Summary
Микроглия являются резидентные иммунные клетки центральной нервной системы (ЦНС) с высокой способностью фагоцитозу или поглотить материал в их внеклеточной среде. Здесь широко применимы, надежный и очень количественный анализ для визуализации и измерения микроглии-опосредованной полном охвате синаптических компонентов описан.
Abstract
Фагоцитоз представляет собой процесс, в котором клетка поглощает материал (вся клеток, частей клеток, мусора и т.д.) в окружающей его внеклеточной среде, а затем переваривает этот материал, как правило, через деградации лизосом. Микроглия являются резидентные иммунные клетки центральной нервной системы (ЦНС), чьи фагоцитарной функции была описана в широком диапазоне условий от нейродегенеративных заболеваний (например, бета-амилоид зазора при болезни Альцгеймера) для развития здорового мозга (например, синаптической обрезка) 1-6. Следующий протокол является охвате анализа разработан для визуализации и количественной микроглии-опосредованной полном охвате пресинаптических входов в развивающихся мыши системы retinogeniculate 7. В то время как этот анализ был использован для оценки функции микроглии в данном конкретном контексте, подобный подход может быть использован для оценки других фагоцитов по всему мозгу (например, астроцитов) и остальной частью тела(например, периферические макрофаги), а также другие условия, в которых происходит ремоделирование синапсов (например, повреждение головного мозга / болезнь).
Introduction
Synaptic схемы реконструировать в течение всей жизни животного. В развивающемся мозге, синапсы образуются в избытке, и должны пройти синаптическую обрезку, которая предусматривает селективное удаление подмножества синапсов а также поддержание и укрепление этих синапсов, которые остаются 8-10. Этот процесс необходим для достижения точного характеристику подключения взрослого нервной системы. У взрослых, синапсы также может быть пластик, особенно в контексте обучения и памяти. Структурные корреляты этой пластичности, как полагают, включают в себя добавление и / или ликвидации дендритных шипиков и пресинаптических бутонов 11-13. В дополнение к этим ролям в здоровой нервной системы, синаптической ремоделирования также участвует в заболевание нервной системы / травмы 12,14,15. Например, после травмы спинного мозга, отрубленные аксоны должны впоследствии реконструировать и формировать новые синапсы для достижения функционального восстановления 16-19.
нт "> Появившись как важного аспекта синаптической пластичности является процесс фагоцитоза или охвате синапсов, предназначенных для удаления 3,5,20. Недавно мы показали это явление в контексте синаптической обрезки в здоровой, послеродовой мозга мыши 7. частности , микроглии, резиденты ЦНС иммунные клетки и фагоциты, были показаны поглотить пресинаптические входы в пиковый период и в области развития синаптической обрезки, послеродовой спинной латерального коленчатого тела (dLGN) таламуса. Генетическая или фармакологическая блокада этой охвате привело к длительным дефицитом в синаптической связи.В этом протоколе, мы описываем надежный и очень количественного анализа для измерения фагоцитов опосредованного полном охвате пресинаптических входов. Для целей настоящей статьи, этот анализ будет представлен в контексте развивающегося retinogeniculate системы, которая включает ганглиозных клеток сетчатки (РГК), проживающего в сетчатке, чтопроецировать пресинаптические вклад в dLGN (рис. 1А). Для начала, лизосомального деградации устойчивых антероградная стратегия маркировка будет описано, которая используется для визуализации RGC-специфические пресинаптические входы в dLGN (рис. 1) 7,21. После этого описания, подробной методики для работы с изображениями и количественного измерения полном охвате помощью конфокальной микроскопии в сочетании с 3 мерные (3D) поверхности объема оказания будет дано. Эта методика основана на подготовку фиксированной ткани, но также могут быть адаптированы для использования в живых визуальных исследований. Важно отметить, что в то время как анализ был подтвержден в контексте здорового, послеродовой системы retinogeniculate, можно применять те же методы для оценки других взаимодействий фагоцитов-нейронов по всему мозгу и во время болезни, а также функцию фагоцитов в других органах и системах.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. Антероградная Маркировка РГК пресинаптических входов
Примечание: Все эксперименты, связанные с использованием животных были рассмотрены и под контролем институциональной уходу и использованию животных комитета (IACUC) в соответствии со всеми руководящими принципами NIH.
- Стерилизовать поле и инструменты.
- Обезболить мышь с 4% об изофлураном в индукции камеры оргстекла (этот объем% изофлюран работает для новорожденных-взрослый мышей). Соблюдайте мышей тесно, чтобы избежать чрезмерной обезболивающих. ВНИМАНИЕ: Избегайте вдыхания с эвакуации вакуум отходящих газов.
- После 1-3 мин, (старшего мышей потребует меньше времени) обеспечить соответствующий уровень анестезии достигается, зажимая хвост (не должно наблюдаться никакой реакции) и наблюдая частоту дыхания (ставка должна быть медленный и стабильный).
- Наведите мышь под стереомикроскопом на бок и место носового конуса доставки 3-4% по объему изофлурана по языку (новорожденные <послеродовой день 10 (P10) ~ 4% по объему;> P10 ~ 3% по объему).
- Expose склеры. Для инъекций новорожденных до открытия глаз, используйте пару маленьких весенних ножницами, чтобы открыть веко и оттяните кожу, чтобы разоблачить склеры. Для более старых мышей, используйте пальцы, чтобы отступить кожу вокруг глаз, чтобы разоблачить склеры. ВНИМАНИЕ: В новорожденных, иногда другой, перпендикулярной Срез у угла глаза необходимо. Будьте осторожны при резки угол века, поскольку есть кровеносный сосуд, который, если сократить, будет кровоточить.
- С помощью стерильного 30,5 г иглу, чтобы проколоть маленькое отверстие в боковой части глаза на линии, где начинается склеры. Позаботьтесь, чтобы не повредить объектив, вставив иглу просто достаточно далеко, что угловая переходит в глаза.
- Разрешить стекловидное тело течь из отверстия и использовать стерильный ватный-наконечником аппликатором поглощать жидкость.
- После того, как стекловидное тело уже перестала течь из отверстия, вставить затупляли иглу, прикрепленную к шприца Гамильтона с предустановленной антероградной трассировки красителяв отверстие. ВНИМАНИЕ: Вставьте иглу медленно, чтобы избежать прокалывания другую сторону глаза и не повредить объектив.
- Медленно вводить краситель в глаз. Как правило, холерный токсин β-субъединицы, конъюгированного с Alexa 594, 647, или 488 (CTB-594, CTB-647, или CTB-488, 5-6 мкг / мкл) используется для anterogradely входов RGC трассировки. Для новорожденных (≤ P10) 1-2 мкл достаточно и для мышей> P10 ~ 3 мкл достаточно. Примечание: Alexa красители особенно устойчивы к деградации лизосом
- Оставьте иглу в отверстие в течение нескольких секунд, а затем медленно удалить.
- Используйте ватную палочку, чтобы поглотить лишнюю жидкость и предотвратить краску от утечки.
- Нанесите небольшое количество мази с антибиотиком для глаз. Если глаз вскрывают хирургически, мягко перемещать веки вместе.
- Если инъекционных оба глаза, повторите процедуру на другой глаз.
- После инъекции (ы), оставить мышь под инфракрасной лампой или на тепловой площадку, пока не начнет восстанавливаться от AnesthОВОС.
- Вернуться мышь на чистую домашнюю клетку и контролировать, чтобы убедиться, что это полностью проснулся, прежде чем вернуться в колонию.
2. Подготовьте Tissue для работы с изображениями
Этот протокол подготовки ткани используется для репортерных мышей, в котором фагоциты, меченные флуоресцентными маркерами (например, CX3CR1-EGFP для микроглии). Если репортер линия не доступна, следователь может immunostain срезах тканей (см. Обсуждение).
- ~ 24 часа в сутки после инъекции, пожертвовать мышь и препарировать мозг.
- Оставьте зафиксировать мозг в Сокол трубки, заполненной 4% параформальдегида (PFA) в течение ночи при 4 ° С. ВНИМАНИЕ: PFA является токсичным. Избегайте вдыхания и контакта с кожей с помощью в вытяжном шкафу или на столе нисходящего и носить средства индивидуальной защиты. Примечания: Фиксация может быть короче (≥ 4 ч). Кроме того, вместо фиксации капли, 4% PFA перфузии может быть использован с последующим 2-24 ч капли исправить. Однако сравнение Заливатьд падать фиксированные новорожденных и мозга взрослого человека не выявлено никакой разницы в качестве изображения или количественного.
- Промыть 3 раза мозга в забуференном фосфатом физиологическом растворе (PBS).
- Вылейте мозг и PFA в пустую взвешивания лодке.
- Используйте лопаточку, чтобы передать мозг на другой весят лодку, наполненную PBS.
- Вымойте мозга в два раза больше в PBS (трансфер мозг еще два весят лодки, наполненные PBS).
- Трансфер мозг к Сокола трубки, заполненной 30% раствора сахарозы. Оставьте мозг сахарозы при 4 ° С, пока мозг не опускается на дно пробирки (24-48 ч).
- Как только мозг погружается, подготовить мозг для секционирования. Следующие шаги подготовка 40 мкм с плавающей секции с помощью скользящего микротома с морозильной стадии (криостат также может быть использован).
- Используйте лезвие для удаления части мозга, которые не нужны (для dLGN, удалить ростральные и хвостовой части мозга).
- Замораживание лифчикв алюминиевой фольги над сухим льдом. В течение этого времени заморозить этап микротомных и заполнить каждую лунку 24-луночного планшета с 0,5 мл 0,1 М фосфатного буфера (PB).
- Установите замороженный мозг (он должен появиться непрозрачный) на сцене замерзания.
- Нанесите небольшое количество оптимального температурного резки соединения (ОКТ) на сцену.
- После октября начинает замерзать, лежал мозг в октябре Конец мозга, которые будут сокращены должен быть обращен вверх (например, для dLGN, сталкиваются с хвостовой частью вверх).
- Накройте мозг и октябре с очень мелко измельченного сухого льда.
- Оставьте сухой лед на мозг / октябрь в течение ~ 30 сек.
- Используйте большую кисть, чтобы удалить сухой лед. Мозг и октябре должны быть заморожены на сцену.
- Начните секционирования через ткань, пока область интереса (ROI) не будет достигнута.
- После того, как ROI достигается, используйте маленькую кисть, чтобы удалить разделы из лезвия и передавать их в Плат 24-ае содержащего 0,1 М PB (шаг 2.5.2). Держите кисть влажная путем смачивания его в 0,1 М PB до удаления разделов от лезвия. Примечание: Разделы можно оставить в 0,1 М PB в течение ночи при 4 ° С.
- После того, как разделы были собраны, визуализировать антероградную маркировку под флуоресцентным микроскопом рассекает и выберите разделы, которые содержат ROI.
- Установите разделы на слайде с небольшим кистью.
- Нанесите небольшое пул 0,1 М PB для заряженной стекло микроскопа.
- Трансфер срезы ткани в бассейн ПБ.
- Используйте PB и кисть, чтобы сориентироваться и распространять ткани.
- Используйте Kimwipe для фитиля от лишнего PB. Позаботьтесь, чтобы избежать затекания от раздел.
- Позволит полностью высохнуть на воздухе.
- Нанесите небольшое падение монтажной среды к каждому разделу и смонтировать покровное на вершине (22 х 50 мм, № 1.5).
- Уплотнение края слайда с лаком для ногтей и хранить при температуре -20 ° С до визуализации сессии. Примечание: Хотя изображения св неделю препарат рекомендуется, слайды можно поддерживать при температуре -20 ° С в течение нескольких недель до визуализации.
3. Изображений тканей
Все изображения получены на вращающемся диске конфокальной микроскопии (UltraView Vox вращающийся диск конфокальной микроскопии оснащена диодных лазеров (405 нм, 445 нм, 488 нм, 514 нм, 561 нм и 640 нм)). Изображения можно также приобрести на любом микроскопе с возможностью приобретения высокого разрешения Z-стеки (например, лазерной сканирующей конфокальной микроскопии, epifluorescent микроскопом с последующим деконволюции и т.д.). Размер рамы, как правило, 1000 х 1000 пикселей.
- Найти ROI в 10-кратным увеличением и получить изображение. Для визуализации микроглии в системе retinogeniculate, ROI является наиболее медиальной разделы dLGN.
- Переход к большему усилению (объективной 60X План Апо, NA = 1.4, как правило, используется).
- Приобретать первое поле зрения, содержащей фагоциты используя 0,2 мкм Z-шагс.
- Приобретать 15-19 больше полей, содержащих фагоциты на одно животное.
4. Подготовка изображений для количественного (ImageJ)
- Открыть Z-Stack в ImageJ.
- Перейдите в меню Image, выберите цвет и Сплит каналов.
- Вычитание фона от канала (ов), содержащего охвачен материал.
- Выберите окно канала, содержащий охватившего материал (например, пресинаптические входы).
- Перейдите в меню Process и выберите Subtract Background. Используйте катящийся шар радиусом 10 пикселей для антероградной отслеживания пресинаптических входов в dLGN. Примечание: Радиус катящийся шар определяется опытным путем. Тем не менее, как правило, должны быть такого размера, как радиус наибольшего объекта на изображении, который не является частью фона.
- Гладкая канал, содержащий фагоцитов.
- Выберите окно канала, содержащий фагоцитов (например, микроглии).
- Перейдите в меню Process и сельЭСТ Фильтры, значит. Используйте средний фильтр 1,5 (это сглаживает изображение на оказание поверхности в более поздних стадий).
- Вычтите фон из канала, содержащего фагоцитов.
- Выберите окно канала, содержащий фагоцитов (например, микроглии).
- Перейдите в меню Процесс выберите вычитания фона (настройки должны быть определены эмпирически). Используйте катящийся шар радиусом 50 пикселей для EGFP-позитивных микроглии.
- Слияние каналов, зайдя в меню Image и выберите Цвет, Объединить каналы.
- Растениеводство ROI содержащий фагоцитов из объединенный файл (это делает поверхность рендеринга быстрее, см. шаг 5).
- Нарисуйте рамку вокруг рентабельности использования прямоугольное выбора в панели инструментов.
- Перейдите в меню Image и выберите Обрезать.
- Снова Сплит каналов (см. шаг 4.2).
- Сохранить каждый канал как отдельный файл TIFF.
5. Подготовка изображения для количественнойв Imaris
- Открытые Imaris и убедитесь, что значок громкости выбран в левом верхнем меню (рис. 2).
- Открыть первый канал обрезанного изображения (любой из каналов может быть открыт первый, просто быть последовательным).
- Добавить другой канал (ы). Перейдите в меню Правка выберите пункт Добавить каналов и выберите следующий канал в файле. (Повторите этот шаг для оставшихся каналов). Примечание: Чтобы изменить цвет, перейдите в окно настройки дисплея и нажмите на название канала (рис. 3А). После этого появится диалоговое окно для настройки цвета. Если окно настройки дисплея не видно, перейдите в меню Правка и выберите пункт Настройка дисплея.
- Отрегулируйте значения пикселов. Перейдите в меню Правка и выберите пункт Свойства изображения. В этом окне, отрегулируйте х, у, и значения г пиксельные (Эти значения зависят от микроскопа, объективной, камера, и г-поэтапного приобретения и могут быть найдены в программном обеспечении, используемом для сбора данных изображения).
- Шаг 5.5 приведет к оченьнебольшое изображение. Для восстановления исходного размера щелкните на Fit иконке в нижнем правом углу (рис. 2).
- В окне Настройка дисплея, настроить яркость и контрастность для каждого канала с помощью левой и средней треугольники.
6. 3 х мерные (3D) Поверхность Оказание фагоцитов
- В верхней панели инструментов, убедитесь, что режим Surpass выбран (рис. 3в).
- В окне Настройка дисплея, снимите все каналы, кроме фагоцитов канала. Это удалит их из поля зрения.
- Нажмите на значок поверхности визуализации (рис. 2).
- Создать окно будет отображаться в левом нижнем углу (рис. 4А), убедитесь, что сегмент ROI снят в этом первом окне. Нажмите синюю кнопку вперед на дне.
- Отрегулируйте сглаживание.
- В следующем окне выберите фагоцитов канал из выпадающего меню (рис. 4В). Регулируетколичество деталей, которые будут поверхность и должна быть определена эмпирически (0,1 мкм сглаживание обычно используется для микроглии).
- Выберите Absolute пороговой.
- Нажмите на синюю кнопку вперед на дне.
- Порог изображение.
- Нажмите на гистограмме и перетащите, пока изображение не всплыли соответствующим (рис. 4С). Это определяется эмпирически путем поворота изображения для обеспечения серые поверхности наложены на флуоресцентное изображение точное представление поверхность. Примечания: Чтобы повернуть, выберите Навигация в меню Pointer в правом верхнем углу экрана (рис. 3В), нажмите и удерживайте изображение для поворота. Для возврата изображения к исходной ориентации, выберите Происхождение внизу слева в меню Вид.
- Нажмите на синюю кнопку вперед на дне.
- В следующем окне, есть возможность отфильтровать любые поверхности от размера и т.д. Если изображение не очень шумно, не фильтровать и удалятьу фильтры, которые автоматически отображаются на экране. Нажмите на зеленую стрелку в нижней закончить поверхность оказания фагоцитов. Новый набор вкладок появится (рис. 5)
- При необходимости, удалить все поверхности, которые не являются частью фагоцита интересов.
- Убедитесь, что для параметра Выбрать выбирается в меню Pointer (рис. 3В).
- Нажмите на любой поверхности, который нужно удалить, чтобы он становится желтым. Для удаления нескольких поверхностей, нажмите на поверхностях, удерживая нажатой кнопку управления.
- Нажмите кнопку Удалить на вкладке Карандаш.
- Выберите и слейте все поверхности фагоцитов в одной поверхности.
- Кликните на закрома (т.е. закладке Фильтр; Рисунок 5C).
- Нажмите кнопку Добавить.
- Выберите любой фильтр, перетащите гистограмму в крайнее левое положение (все поверхности должны быть желтого цвета).
- Вернитесь на вкладку Карандаш и нажмите Unify.
- Перейдите на вкладку Graph (рис. 5А (рис. 5D). Для отображения нескольких параметров, перейдите на значок гаечного ключа в левом нижнем углу (рис. 2) и выберите параметры для записи.
- Запишите объем фагоцита и сохраните файл перед тем как продолжить.
7. 3D поверхности Оказание охватившего Материал
- Создать новый канал для материала, который был охвачен фагоцита.
- Если выбран поверхности фагоцитов, нажмите на вкладку карандашом.
- Нажмите Маска Все.
- В диалоге, который появляется, выберите канал, соответствующий охватившего материала (например, антероградная розыска пресинаптических входов; Рисунок 5В).
- Проверьте дубликат канала перед нанесением маски и нажмите кнопку ОК.
- Новый канал появится в окне Настройка дисплея, который содержит только материал, который был охвачен и находится внутрифагоцитов.
- Поверхность оказывать канал, содержащий общую охвачен и nonengulfed материал.
- Снимите все каналы в окне Настройка дисплея для канала, который необходимо всплыли исключением и снимите поверхность, созданную для фагоцитов.
- Нажмите на иконку рендеринга поверхности снова (см. шаг 6.3) и создать поверхность для канала с помощью те же действия, описанные для фагоцитов (шаги 6.4-6.11). Примечания: Обязательно выберите правильный канал до сглаживания и определение порога (этап 6,5; Рисунок 4б). Запишите порогового значения (см. шаг 6.6; Рисунок 4C). Это значение также может быть получена после оказания поверхности завершена (вкладка Жезл; 5А).
- Запишите объем общего охватившего и не охватившего материала и сохраните файл перед тем как продолжить.
- Поверхность оказать охватившего материал (материал в фагоцитов).
- Визуализация флуоресценцию тольконовый канал охватившего материала (см. шаг 7.2.1).
- Выполните те же действия, что и выше (шаги 7,2-7,3). Примечания: Не забудьте выбрать правильный канал из раскрывающемся меню до сглаживания (выбрать новый канал, созданный на шаге 7.1). В порогового окна, вручную ввести пороговое значение, которое было установлено на оказание общее охватившего и не охвачен материал (см. шаг 7.2.2).
- Запишите объем охватившего материала и сохранить файл, прежде чем продолжить.
8. Рассчитать общий объем поля зрения
- Создать новую поверхность для любого канала.
- В окне выбора порога (этап 6.6), сдвиньте гистограмму всю дорогу влево так, чтобы вся поле всплыли.
- Закончить наплавки все поле и регистрируют объем (шаги 6.7-6.11).
- Сохраните файл.
9. Подсчитать количество фагоцитированы Материал
- Рассчитайте плотностьОбщая охвачен и не охвачен материал канал, используя следующий алгоритм:
Объем Total охвачен и Non-охватившего материала (шаг 7.3) / Объем поле (этап 8). - Рассчитать% полном охвате на ячейку, используя следующий алгоритм:
(Объем охватившего материала (шаг 7.5) / Общий объем фагоцитов (шаг 6.11)) х 100
Примечания: Для учета изменений в размерах клеток, данные нормализуются к общему объему фагоцитов. Если цифры от шага 9.1, крайне непостоянны по полям, это может быть необходимо для нормализации данных, начиная с шага 9.2 с расчетом в 9,1.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
В последнее время мы использовали этот охвате анализа визуализировать и количественно микроглии-опосредованной полном охвате пресинаптических входов в развивающихся retinogeniculate системы (рис. 1) 7. РСК из CX3CR1-EGFP гетерозиготных мышей anterogradely проследить с CTB-594 и CTB-647 в левого и правого глаза соответственно. После этого трассировки, EGFP-положительные микроглии в пределах dLGN были обследованы. Эти изображения были впоследствии поверхности оказанные для измерения объема.
Используя эту технику, мы обнаружили, что в пиковый период развития синаптической ремоделирования в рамках dLGN (P5), пресинаптические входы охвачен микроглии (рис. 6). Каких-то 4 дня спустя, когда большое количество ремоделирования является почти полное (П9), есть резкое сокращение в размере охвативших входов. Кроме того, охвате и обрезка нарушается у мышей, дефицитных по белков, принадлежащих к классической каскада комплемента(Рис. 6), а также следующие манипуляции нейронов обжига (данные не показаны) 7.
Рисунок 1. Стратегии для оценки микроглии-опосредованной полном охвате РГК пресинаптических входов 7.) Схема антероградной стратегии трассировки. Левого и правого глаза RGC входы прослеживаются с CTB-647 (синий) и CTB-594 (красный), соответственно. Микроглия опосредованного (зеленый) охвате входов впоследствии оцениваться. B) представитель низкой кратности образ послеродовой день 5 (Р5) мышь dLGN следующие антероградной отслеживания левой (синий) и справа (красный) глаз входы. Шкала бар = 100 мкм. Ки) микроглии (EGFP, зеленый), отобранных из пограничной области левого (синий) и правый (красный) глаз входы (вставка в B). CII) CIII) Поверхность рендеринга микроглии и охвачен входы РГК. Приращения линии сетки = 5 мкм. Ди) представитель микроглии (зеленый, EGFP) от P5 dLGN. Входы RGC помечены CTB-594 (красный) и лизосом помечены с анти-CD68 (синий). Dii) Все CTB флуоресценции вне объема микроглии был удален выявления охвачен РГК входы (красный) и лизосом (синие) в микроглии . (зеленый) Diii) Большинство входов RGC (красный) полностью локализованы в пределах CD68-положительных лизосом (голубыми, белые стрелки) Див-V) CD68 (Див) и СТВ (DV) каналов в одиночку.. Шкала бар = 10 мкм. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть увеличенную версию этой фигуры.
Рисунок 2. Программное обеспечение иконки Imaris.
Рисунок 3. Общие навигационные окна в программном обеспечении. А) Окно настройки дисплея. Б) Указатель Окно. Выбор позволит выбор конкретных поверхностей. Перейдите позволит вращение изображения в поле зрения. C) Необходимо находиться в режиме Surpass для поверхностного рендеринга громкости.
Рисунок 4. Оказание поверхности в программном обеспечении.) Создать окно. Б) ГладкийING окно. Выберите канал на поверхность из выпадающего меню (выделено желтым цветом). C) порога поверхность, чтобы флуоресцентного изображения. Выделено красной коробке является пороговым значением, которые должны быть записаны на общую охватившего и не охватившего материала. Это число будет применяться позже порога и поверхности охватившего материал. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть увеличенную версию этой фигуры.
Рисунок 5. Получение измерения громкости в программном обеспечении. A) Вкладки, которые появляются следующую визуализацию поверхности. Обратите внимание на Wand, карандаш, воронку и график вкладки, которые определены в тексте. B) Маска все функции для визуализации охватившего материала в фагоцитов. Обратите внимание на выбранный канал (выLlow окне). C) Функция на вкладке Воронка / фильтр позволяет выбрать всех поверхностей в области, сдвинув Гистограмма всю дорогу слева, чтобы он отображался желтый. Любой фильтр можно выбрать для этого. D) На вкладке Graph, измерение объема могут быть получены и записаны. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть увеличенную версию этой фигуры.
Рисунок 6. Представительства данных 7.) Представитель поверхность оказанные микроглии с С-5 (флуоресцентное изображение показано на рисунке 1), П9, и P30 мыши dLGN. Увеличенные вставки обозначены черной пунктирной линией.Приращения линии сетки = 5 мкм. Б) охвате входов РГК значительно увеличивается во время пика обрезки в dLGN (P5) по сравнению с более старшем возрасте (Р9 и Р30). * Р <0,001 по одну сторону ANOVA, п = 3 мыши / возраст. C) Микроглия от мышей, дефицитных по комплемента рецептора 3 (KO, черная полоса) поглотить значительно меньшее количество входов РГК по сравнению с WT помета (белый бар). Все данные нормализованы к контрольных значений мас. * P <0,04 по т-тест Стьюдента, п = 3 мыши / генотип. Все Столбики ошибок обозначают семафор Нажмите здесь, чтобы посмотреть увеличенное изображение.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Для того, чтобы точно измерить фагоцитоз, охвачен материал должен быть помечены таким образом, что исследователь может визуализировать один раз деградация лизосомальных произошло. Кроме того, высокое разрешение изображений требуется, с последующим использованием программного обеспечения, которое позволит исследователю для визуализации объема всей клетки и количественно его содержимое. В этом протоколе, мы описываем высоконадежный и количественный метод измерения фагоцитов опосредованного полном охвате помощью CTB, конъюгированного с Alexa красителей для обозначения охватившего материал в сочетании с высоким разрешением конфокальной микроскопии и 3D-реконструкции. Эта методология была использована в нашей лаборатории успешно анализировать микроглии опосредованной-полном охвате пресинаптических входов, проходящих синаптическую ремоделирования в развивающихся мозга мыши (система retinogeniculate) 7. Кроме того, он доказал, что высокочувствительным методом, который может отличить тонкие изменения в охвате всей разных возрастов развития недеформированнойг непатологические условия и между дикого типа и мышей с. С незначительными изменениями, этот протокол может быть адаптирован для изучения полном охвате в живых тканей с помощью томографии промежуток времени. Кроме того, этот протокол может быть применен для исследования фагоцитов-взаимодействий в нейронных заболеваний.
Предостережения
Одним из наиболее полезных аспектов данного анализа является возможность маркировать нейронные проекции таким образом, что они остаются видимыми после ввода пути деградации лизосомами. Однако, поскольку нейрон имеет метку, это может быть трудно отличить то, что часть ячейки был фагоцитированы. Это требует очень тщательного регионального анализа (например, синаптической область в сравнении с не-синаптической области dLGN) в сочетании с электронной микроскопии 7. Кроме того, это может оказаться более трудным, и в других областях мозга, где проживают нейронные органы и прогнозы клеток в том же районе. Тем не менее, могут быть использованы альтернативные стратегии маркировки (см. белой). Кроме того, из-за пределов разрешающей способностью световой микроскопии, существует возможность того, что можно переоценить количество охвачен материала. В результате, необходимо соблюдать осторожность, чтобы подтвердить, что охвачен материал в лизосомы. По этой причине, мы используем против CD68 маркировать лизосом в микроглии, 3D-рендеринга и ортогональных вид для проверки параметров анализа.
Типы Сотовые
В дополнение к микроглии, эта методология может также применяться для анализа роли других фагоцитов в мозге (например, астроциты) и в периферической нервной и иммунной систем (например, perisynaptic клетки Шванн, макрофаги и др.). Кроме того, поскольку CTB конъюгирован с Alexa красителей так легко поглощается большинстве клеток, аналогичную стратегию маркировка может использоваться для обозначения материала, охвачен по всему мозгу и других систем органов.
Маркировка охватившего Материал
В качестве альтернативой CTB, конъюгированного с Alexa красителей, мы использовали следующие стратегии для обозначения охватившего материал 7: 1) Люминесцентные репортер мышей, у которых РГК были помечены флуоресцентным белком (например, tdTomato, EGFP и т.д.). 2) Антероградная маркировка с красителем pHrodo конъюгированного с декстран, краситель, что только флуоресцирует, когда он будет в лизосом. Используя эти различные стратегии, визуализация и количественное определение охвативших пресинаптических входов в пределах микроглии может быть performedwith тех же изображений и количественного методов. Однако конъюгаты краситель Alexa наиболее надежными вследствие высокой стойкости Alexa красителя лизосомальных гидролаз 7,21. Кроме того, маркировка охватившего материала с антителами (например, анти-VGlut2, пресинаптического везикулярного белка) была предпринята попытка. Тем не менее, это относительно ненадежный метод обнаружения учитывая, что большинство белков быстро разрушается один раз в лизосомах. Трудно отличить низкий флуоресценции должноек деградации белков над фоном.
Животные, используемые
В текущем протоколе, микроглия флуоресцентно меченных генетически использованием флуоресцентных репортер мышей (CX3CR1-EGFP) 22. Однако, есть случаи, когда маркировка антитела против генетической экспрессии люминесцентных репортер конструкций необходимо. Например, когда люминесцентные репортер мышей не доступны для фагоцитов интереса, использование крыс необходимо, или исследователь хочет смотреть на мышей с не пересекая их в флуоресцентного репортера мыши линии. Для случаях, подобных этим, фагоциты могут быть помечены с помощью иммуногистохимии и данные сопоставимы с результатами экспериментов с использованием люминесцентных репортер мышей 7. После ткани срезов, мы обычно используют стандартный протокол Иммуноокрашивание для плавающих разделах 7. Важно выбрать антителе, выработанном против белка, который будет маркировать всю клетку иее процессы. Например, чтобы микроглии этикеток, анти-Iba1 могут быть использованы.
Более широкие применения: Живая съемка и болезни
Хотя этот протокол основан на анализе фиксированной ткани, небольшие модификации позволит тот же анализ в изображений, полученных с живого изображения. После сессии изображений промежуток времени, последующие Z-стеки могут быть обработаны идентичны шагам 4-9 в этом протоколе. Кроме того, в то время как мы применили этот протокол для визуализации полном охвате синапсов во время развития синаптической ремоделирования в здоровой нервной системы, этот протокол также может быть применен в моделях болезни. В частности, этот протокол может быть использован для изучения заболеваний, в которых синапсы претерпевают существенную реконструкцию, например, в случае потери синапсов и регенерации следующие повреждения спинного мозга, ранней потере синапсов, связанных с болезнью Альцгеймера и т.д. 12,14-19,23 - 26. Кроме того, можно также адаптировать эту методику для изучения заболеваний, при которых Phagocytosis из материала, отличного от синапсов была описана, например, микроглии / макрофагов опосредованного охвате миелина в демиелинизирующих заболеваний (например, рассеянного склероза) и охвате бета-амилоида в болезни Альцгеймера 5,6,27-29.
В заключение о продолжительности пребывания анализа, описанного здесь предлагает удобный, воспроизводимый и чувствительный метод для изучения фагоцитарной взаимодействия с их внеклеточной среде. Важно отметить, что этот анализ имеет широкий спектр применения и возможностей, которые будут обслуживать нейронауки сообщество, а также тех, кто работает в других органах и системах.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Нет конфликта интересов объявлены.
Acknowledgments
Работа выполнена при поддержке грантов от Smith Family Foundation (BS), Дана фонда (BS), Джон Merck Ученые программы (BS), NINDS (РВЫХ1-NS-07100801; BS), НРСА (F32-NS-066 698; DPS), Нэнси Лурье Marks Foundation (ДПС), NIH (P30-HD-18655; MRDDRC изображений фаза).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Heat pad | Vet Equip, Inc. | 965500 | |
| Warm water source for heat pad | Kent Scientific | TP-700 | |
| Stereo microscope | DSC Optical | Zeiss Opmi -6 Surgical Microscope | |
| Sliding microtome with freezing stage | Leica | SM2010 R | |
| Microtome blade | Leica | 14021607100 | |
| Fluorescent dissecting microscope | Nikon | SMZ800 with Epi-fluorescence attachment | |
| Spinning disk confocal microscope | Perkin Elmer | UltraView Vox Spinning Disk Confocal | |
| 10 µl Hamilton gas tight syringes | Hamilton | 80030 | Use a different syringe for each color dye/tracer |
| Hamilton needles | Hamilton | 7803-05, specifications: blunt, 1.5" | |
| Alexa-conjugated cholera toxin β subunit (CTB) | Invitrogen | 488: C22841 | Reconstitute in sterile saline, 80 µl (488), 100 µl (594), 20 µl (647) |
| 594: C22842 | |||
| 647: C34778 | |||
| Phosphate Buffered Saline (PBS) | Sigma | P4417-50TAB | |
| Neomycin and Polymyxin B Sulfates and Bacitracin Zinc Ophthalmic Ointment USP (antibiotic ointment) | Bausch & Lomb | 24208-780-55 | |
| 30.5 G needle | Becton Dickinson | 305106 | |
| Spring scissors | Roboz | RS-5630 | |
| Cotton-tipped applicator | Fisher | 23-400-125 | |
| Paraformaldeyde (PFA) | Electron Microscopy Sciences | 15710 | Dilute 16% to 4% in PBS. Paraformaldehye is toxic, use in a fume hood and wear personal protective equipment. |
| Dissection tools – scissors, forceps, spatula | Small scissors: Fine Science Tools | Small scissors:14370-22 | |
| Large scissors: Roboz | Large scissors: RS-6820 | ||
| #55 forceps: Fine Science Tools | #55 forceps: 11255-20 | ||
| Spatula: Ted Pella, Inc. | Spatula: 13504 | ||
| Sucrose | Sigma | S8501-5KG | Make 30% sucrose in PBS (weight/vol) |
| OCT Compound | VWR | 25608-930 | |
| Weigh boat | USA Scientific | 2347-1426 | |
| 24-well plates | BD Biosciences | 353047 | |
| Sodium phosphate monobasic | Sigma | S6566-500G | Make 0.2 M sodium phosphate monobasic (PB-A) in ddH2O and 0.2 M sodium phosphate dibasic (PB-B) in ddH2O. To make 0.1 M PB, combine 19 ml PB-A and 81 ml PB-B, fill to 200 ml with ddH2O |
| Sodium phosphate dibasic | Sigma | S5136-500G | |
| Coverslips, 22 X 50 mm, No. 1.5 | VWR | 48393 194 | |
| Charged microscope slide | VWR | 48311-703 | |
| Vectasheild | Vector Laboratories | H-1200 |
References
- Ransohoff, R. M., Perry, V. H. Microglial physiology: unique stimuli, specialized responses. Annu Rev Immunol. 27, 119-145 (2009).
- Aguzzi, A., et al. Microglia: scapegoat, saboteur, or something else. Science. 339 (6116), 156-161 (2013).
- Tremblay, M. E., et al. The role of microglia in the healthy brain. J Neurosci. 31 (45), 16064-16069 (2011).
- Hanisch, U. K., Kettenmann, H. Microglia: active sensor and versatile effector cells in the normal and pathologic brain. Nat. Neurosci. 10 (11), 1387-1394 (2007).
- Sierra, A., et al. Janus-faced microglia: beneficial and detrimental consequences of microglial phagocytosis. Front Cell Neurosci. 7, (2013).
- Dheen, S. T., et al. Microglial activation and its implications in the brain diseases. Curr Med Chem. 14 (11), 1189-1197 (2007).
- Schafer, D. P., et al. Microglia sculpt postnatal neural circuits in an activity and complement-dependent manner. Neuron. 74 (4), 691-705 (2012).
- Katz, L., Shatz, C. Synaptic activity and the constuction of cortical circuits. Science. 274 (5290), 1133-1138 (1996).
- Sanes, J. R., Lichtman, J. W. Development of the vertebrate neuromuscular junction. Annu Rev Neurosci. 22, 389-442 (1999).
- Hua, J. Y., Smith, S. J. Neural activity and the dynamics of central nervous system development. Nat Neurosci. 7 (4), 327-332 (2004).
- Holtmaat, A., Svoboda, K. Experience-dependent structural synaptic plasticity in the mammalian brain. Nat Rev Neurosci. 10 (9), 647-658 (2009).
- Butz, M., et al. Activity-dependent structural plasticity. Brain Res Rev. 60 (2), 287-305 (2009).
- Bruel-Jungerman, E., et al. Brain plasticity mechanisms and memory: a party of four. Neuroscientist. 13 (5), 492-505 (2007).
- Schafer, D. P., Stevens, B. Synapse elimination during development and disease: immune molecules take centre stage. Biochem Soc Trans. 38 (2), 476-481 (2010).
- Alexander, A., et al. The complement system: an unexpected role in synaptic pruning during development and disease. Annu Rev Neurosci. 35, 369-389 (2012).
- Brown, A., Weaver, L. C. The dark side of neuroplasticity. Exp Neurol. 235 (1), 133-141 (2012).
- Navarro, X. Chapter 27: Neural plasticity after nerve injury and regeneration. Int Rev Neurobiol. 87, 483-505 (2009).
- Tan, A. M., Waxman, S. G. Spinal cord injury, dendritic spine remodeling, and spinal memory mechanisms. Exp Neurol. 235 (1), 142-151 (2012).
- Wolpaw, J. R., Tennissen, A. M. Activity-dependent spinal cord plasticity in health and disease. Annu Rev Neurosci. 24, 807-843 (2001).
- Schafer, D. P., et al. The "quad-partite" synapse: Microglia-synapse interactions in the developing and mature CNS. Glia. 61 (1), 24-36 (2013).
- Mukhopadhyay, S., et al. Manganese-induced trafficking and turnover of the cis-Golgi glycoprotein GPP130. Mol Biol Cell. 21 (7), 1282-1292 (2010).
- Jung, S., et al. Analysis of fractalkine receptor CX(3)CR1 function by targeted deletion and green fluorescent protein reporter gene insertion. Mol Cell Biol. 20, 4106-4114 (2000).
- Knobloch, M., Mansuy, I. M. Dendritic spine loss and synaptic alterations in Alzheimer's disease. Mol Neurobiol. 37 (1), 73-82 (2008).
- Masliah, E., et al. Synaptic remodeling during aging and in Alzheimer's disease. J Alzheimers Dis. 9 (3 Suppl), 91-99 (2006).
- Yoshiyama, Y., et al. Synapse loss and microglial activation precede tangles in a P301S tauopathy mouse model. Neuron. 53 (3), 337-351 (1016).
- Milnerwood, A. J., Raymond, L. A. Early synaptic pathophysiology in neurodegeneration: insights from Huntington's disease. Trends Neurosci. 33 (11), 513-523 (2010).
- Noda, M., Suzumura, A. Sweepers in the CNS: Microglial Migration and Phagocytosis in the Alzheimer Disease Pathogenesis. Int J Alzheimers Dis. , (2012).
- Rotshenker, S. Microglia and macrophage activation and the regulation of complement-receptor-3 (CR3/MAC-1)-mediated myelin phagocytosis in injury and disease. J Mol Neurosci. 21 (1), 65-72 (2003).
- Smith, M. E. Phagocytosis of myelin in demyelinative disease: a review. Neurochem Res. 24 (2), 261-268 (1999).
