Summary
Mikroglia er de bosiddende immunceller i centralnervesystemet (CNS) med en høj evne til at fagocytere eller opsluge materiale i deres ekstracellulære miljø. Her er et bredt anvendelig, pålidelig og yderst kvantitativ analyse til at visualisere og måle microglia-medieret engulfment af synaptiske komponenter beskrevet.
Abstract
Fagocytose er en proces, hvor en celle opsluger materiale (hele cellen, dele af en celle, snavs, etc.) i dens omgivende ekstracellulære miljø og efterfølgende fordøjer dette materiale, almindeligvis gennem lysosomal nedbrydning. Mikroglia er de bosiddende immunceller i det centrale nervesystem (CNS), hvis fagocytotisk funktion er blevet beskrevet i en bred vifte af betingelser fra neurodegenerativ sygdom (fx beta-amyloid clearance i Alzheimers sygdom) til udvikling af sund hjerne (f.eks synaptisk beskæring) 1-6. Følgende protokol er en engulfment assay udviklet til at visualisere og kvantificere microglia-medieret engulfment af præsynaptiske input i udviklingslandene mus retinogeniculate systemet 7. Mens dette assay blev anvendt til at vurdere mikroglia funktion i denne sammenhæng, kan en tilsvarende fremgangsmåde anvendes til at vurdere andre fagocytter i hele hjernen (fx astrocytter) og resten af kroppen(fx perifere makrofager) samt andre sammenhænge, hvor synaptisk remodellering opstår (f.eks hjerneskade / sygdom).
Introduction
Synaptiske kredsløb remodel gennem hele livet af et dyr. I hjernens udvikling, synapser dannes i overskud og skal gennemgå synaptisk beskæring, som indebærer selektiv fjernelse af en delmængde af synapser og opretholdelse og styrkelse af disse synapser der forbliver 8-10. Denne proces er nødvendig for at opnå den præcise tilslutningsmuligheder karakteristisk for voksne nervesystem. I den voksne kan synapser også være plast, især i forbindelse med indlæring og hukommelse. De strukturelle korrelater denne plasticitet menes at omfatte tilsætning og / eller fjernelse af dendritiske Torner og præsynaptiske boutons 11-13. Ud over disse roller i sundt nervesystem er synaptisk remodeling også involveret i nervesystem / tilskadekomst 12,14,15. For eksempel, efter rygmarvsskade, overskårne axoner skal derefter omforme og danne nye synapser at opnå funktionel genopretning 16-19.
nt "> Emerging som et vigtigt aspekt af synaptisk plasticitet er processen med fagocytose eller engulfment af synapser bestemt til fjernelse 3,5,20. Vi har for nylig viste dette fænomen i forbindelse med synaptisk beskæring i den sunde, postnatal mus hjerne 7. Specifikt , mikroglia, de bosiddende CNS immunceller og fagocytter, viste sig at opsluge præsynaptiske input i løbet af en periode med spidsbelastning og i en region i udviklingsmæssig synaptisk beskæring, den postnatale dorsale laterale geniculate kerne (dLGN) i thalamus. genetisk eller farmakologisk blokade af denne engulfment resulterede i vedvarende underskud i synaptisk forbindelse.I denne protokol, beskriver vi en pålidelig og yderst kvantitativ analyse for at måle phagocyt-medieret engulfment af præsynaptiske indgange. Ved anvendelsen af denne artikel, vil denne analyse blive præsenteret i forbindelse med den udvikling retinogeniculate system, som omfatter retina-ganglieceller (rGCS) med bopæl i nethinden,projicere præsynaptiske input til dLGN (figur 1A). Til at begynde, vil en lysosomal nedbrydning-resistent anterograd mærkning strategi beskrives, hvilket bruges til at visualisere RGC-specifikke præsynaptiske inputs i dLGN (figur 1) 7,21. Efter denne beskrivelse, en detaljeret metode til billedbehandling og kvantitativ måling engulfment hjælp konfokal mikroskopi kombineret med 3-dimensionel (3D) overflade volumen rendering vil blive givet. Denne metode er baseret på fast forberedelse væv, men kan også være tilpasset til brug i levende billeddiagnostiske undersøgelser. Vigtigere er det, mens assay er blevet valideret i forbindelse med den sunde, postnatal retinogeniculate system, kan man anvende de samme teknikker til at vurdere andre fagocyt-neuron interaktioner i hele hjernen, og under sygdom samt fagocyt funktion i andre organsystemer.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1.. Anterograd Mærkning af RGC Præsynaptiske indgange
Bemærk: Alle eksperimenter involverer brug af dyr blev gennemgået og overvåget af den institutionelle Dyrepleje og brug udvalg (IACUC) i overensstemmelse med alle NIH retningslinjer.
- Sterilisere felt og instrumenter.
- Bedøver mus med 4 vol% isofluran i en plexiglas induktion kammer (dette vol% isofluran arbejder for neonatalt voksne mus). Overhold mus nøje for at undgå over-bedøve. ADVARSEL: Undgå indånding med en evakuering vakuum røggas.
- Efter 1-3 minutter, (ældre mus vil kræve mindre tid) at sikre et passende niveau af anæstesi opnås ved at klemme halen (ingen reaktion skal overholdes) og observere vejrtrækning (satsen bør være langsom og stabil).
- Placer musen under stereomikroskop på sin side og sted næsekegle levere 3-4 vol% isofluran over snuden (nyfødte <postnatal dag 10 (P10) ~ 4 vol%> P10 ~ 3 vol%).
- Expose senehinden. Til injektion af nyfødte før øjenåbnende, bruge et par små foråret saks til at åbne øjenlåget og trække sig tilbage i huden for at blotlægge senehinden. For ældre mus, bruge fingrene til at trække sig tilbage på huden omkring øjet at eksponere sclera. ADVARSEL: Hos nyfødte, undertiden en anden vinkelret snit på hjørnet af øjet er nødvendig. Vær forsigtig, når skære hjørne af øjenlåget, da der er et blodkar, at hvis skæres, vil bløder overdrevent.
- Brug en steril 30,5 G nål til at punktere et lille hul i siden af øjet ved den linje, hvor senehinden begynder. Vær omhyggelig med at undgå at beskadige linsen ved at indsætte nålen lige langt nok, at den skrå kant går ind i øjet.
- Tillad glaslegemet at flyde ud af hullet, og en steril bomuld applikator til at absorbere væsken.
- Når glaslegemet er stoppet flyder ud af hullet, indsætte en stump nål fastgjort til en Hamilton sprøjte præinstalleret med anterograd sporing farvestofind i hullet. ADVARSEL: Stik nålen langsomt for at undgå at punktere den anden side af øjet eller beskadigelse af linsen.
- Injicer langsomt farvestof i øjet. Typisk er choleratoksin β-underenhed konjugeret til Alexa 594, 647 eller 488 (CTB-594, CTB-647 eller CTB-488, 5-6 pg / pl) til at anterogradely spor RGC indgange. For nyfødte (≤ P10) 1-2 pi er tilstrækkeligt og for mus> P10 ~ 3 pi er tilstrækkelig. Bemærk: Alexa farvestoffer er særligt resistente over for lysosomal nedbrydning
- Lad nålen i hullet i et par sekunder og derefter langsomt fjerne.
- Brug en bomuld applikator til at absorbere overskydende væske og forhindre farvestoffet i at lække ud.
- Anvende en lille mængde af antibiotisk salve til øjet. Hvis øjet kirurgisk blev åbnet forsigtigt flytte øjenlågene sammen.
- Hvis injicere begge øjne, gentages proceduren på det andet øje.
- Efter injektion (r), lad musen under en varmelampe eller på en varmepude, indtil det begynder at komme sig efter AnesthESIA.
- Retur musen til et rent hjem bur og overvåge for at sikre det er helt vågen før han vendte tilbage til kolonien.
2.. Forbered Væv til Imaging
Dette væv forberedelse protokol bruges til reporter mus, hvor de fagocytter er mærket med fluorescerende markører (f.eks CX3CR1-EGFP for microglia). Hvis en journalist linje ikke er tilgængelig, kan investigator immunfarve vævssnit (se Diskussion).
- ~ 24 timer efter injektionen ofre musen og dissekere hjernen.
- Drop fastsætte hjernen i et Falcon-rør fyldt med 4% paraformaldehyd (PFA) natten over ved 4 ° C. ADVARSEL: PFA er giftig. Undgå indånding og eksponering ved hjælp af i et stinkskab eller på en downdraft bord og iført personlige værnemidler. Noter: Fiksering kan være kortere (≥ 4 timer). Hertil kommer, i stedet for drop fastsættelse 4% PFA perfusion kan bruges efterfulgt af en 2-24 timers drop fix. En sammenligning af perfundered for at droppe faste neonatale og voksne hjerner viste ingen forskel i billedkvalitet eller kvantificering.
- Skyl hjernen 3x i phosphatpufret saltvand (PBS).
- Hæld hjernen og PFA i en tom vejer båd.
- Anvend en spatel til at overføre hjernen til en anden veje båd fyldt med PBS.
- Vask hjerne to gange mere i PBS (overførsel hjerne til to mere vejer både fyldt med PBS).
- Overfør hjernen til et Falcon-rør fyldt med en 30% sucrose-opløsning. Lad hjernen saccharose ved 4 ° C, indtil hjernen synker til bunden af røret (24-48 timer).
- Når hjernen synker, forberede hjernen til sektionering. Følgende trin er fremstilling af 40 um flydende sektioner ved hjælp af en glidende mikrotom med en frysning etape (en kryostat kan også anvendes).
- Brug et barberblad til at fjerne dele af hjernen, der ikke er nødvendige (for dLGN fjerne rostralt og caudale dele af hjernen).
- Frys bhind på aluminiumsfolie på tøris. I løbet af denne tid, fryse mikrotom scenen og fylde hver brønd i en plade med 24 brønde med 0,5 ml 0,1 M phosphatpuffer (PB).
- Monter frosne hjerne (det skal vises uigennemsigtig) om indefrysning scenen.
- Påfør en lille mængde af optimal skæring temperatur sammensatte (OLT) på scenen.
- Når OLT begynder at fryse, lægge hjernen i OLT. Den ende af hjernen, der vil blive skåret skal vende opad (f.eks for dLGN, står over for den caudale opad).
- Dæk hjernen og OLT meget finthakket tøris.
- Lad tøris på hjernen / OLT-for ~ 30 sek.
- Brug en stor pensel til at fjerne tøris. Hjernen og oktober bør fryses til scenen.
- Begynd sektionering gennem vævet, indtil regionen af interesse (ROI) er nået.
- Når ROI er nået, skal du bruge en lille pensel til at fjerne sektioner fra bladet og overføre dem til den 24-godt plate indeholdende 0,1 M PB (trin 2.5.2). Hold malerpensel fugtig ved at fugte det i 0,1 M PB, inden du fjerner sektioner fra bladet. Bemærk: Profiler kan efterlades i 0,1 M PB natten over ved 4 ° C.
- Når afsnittene er blevet opsamlet, visualisere anterograd mærkning under en fluorescerende dissektionsmikroskop og vælg sektioner, der indeholder ROI.
- Monter sektioner på et dias med en lille pensel.
- Påfør en lille pulje af 0,1 M PB til et opladet objektglas.
- Overfør vævssnittet til puljen af PB.
- Brug PB og pensel at orientere og sprede vævet.
- Brug en Kimwipe at væge overskydende PB. Vær omhyggelig med at undgå fugtspredende væk sektionen.
- Lad det helt lufttørre.
- Påfør en lille dråbe montering medium til hver sektion og montere et dækglas på toppen (22 x 50 mm, nr. 1.5).
- Seal kanter slide med neglelak og opbevares ved -20 ° C indtil imaging session. Bemærk: Selvom billeddannelse medi en uge til fremstilling tilrådes kan slides holdes ved -20 ° C i flere uger forud for billeddannelse.
3.. Imaging Tissue
Alle billeder er erhvervet på en roterende disk konfokal mikroskop (UltraView Vox spinning disk konfokal mikroskop udstyret med diode lasere (405 nm, 445 nm, 488 nm, 514 nm, 561 nm og 640 nm)). Billeder kan også erhverves på enhver mikroskop med evnen til at tilegne høj opløsning z-stakke (fx laser scanning konfokal mikroskop, epifluorescensmikroskop efterfulgt af deconvolution osv.). Ramme størrelse er typisk 1.000 x 1.000 pixels.
- Find ROI på 10X forstørrelse og erhverve et billede. Til billeddannelse mikroglia i retinogeniculate system, ROI er den mest mediale dLGN sektioner.
- Skift til højere forstørrelse (en 60X Plan Apo målsætning, NA = 1.4, anvendes typisk).
- Anskaf første synsfelt indeholder fagocytter bruge 0,2 um z-trinsek.
- Anskaf flere 15-19 felter, der indeholder fagocytter per dyr.
4.. Forbered billeder til Kvantificering (ImageJ)
- Åbent z-stak i ImageJ.
- Gå til menuen Billede, vælg farve og Split kanaler.
- Fratræk baggrund fra kanal (er) indeholdende opslugt materiale.
- Vælg den kanal vinduet med opslugt materiale (f.eks præsynaptiske indgange).
- Gå til Proces-menuen og vælg Fratræk baggrund. Brug en rullende kugle radius på 10 pixels for anterograd sporing af præsynaptiske input i dLGN. Bemærk: Den rullende kugle radius bestemmes empirisk. Det bør imidlertid generelt være så stor som radius af den største objekt i billedet, som ikke er en del af baggrunden.
- Glat kanal, der indeholder fagocyttens.
- Vælg den kanal vinduet med fagocytten (f.eks microglia).
- Gå til Proces menu og select Filtre, Mean. Brug en gennemsnitlig filter på 1,5 (dette glatter billedet for overfladegengivelse i senere trin).
- Fratræk baggrund fra kanalen med fagocytten.
- Vælg den kanal vinduet med fagocytten (f.eks microglia).
- Gå til Proces-menuen, vælg subtrahere baggrund (indstillinger skal bestemmes empirisk). Brug en rullende kugle radius på 50 pixels for EGFP-positive mikroglia.
- Flet kanaler ved at gå til menuen Billede og vælge farve, Flet kanaler.
- Crop ROI indeholder phagocyt fra fusioneret fil (dette gør overfladegengivelse hurtigere, se trin 5).
- Tegn en kasse rundt om ROI med rektangulære markeringer værktøjet i baren.
- Gå til menuen Billede, og vælg Beskær.
- Split kanaler igen (se trin 4.2).
- Gem hver kanal som sin egen TIFF-fil.
5.. Forbered Billede til kvantificeringi Imaris
- Åbne Imaris og sørg for, at ikonet Volume er valgt i menuen øverst til venstre (Figur 2).
- Åbent første kanal i beskårne billede (nogen af kanalerne kan åbnes først, bare være konsekvent).
- Læg den anden kanal (er). Gå til menuen Rediger, vælge Tilføj kanaler og vælge den næste kanal i filen. (Gentag dette trin for de resterende kanaler). Bemærk: Hvis du vil ændre farve, skal du gå til Skærm Justering og klik på den kanal navn (figur 3A). Dette vil bringe en dialog boks for at justere farven. Hvis displayet Justering vinduet ikke er synligt, skal du gå til menuen Rediger og vælg Display Justering.
- Juster pixelværdier. Gå til menuen Rediger, og vælg Egenskaber for billede. I dette vindue justere x, y og z pixelværdier (Disse værdier afhænger af mikroskopet, objektiv, kamera og z-trin erhvervelse og kan findes i den software, der anvendes til at hente billedet).
- Trin 5.5 vil resultere i en megetlille billede. For at ændre størrelsen, skal du klikke på Tilpas ikon i nederste højre hjørne (Figur 2).
- I Display Justering vinduet, justere lysstyrke og kontrast for hver kanal ved hjælp af venstre og midterste trekanter.
6.. 3-dimensionel (3D) Overflade Gengivelse af fagocytten
- I den øverste værktøjslinie, skal du sørge for at overgå tilstand er valgt (figur 3C).
- I Display Justering vinduet, skal du fjerne markeringen alle kanaler undtagen phagocyt kanal. Dette vil fjerne dem fra synsfeltet.
- Klik overfladegengivelse ikon (figur 2).
- En oprette vindue vil blive vist i nederste venstre (Figur 4A), sørg for Segment ROI er afkrydset i denne første vindue. Klik på den blå frem-knappen nederst.
- Juster udjævning.
- I det næste vindue, skal du vælge fagocytten kanal fra rullemenuen (figur 4B). Dette justerermængden af detaljer, der vil blive dukket og bør bestemmes empirisk (0,1 um udglatning anvendes typisk til microglia).
- Vælg Absolut tærskling.
- Klik på den blå frem-knappen nederst.
- Threshold billedet.
- Klik på histogram og træk, indtil billedet er dukket korrekt (figur 4C). Dette bestemmes empirisk ved at dreje billedet for at sikre, at de grå overflader overlejret på det fluorescerende billede er en nøjagtig overflade repræsentation. Bemærkninger: Hvis du vil rotere vælge Naviger i menuen Pointer på den øverste højre side af skærmen (figur 3B), klik og hold billedet til at rotere. For at vende tilbage billede til den oprindelige orientering, skal du vælge Origin nederste venstre i menuen View.
- Klik på den blå frem-knappen nederst.
- I det næste vindue, der er en mulighed for at bortfiltrere alle overflader af størrelse osv. Medmindre billedet er meget støjende, ikke filtrere og slette eny filtre, der automatisk vises. Klik på den grønne pil nederst til slut overfladegengivelse fagocytten. Et nyt sæt faner vises (figur 5)
- Hvis det er nødvendigt, skal du slette alle overflader, der ikke er en del af phagocyt af interesse.
- Sørg for, at Select er valgt i Pointer menuen (figur 3B).
- Klik på en hvilken som helst overflade, der skal slettes, så den bliver gul. Hvis du vil slette flere flader, skal du klikke på overfladerne, mens du holder kontrolknappen.
- Klik på Slet under fanen Blyant.
- Vælg og fusionere alle overflader fagocytten i én overflade.
- Klik på tragten (dvs. fanen Filter, figur 5C).
- Klik på Tilføj.
- Vælg en filter, skal du trække histogrammet længst til venstre (alle overflader skal være gul).
- Gå tilbage til fanen Blyant og klik Unify.
- Gå til fanen graf (figur 5A (figur 5D). Til visning af flere parametre, gå til ikonet Wrench nederst til venstre (Figur 2), og vælg parametre til at optage.
- Optag volumen fagocyttens og gem filen før du fortsætter.
7.. 3D Surface Gengivelse af opslugte Material
- Opret en ny kanal for materiale, der er blevet opslugt af fagocytten.
- Mens phagocyt overflade er valgt, skal du klikke på fanen blyant.
- Klik Mask All.
- I dialogen, der vises, skal du vælge den kanal, der svarer til opslugt materiale (f.eks, anterograd sporing af præsynaptiske indgange, figur 5B).
- Check eksemplarer kanal, før du anvender maske og tryk på OK.
- En ny kanal vises i display Justering vindue, der kun indeholder materiale, der er blevet opslugt og er inde iphagocyt.
- Surface gøre kanal, der indeholder alt omspændt og nonengulfed materiale.
- Fjern markeringen alle kanaler i display Justering vinduet undtagen for kanalen, der skal dukket og fjern markeringen overfladen skabt til fagocytten.
- Klik på rendering ikon Surface igen (se trin 6.3) og oprette en overflade til kanalen ved hjælp af de samme trin som beskrevet for fagocytten (trin 6,4-6,11). Bemærkninger: Sørg for at vælge den rigtige kanal, før udjævning og tærskling (trin 6.5, figur 4B). Notér tærskelværdien (se trin 6.6, figur 4C). Denne værdi kan også opnås efter overfladegengivelse er fuldstændig (fanen Wand, figur 5A).
- Optag mængden af den samlede opslugt og ikke-opslugt materiale og gemme filen før du fortsætter.
- Overflade render opslugt materiale (materiale inden fagocytten).
- Visualisere fluorescens kunden nye kanal for opslugt materiale (se trin 7.2.1).
- Følg de samme trin som ovenfor (trin 7,2-7,3). Bemærkninger: Vær sikker på at vælge den korrekte kanal fra rullemenuen før udjævning (vælg den nye kanal blev oprettet i trin 7.1). I tærsklen vinduet manuelt indtaste den grænseværdi, der var sat til at gøre den samlede opslugt og ikke-opslugt materiale (se trin 7.2.2).
- Optag lydstyrken for opslugt materiale og gemme filen før du fortsætter.
8.. Beregn den samlede mængde af den Synsfelt
- Opret en ny overflade til enhver kanal.
- I thresholding vindue (trin 6.6), skub histogram hele vejen til venstre, så hele feltet er dukket op.
- Afslut belægning hele området og registrere mængden (trin 6,7-6,11).
- Gem filen.
9.. Beregne mængden af fagocyteret Material
- Beregn massefylden aftotal opslugt og ikke-opslugt materiale kanal ved hjælp af følgende algoritme:
Volumen af alt omspændt og Non-opslugt Materiale (trin 7.3) / Volumen af Field (trin 8). - Beregn% omspændes per celle ved hjælp af følgende algoritme:
(Volumen af opslugt Materiale (trin 7.5) / Samlet volumen af fagocytten (trin 6.11)) x 100
Bemærkninger: For at tage højde for variationer i cellestørrelse, er data normaliseret til den samlede mængde af fagocytten. Hvis tal fra trin 9.1 er meget varierende på tværs af felter, kan det være nødvendigt at normalisere dataene fra trin 9,2 til beregningen 9.1.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
For nylig har vi brugt denne engulfment assay til at visualisere og kvantificere microglia-medieret engulfment af præsynaptiske input i udviklingslandene retinogeniculate (figur 1) 7. RGCS fra CX3CR1-EGFP heterozygote mus blev anterogradely spores med CTB-594 og CTB-647 i det venstre og højre øje, hhv. Efter denne sporing blev EGFP-positive mikroglia i dLGN afbildet. Disse billeder blev efterfølgende overflade-renderet for volumen målinger.
Ved at bruge denne teknik, fandt vi, at i løbet af en peak periode af udviklingsmæssige synaptisk remodellering i dLGN (P5), er præsynaptiske indgange opslugt af mikroglia (Figur 6). Så få som 4 dage senere, da en stor mængde af ombygningen er næsten færdig (P9), der er en dramatisk reduktion i mængden af opslugte indgange. Desuden er engulfment og beskæring afbrydes i mus, der mangler proteiner tilhørende den klassiske komplementkaskade(Figur 6) samt efter manipulation af neuronfyring (data ikke vist) 7..
Figur 1.. Strategi for at vurdere microglia-medieret engulfment af RGC præsynaptiske indgange 7. A) Skematisk af anterograd sporing strategi. Venstre og højre øje RGC indgange spores med CTB-647 (blå) og CTB-594 (rød), hhv. Mikroglia-medieret (grøn) engulfment af input er efterfølgende vurderet. B) En repræsentant lav forstørrelse billede af postnatal dag 5 (P5) mus dLGN efter anterograd sporing af venstre (blå) og til højre (rød) øjne indgange. Skala bar = 100 um. Ci) A microglia (EGFP, grøn) samplet fra grænseregionen i venstre (blå) og højre (rød) øjne indgange (indsat i B). CII) CIII) overfladegengivelse af microglia og opslugte RGC indgange. Intervaller Grid line = 5 um. Di) En repræsentant microglia (grøn, EGFP) fra P5 dLGN. RGC indgange mærket med CTB-594 (rød) og lysosomer er mærket med anti-CD68 (blå). Dii) Alle CTB fluorescens udenfor microglia volumen er blevet fjernet afslører opslugt RGC indgange (rød) og lysosomer (blå) inden for microglia . (grøn) DIII) Flest RGC indgange (rød) er fuldstændigt lokaliseret i CD68-positive lysosomer (blå, hvide pile) Div-v) CD68 (Div) og CTB (DV) kanaler alene.. Skala bar = 10 mM. Klik her for at se en større version af dette tal.
Figur 2.. Imaris software ikoner.
Figur 3.. Generelle vinduer navigation i software. A) Justering af display vindue. B) Den Pointer vindue. Vælg vil tillade valg af bestemte overflader. Navigering vil tillade rotation af et billede i synsfeltet. C) Det er nødvendigt at være i overgå tilstand for overfladegengivelse volumen.
Figur 4.. Overfladegengivelse i software. A) Opret vindue. B) Glatning vindue. Vælg den kanal, til overfladen fra rullemenuen (markeret med gult). C) tærskling overfladen til fluorescerende billede. Fremhævet af den røde boks er den tærskelværdi, der skal registreres for total opslugt og ikke-opslugt materiale. Dette tal vil blive anvendt senere på tærsklen og overflade den opslugt materiale. Klik her for at se en større version af dette tal.
Figur 5.. Indhentning volumen målinger i software. A) Faner, der vises følgende overfladegengivelse. Bemærk Wand, Blyant, Tragt og Graph faner, der er identificeret i teksten. B) The Mask er alle udstyrede med at visualisere opslugt materiale inden fagocytten. Bemærk den valgte kanal (yellow boks). C) Funktionen under fanen Tragt / filter tillader valg af alle overflader på området ved at skubbe histogrammet hele vejen til venstre, så det ser gult. Ethvert filter kan vælges til dette. D) Under fanen Graph, kan volumen målinger opnås og registreres. Klik her for at se en større version af dette tal.
Fig. 6. Repræsentative oplysninger 7. A) repræsentant overflade-afsmeltet mikroglia fra P5 (fluorescerende billede er vist i figur 1), P9 og P30 mus dLGN. Forstørrede indsatse angivet med en sort stiplet linje.Intervaller Grid line = 5 um. B) engulfment af RGC indgange øges betydeligt under peak beskæring i dLGN (P5) versus ældre aldersgrupper (P9 og P30). * P <0,001 ved envejs ANOVA, n = 3 mus / alder. C) Mikroglia fra mus, der mangler komplement receptor 3 (KO, sort bjælke) opsluge signifikant færre RGC input sammenlignet med WT søskende (hvid søjle). Alle data normaliseres til WT kontrolværdier. * P <0,04 Student t-test, n = 3 mus / genotype. Alle fejlsøjler repræsenterer sem Klik her for at se større billede.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
For nøjagtigt at måle fagocytose skal opslugt materiale skal mærkes på en sådan måde, at forskeren kan visualisere det, når lysosomal nedbrydning har fundet sted. Desuden er høj opløsning nødvendig, efterfulgt af anvendelse af software, der vil gøre det muligt for forskeren at visualisere mængden af hele cellen og kvantificere dets indhold. I denne protokol, beskriver vi en yderst pålidelig og kvantitativ metode til måling phagocyt-medieret engulfment hjælp CTB konjugeret til Alexa farvestoffer til at mærke opslugt materiale kombineret med høj opløsning konfokal mikroskopi og 3D-rekonstruktion. Denne metode har været anvendt i vores laboratorium til succes analysere microglia medieret-engulfment af præsynaptiske indgange gennemgår synaptisk remodellering i udviklingslandene mus hjernen (retinogeniculate-system) 7. Desuden har det vist sig at være en meget følsom teknik, der kan skelne små ændringer i engulfment tværs af forskellige udviklingsmæssige aldre under ikke-patologiske tilstande samt mellem vildtype og knockout-mus. Med mindre justeringer, kan denne protokol tilpasses til at studere engulfment i levende væv ved tidsforskydningen billeddannelse. Derudover kan denne protokol anvendes til at studere phagocyt-neuron interaktioner i sygdommen.
Forbehold
En af de mest nyttige aspekter af dette assay er evnen til at mærke neuronale projektioner på en sådan måde, at de forbliver synlige efter indtastning af et lysosomal nedbrydningsvej. Men fordi neuron er mærket, kan det være vanskeligt at skelne, hvilken del af cellen er blevet fagocyteres. Dette kræver en meget omhyggelig regional analyse (f.eks synaptisk region versus en ikke-synaptiske del af dLGN) kombineret med elektronmikroskopi 7. Desuden kan det vise sig vanskeligere i andre områder af hjernen, hvor nervecellelegemer og fremspring bor i det samme område. Dog kan alternative mærkningsordninger strategier ansat (se below). På grund af de begrænsninger af lysmikroskopi opløsning, er der en mulighed for, at man kan overvurdere omfanget af opslugt materiale. Som et resultat, skal der drages omsorg for at validere, at opslugt materiale er inden lysosomer. Af denne grund, bruger vi anti-CD68 til at mærke lysosomer inden microglia, 3D rendering, og ortogonale at validere parametre analysen.
Celletyper
Ud over mikroglia kan denne metode også anvendes til at analysere betydningen af andre fagocytter i hjernen (fx astrocytter) og i det perifere nervesystem og immunsystemet (f.eks perisynaptic Schwann-celler, makrofager, etc.). Hertil kommer, fordi CTB konjugeret Alexa-farvestoffer er så let optages af de fleste celler, en tilsvarende mærkning strategi kan anvendes til at mærke opslugt materiale i hele hjernen og andre organsystemer.
Mærkning af opslugte Material
Som et alalternativ til CTB konjugeret til Alexa farvestoffer, har vi brugt følgende strategier til at mærke opslugt materiale 7: 1) Fluorescerende reporter mus, hvor rGCS var mærket med et fluorescerende protein (f.eks tdTomato, EGFP osv.). 2) Anterograd mærkning med et pHrodo farvestof konjugeret til dextran, et farvestof, der kun fluorescerer, når det er i en lysosom. Ved hjælp af disse forskellige strategier, kan visualisering og kvantificering af opslugte præsynaptiske inputs inden mikroglia være performedwith samme billedbehandling og kvantificering teknikker. Men Alexa dye konjugater er de mest robuste grund af den høje modstand Alexa farvestof til lysosomal hydrolaser 7,21. Desuden er mærkning af opslugt materiale med antistoffer (fx anti-VGlut2 en præsynaptisk vesikulær protein) blevet forsøgt. Dette er imidlertid en relativt upålidelig påvisningsmetode, eftersom de fleste proteiner hurtigt nedbrydes gang i lysosomer. Det er vanskeligt at skelne lav fluorescens som følge aftil proteinnedbrydning i forhold til baggrund.
Dyr Brugte
I den nuværende protokol, er mikroglia fluorescensmærkes genetisk ved hjælp af fluorescerende reporter mus (CX3CR1-EGFP) 22. Der er imidlertid tilfælde, som er nødvendige antistof mærkning versus genetisk ekspression af fluorescerende reporter-konstruktioner. For eksempel, når fluorescerende reporter mus er ikke tilgængelige for fagocytten af interesse, er nødvendigt at anvende rotter eller forskeren ønsker at se på knockout-mus uden at krydse dem i en fluorescerende reporter mus linje. For tilfælde som disse, kan fagocytter mærkes ved hjælp af immunhistokemi og data er sammenlignelige med resultaterne fra forsøg med fluorescerende reporter mus 7. Efter vævssektionering bruger vi typisk en standard immunfarvning protokol til flydende punkt 7. Det er vigtigt at vælge et antistof rejst mod et protein, der vil mærke hele cellen ogdens processer. For eksempel at mærke mikroglia, anti-Iba1 kan anvendes.
Bredere Applikationer: Live-Imaging og Sygdom
Mens denne protokol er baseret på en analyse af fast væv, vil små ændringer gøre det muligt for samme analyse i billeder, der er erhvervet ved direkte billedvisning. Efter en time lapse imaging session, kan de efterfølgende z-stakke behandles identisk med trin 4-9 i denne protokol. Desuden mens vi har anvendt denne protokol til at visualisere engulfment af synapser i udviklingsmæssig synaptiske ombygning i den sunde CNS, denne protokol kan også anvendes i sygdomsmodeller. Især kan denne protokol anvendes til at undersøge sygdomme, hvor synapser undergår væsentlig ombygning, såsom i tilfælde af synapsen tab og regenerering efter rygmarvsskade, tidlig synapse tab forbundet med Alzheimers sygdom, osv 12,14-19,23 - 26.. Desuden kan man også tilpasse denne teknik til at undersøge sygdomme, hvor phagocytosis af andre materialer end synapser er blevet beskrevet, såsom mikroglia / makrofag-medieret omspændes af myelin i demyeliniserende sygdom (fx dissemineret sklerose), og omslutning af beta-amyloid ved Alzheimers sygdom 5,6,27-29.
Afslutningsvis engulfment assayet beskrevet her giver en bekvem, reproducerbar og følsom teknik til at undersøge fagocyt interaktioner med deres ekstracellulære miljø. Vigtigere er det, denne analyse har en bred vifte af anvendelser og muligheder, der vil tjene neurovidenskab samfund såvel som dem, der arbejder i andre organsystemer.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Ingen interessekonflikter erklæret.
Acknowledgments
Arbejdet blev støttet af tilskud fra Smith Family Foundation (BS), Dana Foundation (BS), John Merck Scholars Program (BS), NINDS (RO1-NS-07.100.801, BS), NRSA (F32-NS-066.698, DPS) Nancy Lurie Marks Foundation (DPS), NIH (P30-HD-18655, MRDDRC Imaging Core).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Heat pad | Vet Equip, Inc. | 965500 | |
| Warm water source for heat pad | Kent Scientific | TP-700 | |
| Stereo microscope | DSC Optical | Zeiss Opmi -6 Surgical Microscope | |
| Sliding microtome with freezing stage | Leica | SM2010 R | |
| Microtome blade | Leica | 14021607100 | |
| Fluorescent dissecting microscope | Nikon | SMZ800 with Epi-fluorescence attachment | |
| Spinning disk confocal microscope | Perkin Elmer | UltraView Vox Spinning Disk Confocal | |
| 10 µl Hamilton gas tight syringes | Hamilton | 80030 | Use a different syringe for each color dye/tracer |
| Hamilton needles | Hamilton | 7803-05, specifications: blunt, 1.5" | |
| Alexa-conjugated cholera toxin β subunit (CTB) | Invitrogen | 488: C22841 | Reconstitute in sterile saline, 80 µl (488), 100 µl (594), 20 µl (647) |
| 594: C22842 | |||
| 647: C34778 | |||
| Phosphate Buffered Saline (PBS) | Sigma | P4417-50TAB | |
| Neomycin and Polymyxin B Sulfates and Bacitracin Zinc Ophthalmic Ointment USP (antibiotic ointment) | Bausch & Lomb | 24208-780-55 | |
| 30.5 G needle | Becton Dickinson | 305106 | |
| Spring scissors | Roboz | RS-5630 | |
| Cotton-tipped applicator | Fisher | 23-400-125 | |
| Paraformaldeyde (PFA) | Electron Microscopy Sciences | 15710 | Dilute 16% to 4% in PBS. Paraformaldehye is toxic, use in a fume hood and wear personal protective equipment. |
| Dissection tools – scissors, forceps, spatula | Small scissors: Fine Science Tools | Small scissors:14370-22 | |
| Large scissors: Roboz | Large scissors: RS-6820 | ||
| #55 forceps: Fine Science Tools | #55 forceps: 11255-20 | ||
| Spatula: Ted Pella, Inc. | Spatula: 13504 | ||
| Sucrose | Sigma | S8501-5KG | Make 30% sucrose in PBS (weight/vol) |
| OCT Compound | VWR | 25608-930 | |
| Weigh boat | USA Scientific | 2347-1426 | |
| 24-well plates | BD Biosciences | 353047 | |
| Sodium phosphate monobasic | Sigma | S6566-500G | Make 0.2 M sodium phosphate monobasic (PB-A) in ddH2O and 0.2 M sodium phosphate dibasic (PB-B) in ddH2O. To make 0.1 M PB, combine 19 ml PB-A and 81 ml PB-B, fill to 200 ml with ddH2O |
| Sodium phosphate dibasic | Sigma | S5136-500G | |
| Coverslips, 22 X 50 mm, No. 1.5 | VWR | 48393 194 | |
| Charged microscope slide | VWR | 48311-703 | |
| Vectasheild | Vector Laboratories | H-1200 |
References
- Ransohoff, R. M., Perry, V. H. Microglial physiology: unique stimuli, specialized responses. Annu Rev Immunol. 27, 119-145 (2009).
- Aguzzi, A., et al. Microglia: scapegoat, saboteur, or something else. Science. 339 (6116), 156-161 (2013).
- Tremblay, M. E., et al. The role of microglia in the healthy brain. J Neurosci. 31 (45), 16064-16069 (2011).
- Hanisch, U. K., Kettenmann, H. Microglia: active sensor and versatile effector cells in the normal and pathologic brain. Nat. Neurosci. 10 (11), 1387-1394 (2007).
- Sierra, A., et al. Janus-faced microglia: beneficial and detrimental consequences of microglial phagocytosis. Front Cell Neurosci. 7, (2013).
- Dheen, S. T., et al. Microglial activation and its implications in the brain diseases. Curr Med Chem. 14 (11), 1189-1197 (2007).
- Schafer, D. P., et al. Microglia sculpt postnatal neural circuits in an activity and complement-dependent manner. Neuron. 74 (4), 691-705 (2012).
- Katz, L., Shatz, C. Synaptic activity and the constuction of cortical circuits. Science. 274 (5290), 1133-1138 (1996).
- Sanes, J. R., Lichtman, J. W. Development of the vertebrate neuromuscular junction. Annu Rev Neurosci. 22, 389-442 (1999).
- Hua, J. Y., Smith, S. J. Neural activity and the dynamics of central nervous system development. Nat Neurosci. 7 (4), 327-332 (2004).
- Holtmaat, A., Svoboda, K. Experience-dependent structural synaptic plasticity in the mammalian brain. Nat Rev Neurosci. 10 (9), 647-658 (2009).
- Butz, M., et al. Activity-dependent structural plasticity. Brain Res Rev. 60 (2), 287-305 (2009).
- Bruel-Jungerman, E., et al. Brain plasticity mechanisms and memory: a party of four. Neuroscientist. 13 (5), 492-505 (2007).
- Schafer, D. P., Stevens, B. Synapse elimination during development and disease: immune molecules take centre stage. Biochem Soc Trans. 38 (2), 476-481 (2010).
- Alexander, A., et al. The complement system: an unexpected role in synaptic pruning during development and disease. Annu Rev Neurosci. 35, 369-389 (2012).
- Brown, A., Weaver, L. C. The dark side of neuroplasticity. Exp Neurol. 235 (1), 133-141 (2012).
- Navarro, X. Chapter 27: Neural plasticity after nerve injury and regeneration. Int Rev Neurobiol. 87, 483-505 (2009).
- Tan, A. M., Waxman, S. G. Spinal cord injury, dendritic spine remodeling, and spinal memory mechanisms. Exp Neurol. 235 (1), 142-151 (2012).
- Wolpaw, J. R., Tennissen, A. M. Activity-dependent spinal cord plasticity in health and disease. Annu Rev Neurosci. 24, 807-843 (2001).
- Schafer, D. P., et al. The "quad-partite" synapse: Microglia-synapse interactions in the developing and mature CNS. Glia. 61 (1), 24-36 (2013).
- Mukhopadhyay, S., et al. Manganese-induced trafficking and turnover of the cis-Golgi glycoprotein GPP130. Mol Biol Cell. 21 (7), 1282-1292 (2010).
- Jung, S., et al. Analysis of fractalkine receptor CX(3)CR1 function by targeted deletion and green fluorescent protein reporter gene insertion. Mol Cell Biol. 20, 4106-4114 (2000).
- Knobloch, M., Mansuy, I. M. Dendritic spine loss and synaptic alterations in Alzheimer's disease. Mol Neurobiol. 37 (1), 73-82 (2008).
- Masliah, E., et al. Synaptic remodeling during aging and in Alzheimer's disease. J Alzheimers Dis. 9 (3 Suppl), 91-99 (2006).
- Yoshiyama, Y., et al. Synapse loss and microglial activation precede tangles in a P301S tauopathy mouse model. Neuron. 53 (3), 337-351 (1016).
- Milnerwood, A. J., Raymond, L. A. Early synaptic pathophysiology in neurodegeneration: insights from Huntington's disease. Trends Neurosci. 33 (11), 513-523 (2010).
- Noda, M., Suzumura, A. Sweepers in the CNS: Microglial Migration and Phagocytosis in the Alzheimer Disease Pathogenesis. Int J Alzheimers Dis. , (2012).
- Rotshenker, S. Microglia and macrophage activation and the regulation of complement-receptor-3 (CR3/MAC-1)-mediated myelin phagocytosis in injury and disease. J Mol Neurosci. 21 (1), 65-72 (2003).
- Smith, M. E. Phagocytosis of myelin in demyelinative disease: a review. Neurochem Res. 24 (2), 261-268 (1999).
