Summary
小膠細胞は、それらの細胞外環境に材料を貪食又は巻き込むための高い能力を有する中枢神経系（CNS）の居住者の免疫細胞である。ここでは、シナプスのコンポーネントのミクログリア媒介貪食を可視化し、測定するために広く適用可能で信頼性が高く、高度に定量的なアッセイが記載されている。
Abstract
食作用は、細胞がその周囲の細胞外環境での材料（全体の細胞、細胞の一部、破片など）を飲み込み、その後、一般的にリソソーム分解を介して、この材料を消化する過程である。ミクログリアは、食細胞機能健康な脳（ 例えば、シナプスの開発に神経変性疾患（アルツハイマー病、例えば 、βアミロイドクリアランス）から条件の広い範囲に記載されている中枢神経系（CNS）の免疫細胞である常駐剪定）1-6。以下のプロトコルを開発し、マウスのretinogeniculateシステム7におけるシナプス前入力のミクログリア媒介貪食を可視化し、定量化するために開発された貪食アッセイである。このアッセイは、この特定の文脈においてミクログリア機能を評価するために使用されたが、同様のアプローチは、脳（ 例えば、星状細胞）、および身体の残りの部分で他の食細胞を評価するために使用され得る（ 例えば 、末梢マクロファージ）だけでなく、シナプスのリモデリングが起こる他のコンテキスト（ 例えば 、脳損傷/疾患）。
Introduction
シナプス回路は、動物の生涯を通じて改造。発達中の脳では、シナプスを過剰に形成し、シナプスのサブセットを選択的に除去し、8月10日のまま、それらのシナプスの維持·強化を伴うシナプス刈り込みを受けなければならない。このプロセスは、成体の神経系の正確な接続の特性を達成するために必要である。成人において、シナプスは、特に学習および記憶の文脈において、プラスチック製とすることができる。この可塑性の構造的な相関を、樹状突起およびシナプス前終末11-13の添加および/ または除去を含むと考えられている。健康的な神経系のこれらの役割に加えて、シナプスのリモデリングにも神経系疾患/傷害12,14,15に関与している。例えば、脊髄損傷後、切断された軸索は、その後、改造や機能回復の16〜19を実現するために新たなシナプスを形成する必要があります。
NTは">シナプス可塑性の重要な側面として浮上して、食作用または削除3,5,20宛てシナプスの飲み込みのプロセスです。我々は最近、健康で、出生後のマウス脳7におけるシナプス刈り込みのコンテキストで、この現象を示した。具体的に、ミクログリア、常駐CNS免疫細胞と食細胞は、ピーク時や発達シナプス刈り込み、視床の出生後の背側外側膝状核（DLGN）の領域において、シナプス前の入力を巻き込むことが示された。この飲み込みの遺伝的または薬理学的遮断シナプス接続の持続的な赤字となりました。このプロトコルでは、シナプス前の入力の食細胞媒介貪食を測定するための信頼性の高い、高度に定量的な分析を説明します。この記事の目的のために、このアッセイは、網膜内に存在することが網膜神経節細胞（RGC）を含む、現像retinogeniculateシステムの文脈で提示されるDLGN（ 図1A）、プロジェクトシナプス前入力。開始するには、リソソーム分解耐性順行性標識戦略はDLGNにおけるRGC特異的シナプス前入力（ 図1）7,21 を可視化するために使用される、説明する。この説明に続いて、画像化および定量3（3D）次元表面ボリュームレンダリングと組み合わせた共焦点顕微鏡を用いて貪食を測定するための詳細な方法論は説明する。この方法論は、固定組織標本に基づいているだけでなく、ライブイメージング研究での使用に適合されてもよい。アッセイは、健康な、出生後retinogeniculateシステムの文脈で検証されてきたが重要なことには、一方が他方の脳全体および疾患時の食細胞 - ニューロン相互作用、ならびに他の器官系における食細胞の機能を評価するために同じ手法を適用することができる。
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Protocol
RGCシナプス前入力の1。順行ラベリング
注意：動物の使用を含むすべての実験は、全てのNIHガイドラインに従って見直され、制度的動物管理使用委員会（IACUC）によって監督された。
- フィールドや楽器を殺菌。
- プレキシグラス導入室中4体積％イソフルラン（この体積％イソフルランは新生児成体マウスのために働く）でマウスを麻酔。過剰麻酔を避けるために密接にマウスを観察します。注意：真空廃ガス排出と吸入を避ける。
- 1-3分後、（古いマウスはより少ない時間を必要とする）麻酔の適切なレベルを確保するためには、尾をつまん（反応が観察されないはずである）、および呼吸数を（速度がゆっくりと着実でなければなりません）を観察することによって達成される。
- 鼻の上に3〜4体積％イソフルランを提供した側と場所ノーズコーンに実体顕微鏡下にマウスを置き（新生児<生後10（P10）〜4体積％;> P10〜3体積％）。
- 強膜を公開します。新生児の注射のために事前のアイ開口に、まぶたを開いて、強膜を露出させ、皮膚を引き戻すために、小さな春のはさみを使用しています。高齢のマウスの場合は、強膜を露出させ、目の周囲の皮膚を引き戻すために指を使用しています。注意：新生児では、時々、目の隅に別の垂直カットが必要です。まぶたの隅をカットすると、カットした場合、過度に出血します、血管があるので注意してください。
- 強膜が始まる行で、目の側面に小さな穴を穿刺する無菌30.5gの針を使用してください。ただ十分ベベル目に入ったことを、針を挿入することにより、レンズに損傷を与えないように注意してください。
- 硝子体が穴から流出し、液体を吸収するために、滅菌綿棒を使用することができます。
- 硝子体が穴から流出が停止した後は、前向性レーシング染料がプリロードハミルトン注射器に取り付け鈍頭針を挿入穴に。注意：目の反対側に穴を開けるか、レンズの損傷を防ぐために、徐々に針を挿入します。
- ゆっくり目の中に色素を注入する。一般的には、アレクサ594、647、または488（CTB-594、CTB-647、またはCTB-488、5-6μgの/μL）に結合βサブユニットコレラ毒素は順行トレースRGC入力に使用されます。新生児（≤P10）の場合は1〜2μLで十分であり、マウスで> P10〜3μLで十分です。注：Alexa色素は、リソソーム分解に対して特に耐性がある
- 数秒間の穴に針を残してから、ゆっくりと取り外します。
- 余分な水分を吸収し、外部に漏れ出す色素を防ぐために綿棒を使用してください。
- 目に抗生物質軟膏を少量を適用します。眼が外科的に開かれた場合は、ゆっくり一緒にまぶたの位置を変更。
- 両眼を注入した場合、もう片方の目で手順を繰り返します。
- それはanesthから回復し始めるまで注射（S）に続いて、加熱ランプ下や熱パッド上でマウスを残すESIA。
- きれいなホームケージにマウスを返し、それは植民地に戻る前に、完全に覚醒していることを確認するために監視します。
2。イメージングのための組織を準備
この組織調製プロトコルは、食細胞は、蛍光マーカー（ 例えば 、ミクログリア用CX3CR1-EGFP）で標識されたレポーターマウスのために使用される。レポーターラインが利用できない場合、治験責任医師は、（説明を参照）、組織切片を免疫染色することができる。
- 〜24時間の注射後、マウスを犠牲にし、脳を解剖。
- 4℃で一晩、4％パラホルムアルデヒド（PFA）を充填したファルコンチューブに脳を固定ドロップ注意：PFAは有毒である。ドラフト内またはダウンドラフトテーブルの上に使用して個人用保護具を着用し吸入および皮膚暴露を避ける。注：固定は（≥4時間）を短くすることができる。また、代わりに、液滴の定着を、4％PFAで灌流は2-24時間の低下を修正することで、続いて使用することができる。しかし、潅流の比較固定新生児と成人の脳をドロップするDは画質や定量化に差は認められなかった。
- リン酸緩衝生理食塩水（PBS）中の脳の3回リンス。
- 空の重量を量るボートに脳やPFAを注ぐ。
- 別の脳を転送するために、へらを使用し、PBSで満たされたボートの重量を量る。
- PBSで2回以上の洗浄脳（詳細2への転送の脳はPBSで満たしボートの重さ）。
- 30％スクロース溶液で満たしたファルコンチューブに脳を移す。脳は、チューブ（24〜48時間）の底に沈むまで4℃でスクロース中脳のままにしておきます。
- 脳が沈むと、切片化のための脳を準備します。次の手順は、凍結ステージをスライディングミクロトームを用いて40μmのフローティングのセクションの準備（クライオスタットを使用することも可能）です。
- （DLGNために、脳の吻側と尾の部分を削除します）必要とされない脳の部分を削除するためにカミソリの刃を使用してください。
- ブラジャーを凍結ドライアイス上にアルミニウム箔上にある。この間、ミクロトームステージを凍結し、0.5mlの0.1Mリン酸緩衝液（PB）を用いて24ウェルプレートの各ウェルを充填する。
- 凍結ステージ上で（それが不透明に表示されます）冷凍脳をマウントします。
- ステージに最適な切削温度化合物（OCT）の少量を適用する。
- 10月が凍結し始めると、OCTで脳に横たわっていた。カットされた脳の終わり（ 例えば 、DLGNため、尾側を上向きに）上に向けなければならない。
- 非常に細かく砕いたドライアイスで脳と10月をカバーしています。
- 〜30秒間、脳/ 10月にドライアイスを残す。
- ドライアイスを削除するために大規模なペイントブラシを使用してください。脳と10月には、ステージに凍結して下さい。
- 関心領域（ROI）に到達するまで組織を通って切片始める。
- ROIに到達すると、ブレードから切片を除去し、24ウェルプラットフォームに転送する小さなペイントブラシを使用E、0.1M PB（ステップ2.5.2）を含む。前ブレードからセクションを削除する、0.1M PBでそれを濡らすことで湿ったペイントブラシを保管してください。注記：セクションは4℃で一晩、0.1M PBに残すことができます
- の項では、収集された後、蛍光解剖顕微鏡下で順行性標識を視覚化し、ROIを含むセクションを選択します。
- 小さなペイントブラシでスライド上のセクションをマウントします。
- 充電顕微鏡スライドに0.1 M PBの小さなプールを適用します。
- PBのプールに組織切片を転送します。
- オリエントへのPBおよびペイントブラシを使用し、組織を広げた。
- 過剰PBをオフに吸い上げるためにキムワイプを使用しています。セクションをオフに吸上げないように注意してください。
- 完全に空気乾燥させます。
- 各セクションに封入剤の小滴を適用し、（22×50ミリメートル、番号1.5）上にカバースリップをマウントします。
- 撮像セッションまで-20℃でマニキュアや店舗でのスライドの端をシールします。注意：画像付きますが準備が勧められるの週に、スライドを画像化の前に数週間、-20℃に維持することができる。
3。イメージングティッシュ
すべての画像は回転するディスク共焦点顕微鏡（ダイオードレーザー（405 nmの、445 nmの、488 nmの、514 nmの、561 nmであり、640 nm）を装備しULTRAVIEW Voxの回転するディスク共焦点顕微鏡）で取得されています。画像は、（ 例えば 、レーザー走査共焦点顕微鏡、デコンボリューション等が続く落射蛍光顕微鏡）の高解像度のzスタックを獲得する能力を有する任意の顕微鏡上で取得することができる。フレームサイズは、典型的には1,000倍1000画素である。
- 10倍の倍率でROIを見つけて、画像を取得する。 retinogeniculateシステム内のミクログリアを画像化するため、投資収益率は、最も内側DLGNセクションです。
- （、60Xプランアポ目標、NA = 1.4、一般的に使用されている）より高い倍率にシフトする。
- 0.2μmのZ-ステップを使用して食細胞を含むビューの最初のフィールドを取得S。
- 動物当たりの食細胞を含む15〜19以上のフィールドを取得します。
4。定量（ImageJは）用の画像を用意
- ImageJの中でzスタックを開きます。
- イメージメニューの[色とスプリットチャンネルに移動します。
- 飲み込ま材料を含むチャネル（S）からのバックグラウンドを差し引く。
- 飲み込ま材料（ 例えば 、シナプス前の入力）を含むチャンネル·ウィンドウを選択します。
- [プロセス]メニューに移動し、減算の背景を選択します。 DLGNにおけるシナプス前入力の順行性トレースに10ピクセルのローリングボールの半径を使用してください。注：ローリングボール半径は経験的に決定される。しかし、それは一般的に、背景の一部ではない画像で最大の物体の半径と同じ大きさでなければなりません。
- 食細胞を含むチャネルを滑らかに。
- 食細胞（ 例えば 、ミクログリア）を含むチャンネル·ウィンドウを選択します。
- [プロセス]メニューおよびSELに行くECTフィルタ、を意味します。 （これは後のステップで表面レンダリングのための画像を滑らかに）1.5の平均フィルタを使用します。
- 食細胞を含むチャネルからバックグラウンドを差し引く。
- 食細胞（ 例えば 、ミクログリア）を含むチャンネル·ウィンドウを選択します。
- （設定は経験的に決定する必要があります）減算の背景を選択し、[プロセス]メニューに移動します。 EGFP陽性ミクログリアのための50のピクセルのローリングボールの半径を使用してください。
- イメージメニューに移動して色を選択することで、チャンネルをマージし、チャンネルをマージします。
- マージされたファイルから食細胞を含む作物のROI（これは表面がより高速にレンダリングできます、手順5を参照）。
- ツールバーの長方形の選択範囲ツールを使用して、ROIの周囲にボックスを描画します。
- イメージメニューに移動し、作物を選択します。
- （ステップ4.2を参照）、再びチャンネルを分割します。
- 独自のTIFFファイルとして各チャンネルを保存します。
5。定量化のための画像を準備しますIMARIS中
- オープンIMARISとボリュームアイコンが左上のメニュー（ 図2）で選択されていることを確認します。
- トリミングされた画像の最初のチャネルを開きます（チャネルのいずれかが最初に開くことができるだけ一致している）。
- 他のチャンネルを追加します。 [編集]メニューに移動し、チャネルを追加し、ファイル内の次のチャンネルを選択する]を選択します。 （残りのチャンネルに対して、この手順を繰り返します）。注：色を変更する表示調整ウィンドウに移動し、チャンネル名（ 図3A）をクリックします。これは色を調整するためにダイアログボックスが表示されます。表示調整ウィンドウが表示されていない場合は、[編集]メニューに移動し、表示調整を選択します。
- ピクセル値を調整します。 [編集]メニューに移動し、画像のプロパティ]を選択します。このウィンドウでは、x、y、zの画素値（これらの値は、顕微鏡対物レンズ、カメラ、およびz段階取得に依存し、画像を取得するために使用されるソフトウェアに見出すことができる）を調整する。
- ステップ5.5は非常にになります小さな画像。サイズを変更するには、右下の角（ 図2）に合わせるアイコンをクリックしてください。
- 表示調整]ウィンドウで、左と中央の三角形を使用して、各チャンネルの明るさとコントラストを調整します。
6。食細胞の3次元（3D）表面レンダリングを
- トップツールバーで、サーパスモードが（ 図3C）を選択されていることを確認してください。
- 表示調整]ウィンドウで、食細胞チャンネルを除く全チャンネルのチェックを外します。これは、ビューのフィールドからそれらを削除します。
- サーフェスレンダリングアイコン（ 図2）をクリックします。
- Aウインドウが左下（ 図4A）で表示されます作成し、セグメント別の投資収益率は、この最初のウィンドウでオフになっていることを確認してください。一番下にある青色の進むボタンをクリックします。
- スムージングを調整します。
- 次のウィンドウで、プルダウンメニュー（ 図4B）からの食細胞のチャネルを選択します。これは調整表面化され、経験的に決定されるべき情報の量（0.1μmの平滑化は、典型的には、ミクログリアのために使用される）。
- 絶対しきい値を選択します。
- 一番下にある青い進むボタンをクリックしてください。
- しきい値イメージ。
- 画像は（ 図4C）を適切に表面化するまでのヒストグラムと、ドラッグをクリックします。これは、蛍光画像に重ねグレー面が正確な表面表現であることを確認するために、画像を回転させることによって経験的に決定される。注：回転画面（ 図3B）の右上にポインタメニューをナビゲートを選択し、回転させたい画像をクリックして、長押しします。元の向きにイメージを戻すには、[表示]メニューから左下原点を選択します。
- 一番下にある青い進むボタンをクリックしてください。
- 次のウィンドウでは、画像のノイズが特に大きい場合を除きサイズ、ことにより、任意の面をフィルタリングするためのオプションがあり、フィルタリングして削除しないでください自動的に表示され、Yフィルタ。食細胞をレンダリング表面を仕上げるために一番下に緑色の矢印をクリックします。タブの新しいセットが（ 図5）が表示されます
- 必要に応じて、関心のある食細胞の一部ではない任意の表面を削除します。
- セレクトオプションはポインタのメニュー（ 図3B）で選択されていることを確認します。
- それが黄色に変わりますように削除されるあらゆる表面上をクリックしてください。コントロールボタンを押しながら複数のサーフェスを削除するには、表面をクリックしてください。
- 鉛筆]タブの下で[削除]をクリックします。
- 1面に食細胞のすべてのサーフェスを選択し、マージします。
- ファンネル（; 図5C すなわちフィルタ]タブ）をクリックします。
- [追加]をクリックします。
- 任意のフィルタを選択し、（すべての表面が黄色であるべき）左端にヒストグラムをドラッグします。
- 鉛筆]タブに戻り、ユニファイをクリックします。
- [グラフ]タブに移動します（ 図5（A） 図5D）を選択します。複数のパラメータを表示するために、左下のレンチアイコン（ 図2）に移動し、記録するためのパラメータを選択します。
- 食細胞の量を記録し、続行する前にファイルを保存します。
飲み込ま素材の7。3Dサーフェスレンダリング
- 食細胞に包まれています材料のための新しいチャネルを作成します。
- 食細胞表面が選択された状態で、鉛筆のタブをクリックします。
- すべてのマスク]をクリックします。
- 表示されるダイアログでは、飲み込ま材料（; 図5B 例えば 、シナプス前入力の順行性トレース）に対応するチャネルを選択します。
- マスクを適用する前に、重複したチャンネルを確認して、[OK]を押します。
- 新しいチャネルが巻き込まれた唯一の材料が含まれており、内側にある表示調整ウィンドウに表示されます食細胞。
- 表面は総飲み込まとnonengulfed物質を含むチャンネルをレンダリングします。
- 表面化するチャネルを除いて表示調整ウィンドウ内のすべてのチャンネルをオフにして、食のために作成された面のチェックを外します。
- （6.4から6.11ステップ）、再び表面レンダリングのアイコンをクリックする（ステップ6.3を参照）、食細胞について記載したのと同じ手順を使用して、チャネルのための表面を作成します。注：前に（ステップ6.5、 図4B）を平滑化し、しきい値に正しいチャネルを選択してください。しきい値をメモしておきます（ステップ6.6を参照してください。 図4C）。この値は、表面レンダリングが完了した後に得られた（; 図5Aワンドタブ）することができる。
- 総飲み込ま非飲み込ま材料の体積を記録し、続行する前にファイルを保存します。
- 表面飲み込ま材料（食細胞内の物質）をレンダリングします。
- 唯一の蛍光を可視化する飲み込ま材料の新しいチャネル（ステップ7.2.1を参照）。
- （7.2から7.3ステップ）上記と同じ手順に従ってください。注意事項：（ステップ7.1で作成した新しいチャネルを選択します）前に平滑化プルダウンメニューから適切なチャンネルを選択してください。しきい値ウィンドウでは、手動で（ステップ7.2.2を参照）を巻き込んだ合計と非飲み込ま素材をレンダリングするために設定されたしきい値を入力します。
- 飲み込ま材料の体積を記録し、続行する前にファイルを保存します。
8。視野の合計体積を計算する
- いずれかのチャネルのための新しい面を作成します。
- フィールド全体が表面化されるように、しきい値ウィンドウ（ステップ6.6）では、ヒストグラムを一番左まで移動します。
- フィールド全体を浮上終えて（6.7から6.11ステップ）ボリュームを記録します。
- ファイルを保存します。
9。貪食材料の量を計算する
- の密度を計算次のアルゴリズムを使用して、総巻き込んだと非飲み込まマテリアルチャンネル：
フィールド（ステップ8）の合計飲み込まと非包ま材料の体積（7.3ステップ）/ボリューム。 - 次のアルゴリズムを使用して、細胞あたりの％の飲み込みを計算します。
（飲み込ま材料の体積（ステップ7.5）/食細胞（ステップ6.11）の総容量）×100
注：セルサイズの変動を考慮するために、データは、食細胞の全体積に正規化される。ステップ9.1からの数字はフィールド全体で非常に可変である場合、それは9.1で計算し、ステップ9.2からのデータを正規化する必要があるかもしれない。
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Representative Results
最近では、発展途上retinogeniculateシステムにおけるシナプス前入力のミクログリア媒介貪食（ 図1）7 を可視化し、定量化するために、この貪食アッセイを使用していました。 CX3CR1-EGFPヘテロ接合体マウスからRGCを順行それぞれ、左右の目にCTB-594およびCTB-647で追跡した。このトレースに続いて、DLGN内EGFP陽性ミクログリアを画像化した。これらの画像は、その後のボリューム測定のために表面レンダリングであった。
この技術を使用して、我々はDLGN内発育シナプスリモデリング（P5）のピーク期間の間に、シナプス前入力は、ミクログリア（ 図6）に包まれていることを見出した。改造が大量に（P9）がほぼ完了したときに、わずか4日間後に、飲み込ま入力の量が劇的に減少する。また、貪食や剪定は、古典的補体カスケードに属するタンパク質が欠損したマウスで破壊される（ 図6）、ならびにニューロン発火の操作を下記（データは示さず）7。
順行トレース戦略の図1。戦略RGCシナプス前入力のミクログリア媒介貪食7を評価した。A）は概略。左右の目のRGC入力はそれぞれ、CTB-647（青）とCTB-594（赤）でトレースされます。ミクログリア媒介（緑）の入力の飲み込みがその後に評価されている。B）生後5（P5の代表低倍率画像）マウスDLGN順行左のトレース（青）と右（赤）目の入力は以下。スケールバー=100μmである。CI）ミクログリア（EGFP、緑）左（青の境界領域からサ ンプリング）と右（赤）目の入力（Bの挿入図）。CII） CIII）サーフェスレンダリングとRGC入力を巻き込んだ。 P5 DLGNからグリッド線の増分= 5程度である。DI）代表ミクログリア（緑、EGFP）。 RGC入力がCTB-594（赤色）で標識され、リソソームは、抗CD68（青色）で標識される。DII）ミクログリアボリューム外のすべてのCTB蛍光が除去された明らかに、ミクログリア内のRGC入力（赤）およびリソソーム（青色）を貪食白矢印） 事業部-V）CD68（DIV）とCTB（DV）のチャンネルのみで、。（緑）DIII）ほとんどのRGC入力（赤）は、完全にCD68陽性のリソソーム（青内に局在している。スケールバー=10μmである。 この図の拡大版を表示するには、こちらをクリックしてください。
図2。IMARISソフトウェアのアイコン。
図3。ソフトウェアで一般的なナビゲーション·ウィンドウ。 a）表示の調整ウィンドウ。B）ポインタウィンドウ。選択した特定の面を選択することができます。ナビは視野内の画像の回転が可能になります。C）これは、ボリュームレンダリングサーフェスのモードサーパスすることが必要である。
ソフトウェア図4。表面レンダリング、A）のウィンドウを作成します。B）スムーズウィンドウをING。 （黄色で強調表示）プルダウンメニューから表面にチャネルを選択します。C）蛍光画像に表面をしきい値。赤いボックスで強調表示総包ま非飲み込ま材料のために記録する必要がある閾値である。この番号は、後でしきい値に適用され、飲み込ま材料表面になります。 この図の拡大版を表示するには、こちらをクリックしてください。
図5。ソフトウェアのボリューム測定値を得る。 A）表面レンダリング次の表示されるタブは。テキストで識別されワンド、鉛筆、ファンネル、グラフのタブに注意してください。B）マスクを食細胞内で包ま材料を可視化するためにすべての機能を。選択したチャンネルに注意してください（YEボックスLLOW）。C）機能ファンネル/フィルタ]タブの下で、それが黄色に表示されるよう、すべての道を左にヒストグラムをスライドさせて、フィールド内のすべての面を選択することができます。任意のフィルタは、このために選択することができます。D）[グラフ]タブの下で、体積測定を得て、記録することができます。 この図の拡大版を表示するには、こちらをクリックしてください。
図6。P5（蛍光像を図1に示します）、P9、およびP30マウスDLGNからの代表的なデータは7。A）代表表面レンダリングミクログリア。黒の点線で示された拡大のインセット。=5μmのグリッド線が増加します。B）RGC入力の貪食は著しく、古い年代（P9とP30）対DLGN（P5）のピーク剪定中に増加している。 *補体レセプター3を欠損したマウスから、P <0.001による一元配置分散分析、N = 3匹/歳。C）ミクログリア（KO、黒いバー）は、WT同腹仔（白いバー）と比較して、有意に少ないRGC入力を巻き込む。すべてのデータは、WT制御値に正規化される。 * P <スチューデントt検定0.04、n = 3のマウス/遺伝子型。すべてのエラーバーはSEM表す拡大画像を表示するにはここをクリックしてください。
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Discussion
正確に食作用を測定するために、飲み込ま材料がリソソーム分解が発生した後、研究者はそれを視覚化することができるようにラベル付けされなければならない。さらに、高解像度イメージングは、セル全体の体積を可視化し、その内容を定量化する研究を可能にするソフトウェアを使用し、続いて、必要とされる。このプロトコルでは、高解像度の共焦点顕微鏡および三次元再構成と組み合わさ飲み込ま物質を標識するAlexa色素にコンジュゲートCTBを用いて食細胞媒介性の貪食を測定するための信頼性の高い定量的な方法を記載している。この方法論は正常に発達中のマウスの脳（retinogeniculateシステム）7におけるシナプスリモデリングを受けているシナプス前入力のミクログリア媒介、貪食を分析するために私たちの研究室で使用されてきた。また、未定義異なる発達経年飲み込みの微妙な変化を区別することができる高感度の技術であることが証明されているR非病理学的状態および野生型およびノックアウトマウスの間。わずかな調整で、このプロトコルは、タイムラプス撮影により生体組織に貪食を研究するために適合させることができる。また、このプロトコルは、疾患における食細胞 - ニューロン相互作用を研究するために適用されてもよい。
注意点
このアッセイの最も便利な側面の一つは、彼らがリソソーム分解経路を入力した後に表示されたままになるように、神経突起物を標識することができることである。ニューロンが標識されているので、それは貪食された細胞のどの部分を区別することが困難な場合がある。これは電子顕微鏡7と組み合わせることは非常に慎重地域分析（DLGNの非シナプス部位に対して例えば 、シナプス領域）が必要です。加えて、これは神経細胞の細胞体および突起が同じエリアに存在する他の脳領域でより困難証明することができる。しかし、代替の標識戦略はベルを参照して（使用してもよいOW）。さらに、光学顕微鏡の分解能の限界に起因し、一方が飲み込まれる材料の量を過大評価する可能性がある。その結果、ケアが飲み込ま物質はリソソーム内であることを検証するために注意する必要があります。このような理由から、我々は、ミクログリア内3Dレンダリング、およびアッセイのパラメータを検証するために、直交ビューをリソソームにラベルを付けるために抗CD68を使用しています。
細胞型
ミクログリアに加えて、この方法は、脳（ 例えば 、星状細胞）および末梢神経系および免疫系（ 例えば 、perisynapticシュワン細胞、マクロファージなど）中の他の食細胞の役割を分析するために適用することができる。 Alexa色素にコンジュゲートCTBがそのように容易にほとんどの細胞によって取り込まれるため、また、類似の標識戦略は、脳および他の器官系全体に飲み込ま物質を標識するために使用されてもよい。
飲み込ま素材の標識
Al等のRGCを、蛍光タンパク質（ 例えば 、tdTomato、EGFPなど）で標識された1）蛍光レポーターマウス：Alexa色素に結合させたCTBにternativeは、我々は飲み込ま材料7にラベルを付けるために、次の戦略を使用している。デキストランに結合させpHrodo色素と2）順行性ラベリング、それがリソソーム中で一度だけ蛍光を発する色素。これらの様々な戦略を使用して、ミクログリア内で包まシナプス前の入力の可視化および定量化は、同一の撮像および定量技術performedwithすることができます。しかし、Alexaの色素結合体は、加水分解酵素7,21リソソームするAlexaの色素の高抵抗に最も強固である。さらに、抗体（ 例えば 、抗VGLUT2、シナプス前小胞タンパク質）と飲み込ま材料の標識は試みられている。しかしながら、これはほとんどのタンパク質を迅速にリソソームに一度分解されることを考えると、比較的信頼できない検出方法である。これは、低い蛍光を区別することは困難である背景上タンパク質分解へ。
使用される動物
現在のプロトコルでは、ミクログリアを蛍光蛍光レポーターマウス（CX3CR1-EGFP）22を使用して遺伝的にラベルが付いています。しかしながら、蛍光レポーター構築物の遺伝子発現に対する抗体標識が必要である場合がある。例えば、蛍光レポーターマウスが目的の食のために利用できない場合、ラットの使用が必要である、または研究者は蛍光レポーターマウス系統にそれらを横断することなく、ノックアウトマウスを見たいと考えています。このような事例では、食細胞は免疫組織化学を用いて標識することができ、データは蛍光レポーターマウス7を用いた実験から得られた結果に匹敵する。組織切片の後、我々は一般的にフローティングのセクション7のための標準的な免疫染色のプロトコルを使用しています。これは、セル全体にラベルますタンパク質に対する抗体を選択してすることが重要ですそのプロセス。例えば、小膠細胞を標識するために、抗IBA1を使用することができる。
より広範なアプリケーション：ライブイメージングと疾患
このプロトコルは、固定された組織の分析に基づいている間に、わずかな修正をライブイメージングによって取得された画像内の同じ分析を可能にする。タイムラプスイメージングセッションに続いて、後続のzスタックは、このプロトコルで4-9ステップと同一に処理することができる。我々は、健康なCNSの発達シナプスリモデリングの間のシナプスの貪食を可視化するためにこのプロトコルを適用しながらさらに、このプロトコルはまた、疾患モデルに適用することができる。特に、このプロトコルは、等12,14-19,23脊髄損傷、アルツハイマー病に関連する初期のシナプス消失、次のシナプス喪失および再生の場合のように、シナプスは、実質的なリモデリングを受けている疾患を研究するために使用することができる- 26。加えて、1つはまた、PhaGの疾患を研究するためにこの技術を適応させることができるシナプス以外の材料のocytosisは、疾患（ 例えば 、多発性硬化症）およびアルツハイマー病5,6,27-29中のβ-アミロイドの貪食脱髄におけるミエリンのミクログリア/マクロファージ媒介貪食として、記載されている。
結論として、ここで説明する貪食アッセイは、それらの細胞外環境と食の相互作用を研究するために、便利で再現性のある、かつ高感度な手法を提供しています。重要なのは、このアッセイは、神経科学のコミュニティだけでなく、他の臓器系で働く人々にサービスを提供する用途と機能の広い範囲を持っています。
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Disclosures
利害の対立が宣言されていません。
Acknowledgments
、、、NRSA（DPS F32-NS-066698）;作業はスミスファミリー財団（BS）、ダナ財団（BS）、ジョン·メルク奨学金プログラム（BS）、NINDS（BS RO1-NS-07100801）からの補助金によって支えられてナンシー·ルーリーマーク財団（DPS）、NIH（P30-HD-18655; MRDDRCイメージングコア）。
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Heat pad | Vet Equip, Inc. | 965500 | |
| Warm water source for heat pad | Kent Scientific | TP-700 | |
| Stereo microscope | DSC Optical | Zeiss Opmi -6 Surgical Microscope | |
| Sliding microtome with freezing stage | Leica | SM2010 R | |
| Microtome blade | Leica | 14021607100 | |
| Fluorescent dissecting microscope | Nikon | SMZ800 with Epi-fluorescence attachment | |
| Spinning disk confocal microscope | Perkin Elmer | UltraView Vox Spinning Disk Confocal | |
| 10 µl Hamilton gas tight syringes | Hamilton | 80030 | Use a different syringe for each color dye/tracer |
| Hamilton needles | Hamilton | 7803-05, specifications: blunt, 1.5" | |
| Alexa-conjugated cholera toxin β subunit (CTB) | Invitrogen | 488: C22841 | Reconstitute in sterile saline, 80 µl (488), 100 µl (594), 20 µl (647) |
| 594: C22842 | |||
| 647: C34778 | |||
| Phosphate Buffered Saline (PBS) | Sigma | P4417-50TAB | |
| Neomycin and Polymyxin B Sulfates and Bacitracin Zinc Ophthalmic Ointment USP (antibiotic ointment) | Bausch & Lomb | 24208-780-55 | |
| 30.5 G needle | Becton Dickinson | 305106 | |
| Spring scissors | Roboz | RS-5630 | |
| Cotton-tipped applicator | Fisher | 23-400-125 | |
| Paraformaldeyde (PFA) | Electron Microscopy Sciences | 15710 | Dilute 16% to 4% in PBS. Paraformaldehye is toxic, use in a fume hood and wear personal protective equipment. |
| Dissection tools – scissors, forceps, spatula | Small scissors: Fine Science Tools | Small scissors:14370-22 | |
| Large scissors: Roboz | Large scissors: RS-6820 | ||
| #55 forceps: Fine Science Tools | #55 forceps: 11255-20 | ||
| Spatula: Ted Pella, Inc. | Spatula: 13504 | ||
| Sucrose | Sigma | S8501-5KG | Make 30% sucrose in PBS (weight/vol) |
| OCT Compound | VWR | 25608-930 | |
| Weigh boat | USA Scientific | 2347-1426 | |
| 24-well plates | BD Biosciences | 353047 | |
| Sodium phosphate monobasic | Sigma | S6566-500G | Make 0.2 M sodium phosphate monobasic (PB-A) in ddH2O and 0.2 M sodium phosphate dibasic (PB-B) in ddH2O. To make 0.1 M PB, combine 19 ml PB-A and 81 ml PB-B, fill to 200 ml with ddH2O |
| Sodium phosphate dibasic | Sigma | S5136-500G | |
| Coverslips, 22 X 50 mm, No. 1.5 | VWR | 48393 194 | |
| Charged microscope slide | VWR | 48311-703 | |
| Vectasheild | Vector Laboratories | H-1200 |
References
- Ransohoff, R. M., Perry, V. H. Microglial physiology: unique stimuli, specialized responses. Annu Rev Immunol. 27, 119-145 (2009).
- Aguzzi, A., et al. Microglia: scapegoat, saboteur, or something else. Science. 339 (6116), 156-161 (2013).
- Tremblay, M. E., et al. The role of microglia in the healthy brain. J Neurosci. 31 (45), 16064-16069 (2011).
- Hanisch, U. K., Kettenmann, H. Microglia: active sensor and versatile effector cells in the normal and pathologic brain. Nat. Neurosci. 10 (11), 1387-1394 (2007).
- Sierra, A., et al. Janus-faced microglia: beneficial and detrimental consequences of microglial phagocytosis. Front Cell Neurosci. 7, (2013).
- Dheen, S. T., et al. Microglial activation and its implications in the brain diseases. Curr Med Chem. 14 (11), 1189-1197 (2007).
- Schafer, D. P., et al. Microglia sculpt postnatal neural circuits in an activity and complement-dependent manner. Neuron. 74 (4), 691-705 (2012).
- Katz, L., Shatz, C. Synaptic activity and the constuction of cortical circuits. Science. 274 (5290), 1133-1138 (1996).
- Sanes, J. R., Lichtman, J. W. Development of the vertebrate neuromuscular junction. Annu Rev Neurosci. 22, 389-442 (1999).
- Hua, J. Y., Smith, S. J. Neural activity and the dynamics of central nervous system development. Nat Neurosci. 7 (4), 327-332 (2004).
- Holtmaat, A., Svoboda, K. Experience-dependent structural synaptic plasticity in the mammalian brain. Nat Rev Neurosci. 10 (9), 647-658 (2009).
- Butz, M., et al. Activity-dependent structural plasticity. Brain Res Rev. 60 (2), 287-305 (2009).
- Bruel-Jungerman, E., et al. Brain plasticity mechanisms and memory: a party of four. Neuroscientist. 13 (5), 492-505 (2007).
- Schafer, D. P., Stevens, B. Synapse elimination during development and disease: immune molecules take centre stage. Biochem Soc Trans. 38 (2), 476-481 (2010).
- Alexander, A., et al. The complement system: an unexpected role in synaptic pruning during development and disease. Annu Rev Neurosci. 35, 369-389 (2012).
- Brown, A., Weaver, L. C. The dark side of neuroplasticity. Exp Neurol. 235 (1), 133-141 (2012).
- Navarro, X. Chapter 27: Neural plasticity after nerve injury and regeneration. Int Rev Neurobiol. 87, 483-505 (2009).
- Tan, A. M., Waxman, S. G. Spinal cord injury, dendritic spine remodeling, and spinal memory mechanisms. Exp Neurol. 235 (1), 142-151 (2012).
- Wolpaw, J. R., Tennissen, A. M. Activity-dependent spinal cord plasticity in health and disease. Annu Rev Neurosci. 24, 807-843 (2001).
- Schafer, D. P., et al. The "quad-partite" synapse: Microglia-synapse interactions in the developing and mature CNS. Glia. 61 (1), 24-36 (2013).
- Mukhopadhyay, S., et al. Manganese-induced trafficking and turnover of the cis-Golgi glycoprotein GPP130. Mol Biol Cell. 21 (7), 1282-1292 (2010).
- Jung, S., et al. Analysis of fractalkine receptor CX(3)CR1 function by targeted deletion and green fluorescent protein reporter gene insertion. Mol Cell Biol. 20, 4106-4114 (2000).
- Knobloch, M., Mansuy, I. M. Dendritic spine loss and synaptic alterations in Alzheimer's disease. Mol Neurobiol. 37 (1), 73-82 (2008).
- Masliah, E., et al. Synaptic remodeling during aging and in Alzheimer's disease. J Alzheimers Dis. 9 (3 Suppl), 91-99 (2006).
- Yoshiyama, Y., et al. Synapse loss and microglial activation precede tangles in a P301S tauopathy mouse model. Neuron. 53 (3), 337-351 (1016).
- Milnerwood, A. J., Raymond, L. A. Early synaptic pathophysiology in neurodegeneration: insights from Huntington's disease. Trends Neurosci. 33 (11), 513-523 (2010).
- Noda, M., Suzumura, A. Sweepers in the CNS: Microglial Migration and Phagocytosis in the Alzheimer Disease Pathogenesis. Int J Alzheimers Dis. , (2012).
- Rotshenker, S. Microglia and macrophage activation and the regulation of complement-receptor-3 (CR3/MAC-1)-mediated myelin phagocytosis in injury and disease. J Mol Neurosci. 21 (1), 65-72 (2003).
- Smith, M. E. Phagocytosis of myelin in demyelinative disease: a review. Neurochem Res. 24 (2), 261-268 (1999).
