questo è un metodo relativamente poco affidabili di rilevamento dato che la maggior parte delle proteine vengono rapidamente ripartiti volta in lisosomi. E 'difficile distinguere bassa fluorescenza dovutadi degradazione delle proteine su sfondo.
Animali usati
Nel protocollo attuale, microglia sono fluorescente geneticamente utilizzando topi transgenici fluorescenti (CX3CR1-EGFP) 22. Tuttavia, vi sono casi in cui sia necessario etichettatura anticorpo contro l'espressione genetica di costrutti reporter fluorescenti. Per esempio, quando i topi reporter fluorescente non sono disponibili per la fagociti di interesse, è necessario l'uso di ratti, o il ricercatore desidera guardare topi knockout senza intrecciarli in una linea di topi reporter fluorescente. Per casi come questi, fagociti possono essere etichettati con immunoistochimica e dati sono paragonabili ai risultati di esperimenti su topi reporter fluorescente 7. A seguito di sezionamento del tessuto, di solito utilizziamo un protocollo immunostaining standard per le sezioni di galleggiamento 7. È importante scegliere un anticorpo sollevata contro una proteina che etichettare l'intera cella esuoi processi. Ad esempio, per microglia etichette, anti-Iba1 può essere utilizzato.
Applicazioni più ampi: in diretta Imaging e malattia
Mentre questo protocollo si basa su analisi del tessuto fisso, leggere modifiche consentirebbero la stessa analisi di immagini acquisite da immagini dal vivo. A seguito di una sessione di imaging lasso di tempo, le successive Z-stack possono essere elaborati identici ai passi 4-9 in questo protocollo. Inoltre, mentre abbiamo applicato questo protocollo per visualizzarne la fagocitazione delle sinapsi durante evolutiva rimodellamento sinaptico nel sano sistema nervoso centrale, questo protocollo può essere applicato anche in modelli di malattia. In particolare, questo protocollo può essere usato per studiare le malattie in cui sinapsi subiscono sostanziali rimodellamento, come nel caso di perdita di sinapsi e rigenerazione dopo la lesione del midollo spinale, perdita sinapsi precoce associata alla malattia di Alzheimer, ecc 12,14-19,23 - 26. Inoltre, si può anche adattare questa tecnica per studiare le malattie in cui phagocytosis di materiale diverso sinapsi è stato descritto, ad esempio microglia / macrofagi mediata engulfment della mielina in malattie demielinizzanti (ad esempio, sclerosi multipla) e engulfment di beta-amiloide nella malattia di Alzheimer 5,6,27-29.
In conclusione, il saggio engulfment qui descritto offre una tecnica conveniente, riproducibile e sensibile per studiare le interazioni fagocita con il loro ambiente extracellulare. È importante sottolineare che questo saggio ha una vasta gamma di usi e le capacità che servirà la comunità neuroscienze, così come coloro che lavorano in altri organi.
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Disclosures
Nessun conflitto di interessi dichiarati.
Acknowledgments
Il lavoro è stato sostenuto da finanziamenti della Fondazione Famiglia Smith (BS), Dana Foundation (BS), John Merck Scholars Program (BS), NINDS (RO1-NS-07100801, BS), NRSA (F32-NS-066698; DPS), Nancy Lurie Marks Foundation (DPS), NIH (P30-HD-18655; MRDDRC Imaging Core).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Heat pad | Vet Equip, Inc. | 965500 | |
| Warm water source for heat pad | Kent Scientific | TP-700 | |
| Stereo microscope | DSC Optical | Zeiss Opmi -6 Surgical Microscope | |
| Sliding microtome with freezing stage | Leica | SM2010 R | |
| Microtome blade | Leica | 14021607100 | |
| Fluorescent dissecting microscope | Nikon | SMZ800 with Epi-fluorescence attachment | |
| Spinning disk confocal microscope | Perkin Elmer | UltraView Vox Spinning Disk Confocal | |
| 10 µl Hamilton gas tight syringes | Hamilton | 80030 | Use a different syringe for each color dye/tracer |
| Hamilton needles | Hamilton | 7803-05, specifications: blunt, 1.5" | |
| Alexa-conjugated cholera toxin β subunit (CTB) | Invitrogen | 488: C22841 | Reconstitute in sterile saline, 80 µl (488), 100 µl (594), 20 µl (647) |
| 594: C22842 | |||
| 647: C34778 | |||
| Phosphate Buffered Saline (PBS) | Sigma | P4417-50TAB | |
| Neomycin and Polymyxin B Sulfates and Bacitracin Zinc Ophthalmic Ointment USP (antibiotic ointment) | Bausch & Lomb | 24208-780-55 | |
| 30.5 G needle | Becton Dickinson | 305106 | |
| Spring scissors | Roboz | RS-5630 | |
| Cotton-tipped applicator | Fisher | 23-400-125 | |
| Paraformaldeyde (PFA) | Electron Microscopy Sciences | 15710 | Dilute 16% to 4% in PBS. Paraformaldehye is toxic, use in a fume hood and wear personal protective equipment. |
| Dissection tools – scissors, forceps, spatula | Small scissors: Fine Science Tools | Small scissors:14370-22 | |
| Large scissors: Roboz | Large scissors: RS-6820 | ||
| #55 forceps: Fine Science Tools | #55 forceps: 11255-20 | ||
| Spatula: Ted Pella, Inc. | Spatula: 13504 | ||
| Sucrose | Sigma | S8501-5KG | Make 30% sucrose in PBS (weight/vol) |
| OCT Compound | VWR | 25608-930 | |
| Weigh boat | USA Scientific | 2347-1426 | |
| 24-well plates | BD Biosciences | 353047 | |
| Sodium phosphate monobasic | Sigma | S6566-500G | Make 0.2 M sodium phosphate monobasic (PB-A) in ddH2O and 0.2 M sodium phosphate dibasic (PB-B) in ddH2O. To make 0.1 M PB, combine 19 ml PB-A and 81 ml PB-B, fill to 200 ml with ddH2O |
| Sodium phosphate dibasic | Sigma | S5136-500G | |
| Coverslips, 22 X 50 mm, No. 1.5 | VWR | 48393 194 | |
| Charged microscope slide | VWR | 48311-703 | |
| Vectasheild | Vector Laboratories | H-1200 |
References
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