Summary
Microglia vormen de bewoner immuuncellen van het centrale zenuwstelsel (CZS) met een hoge capaciteit te fagocyteren of overspoelen materiaal in hun extracellulaire omgeving. Hier wordt een breed toepasbare, betrouwbaar en zeer kwantitatieve assay voor het visualiseren en meten-gemedieerde microglia afblazen van synaptische componenten beschreven.
Abstract
Fagocytose is een proces waarbij een cel overspoelt materiaal (hele cel, delen van een cel, vuil, enz.) in de omringende extracellulaire omgeving en vervolgens verteert dit materiaal, meestal door lysosomale afbraak. Microglia vormen de bewoner immuuncellen van het centrale zenuwstelsel (CZS) die fagocytosefunctietesten is beschreven in een groot aantal aandoeningen van neurodegeneratieve ziekten (bijvoorbeeld beta-amyloid klaring bij de ziekte van Alzheimer) ontwikkeling van gezonde hersenen (bijv. synaptische snoeien) 1-6. Het volgende protocol is een engulfment test ontwikkeld om te visualiseren en te kwantificeren-microglia gemedieerde afblazen van presynaptische input in de ontwikkeling van de muis retinogeniculate systeem 7. Hoewel deze test werd gebruikt om microglia functie in dit verband beoordelen kan een gelijkaardige benadering worden gebruikt om andere fagocyten door de hersenen (bijvoorbeeld astrocyten) en de rest van het lichaam bepalen(Bijvoorbeeld perifere macrofagen) en andere contexten waarin synaptische remodeling optreedt (bijvoorbeeld hersenbeschadiging / ziekte).
Introduction
Synaptische circuits verbouwen tijdens de gehele levensduur van een dier. In de zich ontwikkelende hersenen, synapsen vormen boven en moet synaptische snoeien die de selectieve verwijdering van een subset van synapsen en het behoud en versterking van deze synapsen die overblijven 8-10 impliceert ondergaan. Dit proces is noodzakelijk om de precieze connectiviteit kenmerk van het volwassen zenuwstelsel bereiken. In de volwassen, kan synapsen ook plastic zijn, met name in het kader van leren en geheugen. De structurele correlaten van deze plasticiteit wordt gedacht aan het toevoegen en / of eliminatie van dendritische spines en presynaptische boutons 11-13 omvatten. Naast deze functies in de gezonde zenuwstelsel wordt synaptische remodelleren ook betrokken bij zenuwstelsel / letsels 12,14,15. Bijvoorbeeld, na dwarslaesie, gescheiden axonen moeten vervolgens verbouwen en vormen nieuwe synapsen tot functioneel herstel 16-19 te bereiken.
nt '> opkomst als een belangrijk aspect van synaptische plasticiteit is het proces van fagocytose of afblazen van synapsen bestemd voor het verwijderen 3,5,20. We toonden onlangs dit verschijnsel in het kader van synaptische snoeien in de gezonde, postnatale hersenen van muizen 7. Specifiek , microglia, de resident CNS immuuncellen en fagocyten, bleken presynaptische ingangen overspoelen tijdens een piekperiode en in een gebied van ontwikkelings-synaptische snoeien, de postnatale dorsale laterale nucleus geniculate (dLGN) van de thalamus. genetische of farmacologische blokkade van deze engulfment resulteerde in aanhoudende tekorten in synaptische connectiviteit.In dit protocol beschrijven we een betrouwbare en zeer kwantitatieve bepaling om fagocyt-gemedieerde afblazen van presynaptische inputs meten. Voor de toepassing van dit artikel, zal deze test in het kader van de ontwikkeling van retinogeniculate systeem, dat retinale ganglion cellen bevat (RGC) die woonachtig zijn in het netvlies worden gepresenteerd datprojecteren presynaptische input voor de dLGN (figuur 1A). Om te beginnen, een lysosomale afbraak-resistente anterograde labeling strategie worden beschreven, die wordt gebruikt om RGC-specifieke ingangen in de presynaptische dLGN (figuur 1) 7,21 visualiseren. Na deze beschrijving, een gedetailleerde methodologie voor beeldvorming en kwantitatief meten afblazen via confocale microscopie gecombineerd met 3-dimensionale (3D) oppervlaktevolume weergave worden gegeven. Deze methode is gebaseerd op vaste preparaat weefsel maar kan ook worden aangepast voor gebruik in levende weergavestudies. Belangrijk, terwijl de test is gevalideerd in het kader van de gezonde, postnatale retinogeniculate systeem kon dezelfde technieken op andere fagocyt-neuron interacties door de hersenen en tijdens ziekte en fagocyt functie in andere orgaansystemen beoordelen.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. Anterograde Labeling van RGC Presynaptische Ingangen
Opmerking: Alle experimenten met het gebruik van dieren werden in overeenstemming met alle NIH richtlijnen beoordeeld en gecontroleerd door de institutionele Animal Care en gebruik Comite (IACUC).
- Steriliseren veld en instrumenten.
- Verdoven muis met 4 vol% isofluraan in een plexiglas inductie kamer (dit vol% isofluraan werkt voor neonatale-volwassen muizen). Observeer muizen nauw te voorkomen dat over-verlamming. LET OP: Vermijd inademing met een stofzuiger afvalgas evacuatie.
- Na 1-3 min, (oudere muizen zal minder tijd vergen) zorgen voor passende niveau van de anesthesie wordt bereikt door te knijpen de staart (geen reactie moeten worden geobserveerd) en het observeren van de ademhaling (tarief moet langzaam en gestaag zijn).
- Plaats de muis onder de stereo microscoop op zijn kant en plaats neuskegel leveren van 3-4 vol% isofluraan over de snuit (neonaten <postnatale dag 10 (P10) ~ 4 vol%;> P10 ~ 3 vol%).
- Expose de sclera. Voor injectie van pasgeborenen vóór opening van de ogen, gebruik dan een paar kleine lente schaar om het ooglid te openen en trek de huid om de sclera bloot. Voor oudere muizen, gebruiken vingers terug te trekken van de huid rond het oog aan de sclera bloot. LET OP: Bij pasgeborenen, soms een andere loodrecht gesneden op de hoek van het oog noodzakelijk is. Wees voorzichtig bij het snijden van de hoek van het ooglid als er een bloedvat dat, indien gesneden, zal overmatig bloeden.
- Gebruik een steriele 30,5 G naald een klein gat in de zijkant van het oog prikken op de lijn waar de sclera begint. Zorg om niet te beschadigen door het inbrengen van de naald net ver genoeg dat de schuine kant in het oog raakt.
- Laat het glasvocht stromen uit het gat en gebruik een steriel wattenstaafje om de vloeistof te absorberen.
- Zodra het glasvocht is gestopt met stromen uit het gat, plaats een stompe uiteinde naald bevestigd aan een Hamilton spuit voorgeladen met anterograde tracing kleurstofin het gat. LET OP: Breng de naald langzaam om te voorkomen dat aanprikken van de andere kant van het oog of beschadiging van de lens.
- Injecteer langzaam kleurstof in het oog. Typisch wordt choleratoxine β subeenheid geconjugeerd met Alexa 594, 647 of 488 (CTB-594, CTB-647 of CTB-488, 5-6 ug / ul) gebruikt anterogradely sporen RGC ingangen. Voor pasgeborenen (≤ P10) 1-2 pi is voldoende en voor muizen> P10 ~ 3 pi is voldoende. Opmerking: Alexa kleurstoffen zijn bijzonder resistent tegen lysosomale degradatie
- Laat de naald in het gat voor een paar seconden en dan langzaam te verwijderen.
- Gebruik een wattenstaafje om overtollig vocht te absorberen en te voorkomen kleurstof naar buiten lekken.
- Breng een kleine hoeveelheid antibiotische zalf voor het oog. Als eye chirurgisch werd geopend, voorzichtig de positie van de oogleden aan elkaar.
- Als het injecteren van beide ogen, herhaal procedure op andere oog.
- Na de injectie (s), tot het begint te herstellen van de Anesth verlaten muis onder een warmtelamp of op een warmte-padESIA.
- Terug muis om een schone kooi en controleren om ervoor te zorgen dat het volledig wakker alvorens terug te keren naar de kolonie.
2. Bereid Tissue for Imaging
Dit weefsel preparaat protocol wordt gebruikt voor reporter muizen waarin de fagocyten worden gelabeld met fluorescente merkers (bijvoorbeeld, CX3CR1-EGFP voor microglia). Als een verslaggever lijn niet beschikbaar is, kan de onderzoeker immunostain weefsel secties (zie Discussie).
- ~ 24 uur na de injectie, offeren de muis en ontleden de hersenen.
- Laat bevestig de hersenen in een Falcon buis gevuld met 4% paraformaldehyde (PFA) overnacht bij 4 ° C. LET OP: PFA is giftig. Vermijd inademing en blootstelling van de huid door het gebruik in een zuurkast of op een afzuigtafel en het dragen van persoonlijke beschermingsmiddelen. Opmerkingen: Fixatie kan korter (≥ 4 uur) zijn. Bovendien, in plaats van drop vaststelling, 4% PFA perfusie kan worden gevolgd door 2-24 uur druppel oplossing. Uit een vergelijking van perfuserend te laten vallen vaste neonatale en volwassen hersenen toonde geen verschil in beeldkwaliteit of kwantificatie.
- Spoel de hersenen 3x in fosfaatgebufferde zoutoplossing (PBS).
- Giet de hersenen en PFA in een lege wegen boot.
- Gebruik een spatel om de hersenen naar een andere gewichtboot gevuld met PBS.
- Wash hersenen tweemaal meer in PBS (transfer hersenen om twee wegen boten gevuld met PBS).
- Breng de hersenen om een Falcon buis gevuld met een 30% sucrose-oplossing. Laat de hersenen saccharose bij 4 ° C totdat de hersenen zinkt naar de bodem van de buis (24-48 uur).
- Zodra de hersenen zinkt, de voorbereiding van de hersenen voor het snijden. De volgende stappen zijn de bereiding van 40 urn zwevende gedeelten met een glijdende microtoom met een koude trap (a cryostaat kan worden gebruikt).
- Gebruik een scheermesje om delen van de hersenen die niet nodig te verwijderen (voor de dLGN, verwijder de rostrale en caudale delen van de hersenen).
- Bevries de behain op aluminiumfolie op droog ijs. Gedurende deze tijd, stilstaand microtoom podium en vul elk putje van een 24-wells plaat met 0,5 ml 0,1 M fosfaatbuffer (PB).
- Monteer de bevroren hersenen (het moet ondoorzichtig verschijnen) over de bevriezing podium.
- Breng een kleine hoeveelheid van optimale snijtemperatuur verbinding (oktober) op het podium.
- Zodra het oktober begint te bevriezen, leg de hersenen in de oktober Het einde van de hersenen dat zal worden gesneden moet worden naar boven (bijvoorbeeld voor de dLGN, het gezicht van de caudale kant naar boven).
- Bedek de hersenen en oktober met een zeer fijngemalen droog ijs.
- Verlaat droog ijs op de hersenen / oktober voor ~ 30 sec.
- Gebruik een grote kwast aan de droge ijs te verwijderen. De hersenen en oktober moeten worden bevroren op het podium.
- Begin snijden door het weefsel tot het gebied van belang (ROI) wordt bereikt.
- Zodra de ROI wordt bereikt, met een kleine kwast om delen van het blad te verwijderen en overbrengen naar de 24-well plate die 0,1 M PB (stap 2.5.2). Houd de kwast vochtig door bevochtigen in de 0,1 M PB voor verwijderen gedeelten van het mes. Opmerking: Secties kunnen 's nachts worden achtergelaten in 0,1 M PB bij 4 ° C.
- Zodra secties zijn verzameld, visualiseren de anterograde etikettering onder een tl dissectiemicroscoop en kies secties die de ROI bevatten.
- Monteer secties op een dia met een kleine kwast.
- Breng een klein zwembad van 0,1 M PB op een geladen microscoop glijbaan.
- Breng de sectie weefsel om het zwembad van PB.
- Gebruik de PB en kwast te oriënteren en verspreid het weefsel.
- Gebruik een Kimwipe naar Wick overtollige PB. Neem zorg om te voorkomen wicking van de sectie.
- Volledig laten drogen.
- Breng een druppeltje fixeermiddel elke sectie en zet een dekglaasje geplaatst (22 x 50 mm, nr. 1.5).
- Seal randen van dia met nagellak en bewaar bij -20 ° C tot opnamesessie. Opmerking: Hoewel beeldvorming meteen week preparaat wordt aangeraden, kan dia worden gehandhaafd op -20 ° C gedurende verscheidene weken voorafgaand aan beeldvorming.
3. Imaging Tissue
Alle beelden worden verkregen op een draaiende schijf confocale microscoop (UltraView Vox draaiende schijf confocale microscoop uitgerust met diode lasers (405 nm, 445 nm, 488 nm, 514 nm, 561 nm en 640 nm)). Beelden kunnen ook worden verkregen op een microscoop met het vermogen om hoge resolutie z-stacks verkrijgen (bijv. laser scanning confocale microscoop, epifluorescerende microscoop gevolgd door deconvolutie, enz.). Framemaat is meestal 1000 x 1000 pixels.
- Zoek ROI bij 10x vergroting en het verwerven van een afbeelding. Voor het afbeelden van microglia in het retinogeniculate systeem, de ROI is het meest mediale dLGN secties.
- Verschuiven naar hogere vergroting (een 60X Plan Apo objectieve, NA = 1.4, wordt meestal gebruikt).
- Verwerven eerste gezichtsveld met fagocyten behulp 0,2 um z-staps.
- Verwerven 15-19 meer velden bevatten fagocyten per dier.
4. Bereid Beelden voor kwantificering (ImageJ)
- Open z-stack in ImageJ.
- Ga naar het menu Beeld de optie Kleur en Split Channels.
- Trek achtergrond van de zender (s) met de overspoelde materiaal.
- Selecteer het kanaal venster met de overspoelde materiaal (bv., presynaptische ingangen).
- Ga naar het menu Proces en selecteer Aftrekken Achtergrond. Gebruik een rollende bal straal van 10 pixels voor anterograde tracing van presynaptische inputs in de dLGN. Opmerking: De rollende bal straal wordt empirisch bepaald. Er moet echter meestal zo groot als de straal van de grootste object in het beeld dat geen deel uitmaakt van de achtergrond.
- Strijk het kanaal met de fagocyt.
- Selecteer het kanaal venster met de fagocyt (bijv. microglia).
- Ga naar het menu Proces en select Filters, Mean. Gebruik een gemiddelde filter van 1,5 (dit het beeld voor oppervlakte rendering in latere stappen verzacht).
- Trek achtergrond van het kanaal met de fagocyt.
- Selecteer het kanaal venster met de fagocyt (bijv. microglia).
- Ga naar het menu Proces, selecteert aftrekken achtergrond (instellingen moet empirisch worden bepaald te zijn). Gebruik een rollende bal straal van 50 pixels voor EGFP-positieve microglia.
- Kanalen samen te voegen door te gaan naar het menu Beeld en kleur, kanalen samenvoegen selecteren.
- Gewas ROI met fagocytensysteem uit samengevoegde bestand (dit maakt het oppervlak waardoor sneller, zie stap 5).
- Teken een kader rond de ROI mbv de rechthoekige selecties gereedschap in de werkbalk.
- Ga naar het menu Beeld en kies Crop.
- Split kanalen opnieuw (zie stap 4.2).
- Sla elk kanaal als zijn eigen TIFF-bestand.
5. Bereid Afbeelding voor kwantificeringin Imaris
- Open Imaris en zorg ervoor dat het pictogram Volume is geselecteerd in de linker bovenste menu (figuur 2).
- Open eerste kanaal van de bijgesneden afbeelding (een van de kanalen kan eerst worden geopend, consistente gewoon).
- Voeg het andere kanaal (s). Ga naar het menu Bewerken en selecteer Kanalen toevoegen en selecteer het volgende kanaal in het bestand. (Herhaal deze stap voor alle overige kanalen). Opmerking: Om de kleur te veranderen, gaat u naar het venster Beeldscherminstellingen Aanpassingen en klik op de naam van het kanaal (figuur 3A). Dit zal een dialoogvenster om de kleur aan te passen. Als het venster Weergave Instelling niet zichtbaar is, ga naar het menu Bewerken en selecteer Weergave Instelling.
- Pas de pixelwaarden. Ga naar het menu Bewerken en selecteer Eigenschappen afbeelding. In dit venster aanpassen x, y en z pixelwaarden (Deze waarden zijn afhankelijk van de microscoop, objectief, camera, en z-stapsgewijze overname en is te vinden in de software gebruikt om het beeld op te halen).
- Stap 5.5 resulteert in een zeerkleine afbeelding. Resize, klikt u op de Fit icoon in de rechter benedenhoek (figuur 2).
- In het venster Weergave Instelling, de helderheid en het contrast voor elk kanaal aan met de linker-en middelste driehoeken.
6. 3 dimensionaal (3D) Oppervlakte Rendering van de fagocyt
- In de bovenste werkbalk, moet u de Surpass modus is geselecteerd (Figuur 3C).
- In het venster Weergave Instelling, vinkje bij alle kanalen behalve de fagocytensysteem kanaal. Dit zal hen uit het gezichtsveld.
- Klik op de Surface Rendering icoon (figuur 2).
- Een creëren venster wordt weergegeven in de linkerbenedenhoek (Figuur 4A), zorg ervoor dat Segment ROI is uitgeschakeld in deze eerste venster. Klik op de blauwe knop naar voren bij de bodem.
- Pas de smoothing.
- In het volgende venster kiest u de fagocyt kanaal uit het pull-down menu (Figuur 4B). Dit past hethoeveelheid detail die bedekt zijn en moet empirisch worden bepaald (0,1 urn smoothing wordt meestal gebruikt voor microglia).
- Selecteer Absolute drempelwaarden.
- Klik op de blauwe knop naar voren bij de bodem.
- Drempel het beeld.
- Klik op histogram en sleep totdat beeld correct is opgedoken (Figuur 4C). Dit wordt empirisch bepaald door het beeld draaien om ervoor te zorgen de grijze vlakken overlay op de fluorescerende afbeelding zijn een nauwkeurige oppervlak representatie. Opmerkingen: Als u wilt draaien, selecteert Navigeren in de Pointer menu in de rechterbovenhoek van het scherm (Figuur 3B), klik en houd afbeelding te roteren. Om het beeld terug naar de oorspronkelijke oriëntatie, selecteert Origin linksonder in het menu Beeld.
- Klik op de blauwe knop naar voren bij de bodem.
- In het volgende venster, is er een optie om te filteren op elk oppervlak op grootte, etc. Tenzij beeld is zeer luidruchtig, niet filteren en verwijderen van eeny filters die automatisch verschijnen. Klik op de groene pijl aan de onderkant om oppervlakteafwerking waardoor de fagocyt. Een nieuwe set van tabbladen zal verschijnen (figuur 5)
- Indien nodig, verwijder alle oppervlakken die geen deel uitmaken van de fagocytensysteem van belang.
- Zorg ervoor dat de Selecteer optie is geselecteerd in het menu Pointer (Figuur 3B).
- Klik op elk oppervlak te worden verwijderd, zodat het geel wordt. Om meerdere vlakken te verwijderen, klikt u op de oppervlakken, terwijl de knop ingedrukt te houden.
- Klik op Verwijderen onder het tabblad Potlood.
- Selecteren en samenvoegen alle oppervlakken van de fagocyten in een oppervlak.
- Klik op de Funnel (dwz tabblad Filter; figuur 5C).
- Klik op Toevoegen.
- Kies een filter, sleept u het histogram uiterst links (moeten alle oppervlakken geel zijn).
- Ga terug naar het tabblad Potlood en klik Unify.
- Ga naar het tabblad grafiek (figuur 5A (Figuur 5D). Voor het weergeven van meerdere parameters, ga naar de moersleutel icoon onderaan links (figuur 2) en selecteer parameters op te nemen.
- Noteer het volume van de fagocyt en sla het bestand voordat u verder gaat.
7. 3D Surface Rendering van Overspoelde Materiaal
- Maak een nieuw kanaal voor materiaal dat is opgeslokt door de fagocyt.
- Terwijl de fagocyt oppervlak is geselecteerd, klikt u op het tabblad potlood.
- Klik op Alle Mask.
- In de dialoog die verschijnt, selecteer het kanaal dat overeenkomt met overspoeld materiaal (bv, anterograde tracing van presynaptische ingangen; Figuur 5B).
- Controleer dubbele kanaal voor het aanbrengen van het masker en druk op OK.
- Een nieuw kanaal verschijnt in het venster Weergave Instelling dat alleen het materiaal dat is overspoeld bevat en zich in defagocytensysteem.
- Oppervlak maken het kanaal met totale Engulfed en nonengulfed materiaal.
- Vinkje bij alle kanalen in het venster Weergave Instelling, behalve voor het kanaal dat opgedoken en vink het oppervlak gemaakt voor de fagocyt.
- Klik op de Surface rendering pictogram weer (zie stap 6.3) en maak een oppervlak voor het kanaal met dezelfde stappen als beschreven voor de fagocyt (stappen 6,4-6,11). Opmerkingen: Zorg ervoor dat u het juiste kanaal voorafgaand aan de egalisatie en drempelwaarden (stap 6.5; Figuur 4B) te selecteren. Noteer de drempelwaarde (zie stap 6.6; figuur 4C). Deze waarde kan worden verkregen na het oppervlak rendering is voltooid (tab Wand, Figuur 5A).
- Noteer het volume van de totale overspoeld en niet-overspoelde materiaal en sla het bestand voordat u verder gaat.
- Oppervlak maken overspoeld materiaal (materiaal in de fagocytensysteem).
- Visualiseer fluorescentie van slechtshet nieuwe kanaal van verzwolgen materiaal (zie stap 7.2.1).
- Volg dezelfde stappen als hierboven (stappen 7,2-7,3). Opmerkingen: Zorg ervoor dat u het juiste kanaal uit in het keuzemenu kiezen voorafgaand aan het effenen (kies het nieuwe kanaal gemaakt in stap 7.1). In de drempel venster handmatig de drempelwaarde die is ingesteld voor het renderen van de totale overspoeld en niet-overspoelde materiaal (zie stap 7.2.2) in te voeren.
- Noteer het volume van het verzwolgen materiaal en bestand op te slaan voordat u verder gaat.
8. Berekent het totale volume van het gezichtsveld
- Maak een nieuw oppervlak voor elk kanaal.
- In de drempelwaarden venster (stap 6.6), schuif het histogram helemaal naar links, zodat het hele veld is opgedoken.
- Finish oppervlakte het hele veld en noteer het volume (stappen 6,7-6,11).
- Sla het bestand op.
9. Berekent het bedrag van gefagocyteerd Materiaal
- Bereken de dichtheid van detotaal overspoeld en niet-overspoelde materiaal kanaal met het volgende algoritme:
Volume van Total Engulfed en Non-Engulfed Materiaal (stap 7.3) / Volume van Field (stap 8). - Bereken% engulfment per cel met behulp van het volgende algoritme:
(Deel van Engulfed Materiaal (stap 7.5) / totale volume van de fagocyt (stap 6.11)) x 100
Opmerkingen: Ter compensatie van verschillen in celgrootte, worden de gegevens genormaliseerd naar het totale volume van de fagocyt. Als getallen van stap 9.1 zijn zeer variabel over gebieden, kan het nodig zijn om de gegevens van stap 9.2 normaliseren de berekening 9.1.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Recentelijk gebruikten we dit afblazen assay visualiseren en kwantificeren-gemedieerde microglia afblazen van presynaptische inputs in ontwikkelingslanden retinogeniculate (figuur 1) 7. RGC van CX3CR1-EGFP heterozygote muizen anterogradely opgespoord met CTB-594 en CTB-647 in de linker-en rechteroog respectievelijk. Na deze tracing, werden EGFP-positieve microglia in de dLGN afgebeeld. Deze beelden werden vervolgens oppervlak gerenderd voor volume metingen.
Met behulp van deze techniek, vonden we dat tijdens een piekperiode van ontwikkelingsstoornissen synaptische verbouwing binnen de dLGN (P5), presynaptische ingangen worden opgeslokt door microglia (Figuur 6). Zo weinig als 4 dagen later, wanneer een grote hoeveelheid remodeling bijna compleet (P9), er een dramatische vermindering van de hoeveelheid overspoeld ingangen. Bovendien afblazen en snoeien verstoord in muizen die eiwitten behoren tot de klassieke complement cascade(Figuur 6) alsmede na manipulatie van neuronale (gegevens niet getoond) 7.
Figuur 1. Strategy to-microglia gemedieerde afblazen van RGC presynaptische ingangen 7 beoordelen. A) Schematische voorstelling van anterograde tracing strategie. Linker en rechter oog RGC ingangen worden opgespoord met CTB-647 (blauw) en CTB-594 (rood), respectievelijk. -Microglia gemedieerde (groen) afblazen van de ingangen wordt een representatief beeld lage vergroting van postnatale dag 5 (P5) muis dLGN vervolgens beoordeeld. B) volgende anterograde tracing van links (blauw) en rechts (rood) ogen ingangen. Schaal bar = 100 micrometer. Ci) Een microglia (EGFP, groen) bemonsterd uit het grensgebied van links (blauw) en rechts (rood) ogen ingangen (inzet in B). CII) CIII) Oppervlakte teruggeven van microglia en overspoelde RGC ingangen. Rasterstappen lijn = 5 micrometer. Di) Een vertegenwoordiger microglia (groen, EGFP) vanaf P5 dLGN. RGC ingangen zijn voorzien van CTB-594 (rood) en lysosomen zijn voorzien van anti-CD68 (blauw). Dii) Alle CTB fluorescentie buiten de microglia volume is verwijderd onthullend verzwolgen RGC-ingangen (rood) en lysosomen (blauw) in de microglia . (groen) Diii) Meeste RGC-ingangen (rood) worden volledig gelokaliseerd CD68-positieve lysosomen (blauw, witte pijlen) Div-v) De CD68 (Div) en CTB (Dv) kanalen alleen.. Schaal bar = 10 micrometer. Klik hier om een grotere versie van deze afbeelding te bekijken.
Figuur 2. Imaris software iconen.
Figuur 3. Algemene navigatie ramen in software. A) De Etalage Adjustment. B) The Pointer Venster. Selecteer zal de selectie van specifieke oppervlakken mogelijk te maken. Navigeren kan de rotatie van een beeld in het gezichtsveld. C) Het is noodzakelijk om in te overtreffen modus voor oppervlakte waardoor het volume.
Figuur 4. Surface rendering software. A) Het maken venster. B) Glading venster. Selecteer het kanaal aan de oppervlakte van het pull-down menu (geel gemarkeerd). C) drempeling het oppervlak om de fluorescerende afbeelding. Benadrukt door de rode doos is de drempel die moet worden opgenomen voor de totale overspoeld en niet-overspoelde materiaal. Dit aantal zal later worden toegepast op drempel en de oppervlakte van de overspoelde materiaal. Klik hier om een grotere versie van deze afbeelding te bekijken.
Figuur 5. Verkrijgen volumemetingen software. A) Tabs die volgende oppervlak rendering verschijnen. Let op de Wand, Potlood, Trechter, en Graph tabbladen die zijn aangegeven in de tekst. B) The Mask allemaal over naar overspoelde materiaal in de fagocytensysteem visualiseren. Let op het geselecteerde kanaal (yellow doos). C) De functie onder het tabblad Funnel / filter kan de selectie van alle oppervlakken in het veld door het schuiven van de histogram helemaal naar links zodat het lijkt geel. Elke filter kan worden gekozen voor deze. D) Onder het tabblad Grafiek, kunnen volume metingen worden verkregen en vastgelegd. Klik hier om een grotere versie van deze afbeelding te bekijken.
Figuur 6. Representatieve gegevens 7. A) Representatieve oppervlak rendered microglia van P5 (fluorescente beeld wordt getoond in figuur 1), P9 en P30 muis dLGN. Vergrote inzetstukken aangegeven met een zwarte stippellijn.Rasterstappen lijn = 5 micrometer. B) Engulfment van RGC ingangen wordt aanzienlijk verhoogd tijdens de piek snoeien in de dLGN (P5) versus oudere leeftijd (P9 en P30). * P <0,001 met een ANOVA, n = 3 muizen / jaar. C) Microglia van muizen die complementreceptor 3 (KO zwarte staaf) overspoelen significant minder RGC ingangen in vergelijking met WT nestgenoten (witte balk). Alle gegevens zijn genormaliseerd om WT controlewaarden. * P <0,04 door Student's t-test, n = 3 muizen / genotype. Alle foutstaven vertegenwoordigen sem Klik hier voor grotere afbeelding.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Om fagocytose nauwkeurig moet overspoeld materiaal zodanig dat de onderzoeker kan visualiseren wanneer lysosomale degradatie opgetreden gelabeld. Bovendien is een hoge resolutie beeldvorming vereist, gevolgd door het gebruik van software die de onderzoeker in staat stelt het volume van de hele cel visualiseren en kwantificeren van de inhoud. In dit protocol beschrijven we een zeer betrouwbare en kwantitatieve werkwijze voor het meten fagocyt-gemedieerde afblazen met CTB geconjugeerd met Alexa kleurstoffen overspoeld materiaal met een zeer nauwkeurige confocale microscopie en 3D reconstructie label. Deze methode werd gebruikt in ons lab aan microglia gemedieerde-afblazen van presynaptische ingangen ondergaan synaptische verbouwing in de ontwikkelende hersenen van muizen (retinogeniculate systeem) 7 succes te analyseren. Daarnaast blijkt het een zeer gevoelige techniek die subtiele veranderingen in afblazen in verschillende ontwikkelingsstadia leeftijden unde kunnen onderscheiden wordenr niet-pathologische omstandigheden en tussen wildtype en knockout muizen. Met kleine aanpassingen kan dit protocol worden aangepast aan engulfment studeren in levende weefsels door time lapse beeldvorming. Bovendien kan dit protocol worden toegepast fagocyt-neuron interacties bij de ziekte te bestuderen.
Voorbehoud
Een van de meest bruikbare aspecten van deze test is het vermogen om neuronale uitsteeksels label zodanig dat deze zichtbaar na het invoeren van een lysosomale degradatie pad blijven. Omdat de neuron gelabeld, kan het moeilijk te onderscheiden welk deel van de cel is gefagocyteerd. Dit vereist een zorgvuldige regionale analyse (bijv. synaptische regio versus een niet-synaptische gebied van de dLGN) in combinatie met elektronenmicroscopie 7. Bovendien kan dit moeilijker blijken in andere gebieden van de hersenen waar de neuronale cellichamen en projecties in hetzelfde gebied wonen. Echter kunnen alternatieve etikettering te worden toegepast (zie below). Bovendien, vanwege de beperkt de lichtmicroscopie, is er een mogelijkheid dat men de hoeveelheid overspoeld materiaal overschatten. Bijgevolg moet men zich ervan te valideren dat overspoeld materiaal in lysosomen. Daarom maken we gebruik van anti-CD68 naar lysosomen label binnen microglia, 3D-rendering, en orthogonale uitzicht op de parameters van de test te valideren.
Celtypen
Naast microglia, zou deze methoden worden toegepast om de rol van andere fagocyten in de hersenen (bijvoorbeeld astrocyten) en het perifere zenuwstelsel, het immuunsysteem (bijv. perisynaptic Schwann-cellen, macrofagen, enz.) te analyseren. Bovendien, omdat CTB geconjugeerd aan Alexa kleurstoffen is zo gemakkelijk opgenomen door de meeste cellen een vergelijkbare kenmerken strategie kan worden gebruikt om materiaal overspoeld door de hersenen en andere orgaansystemen label.
Etikettering van Overspoelde Materiaal
Als een alternatieve CTB geconjugeerd met Alexa kleurstoffen, hebben we de volgende strategieën overspoeld materiaal 7 label: 1) Fluorescente reporter muizen waarin RGC werden gelabeld met een fluorescerend proteïne (bijv. tdTomato, EGFP, enz.). 2) Anterograde labeling met een pHrodo kleurstof geconjugeerd aan dextran, een kleurstof die slechts fluoresceert wanneer het in een lysosoom. Met behulp van deze verschillende strategieën, kan visualisatie en kwantificatie van verzwolgen presynaptische ingangen binnen microglia zijn performedwith dezelfde beeldvorming en kwantificatie technieken. De Alexa kleurstof conjugaten zijn de meest robuuste vanwege de hoge weerstand van Alexa kleurstof 7,21 lysosomale hydrolasen. Bovendien is het kenmerken van overspoeld materiaal met antilichamen (bijvoorbeeld anti-VGlut2 een presynaptische vesiculaire eiwit) geprobeerd. Dit is echter een relatief onbetrouwbare detectie aangezien de meeste eiwitten snel neer eenmaal worden afgebroken lysosomen. Het is moeilijk om lage fluorescentie vanwege onderscheidenom eiwitafbraak over achtergrond.
Dieren Gebruikt
In het huidige protocol, worden microglia fluorescent genetisch gelabeld met fluorescerende reporter muizen (CX3CR1-EGFP) 22. Er zijn echter gevallen waarin antilichaamidentificatie versus genetische expressie van fluorescerende reporter constructen noodzakelijk. Bijvoorbeeld, wanneer fluorescerende reporter muizen zijn niet beschikbaar voor de fagocyt van belang, het gebruik van ratten nodig is, of de onderzoeker wenst te kijken naar knock-out muizen zonder het oversteken van hen in een fluorescerende reporter muis lijn. Voor gevallen zoals deze kan fagocyten middels immunohistochemie worden gemerkt en gegevens vergelijkbaar met de resultaten uit experimenten met fluorescerende reporter muizen 7. Na weefsel snijden, we gebruiken meestal een standaard immunostaining protocol voor drijvende secties 7. Het is belangrijk dat een antilichaam opgewekt tegen een eiwit dat de gehele cel label kiezen enhaar processen. Bijvoorbeeld etiket microglia, anti-Iba1 worden gebruikt.
Bredere Toepassingen: Live-Imaging en Ziektepreventie
Hoewel dit protocol is gebaseerd op een analyse van vaste weefsel, zou lichte wijzigingen dezelfde analyse in beelden die door live-beeldvorming mogelijk te maken. Na een time lapse imaging sessie, kan de volgende z-stacks identiek aan stappen 4-9 in dit protocol worden verwerkt. Verder terwijl we dit protocol toegepast op afblazen van synapsen visualiseren tijdens ontwikkeling synaptische remodellering in de gezonde CZS dit protocol kunnen worden toegepast ziektemodellen. In het bijzonder kan dit protocol worden gebruikt om ziekten waarbij synapsen aanzienlijke remodeling ondergaan, zoals in het geval van verlies van synapsen regeneratie studie na ruggenmergletsel vroege synapsverlies geassocieerd met de ziekte van Alzheimer, enz. 12,14-19,23 - 26. Daarnaast kan men ook deze techniek aan ziekten te bestuderen waarin phagocytosis materiaal dan synapsen is beschreven, zoals microglia / macrofaag gemedieerde engulfment van myeline in demyeliniserende aandoening (bijvoorbeeld multiple sclerose) en afblazen van beta-amyloïde in de ziekte van Alzheimer 5,6,27-29.
Concluderend, de engulfment assay beschreven biedt een handige, reproduceerbare en gevoelige techniek voor fagocyt interacties met de extracellulaire omgeving te bestuderen. Belangrijk is dat deze test heeft een breed scala van toepassingen en mogelijkheden die de neurowetenschappen evenals degenen die werkzaam zijn in andere orgaansystemen zal dienen.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Geen belangenconflicten verklaard.
Acknowledgments
Werk werd ondersteund door subsidies van de Smith Family Foundation (BS), Dana Foundation (BS), John Merck Scholars Program (BS), NINDS (RO1-NS-07100801, BS), NRSA (F32-NS-066698; DPS), Nancy Lurie Marks Foundation (DPS), NIH (P30-HD-18655; MRDDRC Imaging Core).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Heat pad | Vet Equip, Inc. | 965500 | |
| Warm water source for heat pad | Kent Scientific | TP-700 | |
| Stereo microscope | DSC Optical | Zeiss Opmi -6 Surgical Microscope | |
| Sliding microtome with freezing stage | Leica | SM2010 R | |
| Microtome blade | Leica | 14021607100 | |
| Fluorescent dissecting microscope | Nikon | SMZ800 with Epi-fluorescence attachment | |
| Spinning disk confocal microscope | Perkin Elmer | UltraView Vox Spinning Disk Confocal | |
| 10 µl Hamilton gas tight syringes | Hamilton | 80030 | Use a different syringe for each color dye/tracer |
| Hamilton needles | Hamilton | 7803-05, specifications: blunt, 1.5" | |
| Alexa-conjugated cholera toxin β subunit (CTB) | Invitrogen | 488: C22841 | Reconstitute in sterile saline, 80 µl (488), 100 µl (594), 20 µl (647) |
| 594: C22842 | |||
| 647: C34778 | |||
| Phosphate Buffered Saline (PBS) | Sigma | P4417-50TAB | |
| Neomycin and Polymyxin B Sulfates and Bacitracin Zinc Ophthalmic Ointment USP (antibiotic ointment) | Bausch & Lomb | 24208-780-55 | |
| 30.5 G needle | Becton Dickinson | 305106 | |
| Spring scissors | Roboz | RS-5630 | |
| Cotton-tipped applicator | Fisher | 23-400-125 | |
| Paraformaldeyde (PFA) | Electron Microscopy Sciences | 15710 | Dilute 16% to 4% in PBS. Paraformaldehye is toxic, use in a fume hood and wear personal protective equipment. |
| Dissection tools – scissors, forceps, spatula | Small scissors: Fine Science Tools | Small scissors:14370-22 | |
| Large scissors: Roboz | Large scissors: RS-6820 | ||
| #55 forceps: Fine Science Tools | #55 forceps: 11255-20 | ||
| Spatula: Ted Pella, Inc. | Spatula: 13504 | ||
| Sucrose | Sigma | S8501-5KG | Make 30% sucrose in PBS (weight/vol) |
| OCT Compound | VWR | 25608-930 | |
| Weigh boat | USA Scientific | 2347-1426 | |
| 24-well plates | BD Biosciences | 353047 | |
| Sodium phosphate monobasic | Sigma | S6566-500G | Make 0.2 M sodium phosphate monobasic (PB-A) in ddH2O and 0.2 M sodium phosphate dibasic (PB-B) in ddH2O. To make 0.1 M PB, combine 19 ml PB-A and 81 ml PB-B, fill to 200 ml with ddH2O |
| Sodium phosphate dibasic | Sigma | S5136-500G | |
| Coverslips, 22 X 50 mm, No. 1.5 | VWR | 48393 194 | |
| Charged microscope slide | VWR | 48311-703 | |
| Vectasheild | Vector Laboratories | H-1200 |
References
- Ransohoff, R. M., Perry, V. H. Microglial physiology: unique stimuli, specialized responses. Annu Rev Immunol. 27, 119-145 (2009).
- Aguzzi, A., et al. Microglia: scapegoat, saboteur, or something else. Science. 339 (6116), 156-161 (2013).
- Tremblay, M. E., et al. The role of microglia in the healthy brain. J Neurosci. 31 (45), 16064-16069 (2011).
- Hanisch, U. K., Kettenmann, H. Microglia: active sensor and versatile effector cells in the normal and pathologic brain. Nat. Neurosci. 10 (11), 1387-1394 (2007).
- Sierra, A., et al. Janus-faced microglia: beneficial and detrimental consequences of microglial phagocytosis. Front Cell Neurosci. 7, (2013).
- Dheen, S. T., et al. Microglial activation and its implications in the brain diseases. Curr Med Chem. 14 (11), 1189-1197 (2007).
- Schafer, D. P., et al. Microglia sculpt postnatal neural circuits in an activity and complement-dependent manner. Neuron. 74 (4), 691-705 (2012).
- Katz, L., Shatz, C. Synaptic activity and the constuction of cortical circuits. Science. 274 (5290), 1133-1138 (1996).
- Sanes, J. R., Lichtman, J. W. Development of the vertebrate neuromuscular junction. Annu Rev Neurosci. 22, 389-442 (1999).
- Hua, J. Y., Smith, S. J. Neural activity and the dynamics of central nervous system development. Nat Neurosci. 7 (4), 327-332 (2004).
- Holtmaat, A., Svoboda, K. Experience-dependent structural synaptic plasticity in the mammalian brain. Nat Rev Neurosci. 10 (9), 647-658 (2009).
- Butz, M., et al. Activity-dependent structural plasticity. Brain Res Rev. 60 (2), 287-305 (2009).
- Bruel-Jungerman, E., et al. Brain plasticity mechanisms and memory: a party of four. Neuroscientist. 13 (5), 492-505 (2007).
- Schafer, D. P., Stevens, B. Synapse elimination during development and disease: immune molecules take centre stage. Biochem Soc Trans. 38 (2), 476-481 (2010).
- Alexander, A., et al. The complement system: an unexpected role in synaptic pruning during development and disease. Annu Rev Neurosci. 35, 369-389 (2012).
- Brown, A., Weaver, L. C. The dark side of neuroplasticity. Exp Neurol. 235 (1), 133-141 (2012).
- Navarro, X. Chapter 27: Neural plasticity after nerve injury and regeneration. Int Rev Neurobiol. 87, 483-505 (2009).
- Tan, A. M., Waxman, S. G. Spinal cord injury, dendritic spine remodeling, and spinal memory mechanisms. Exp Neurol. 235 (1), 142-151 (2012).
- Wolpaw, J. R., Tennissen, A. M. Activity-dependent spinal cord plasticity in health and disease. Annu Rev Neurosci. 24, 807-843 (2001).
- Schafer, D. P., et al. The "quad-partite" synapse: Microglia-synapse interactions in the developing and mature CNS. Glia. 61 (1), 24-36 (2013).
- Mukhopadhyay, S., et al. Manganese-induced trafficking and turnover of the cis-Golgi glycoprotein GPP130. Mol Biol Cell. 21 (7), 1282-1292 (2010).
- Jung, S., et al. Analysis of fractalkine receptor CX(3)CR1 function by targeted deletion and green fluorescent protein reporter gene insertion. Mol Cell Biol. 20, 4106-4114 (2000).
- Knobloch, M., Mansuy, I. M. Dendritic spine loss and synaptic alterations in Alzheimer's disease. Mol Neurobiol. 37 (1), 73-82 (2008).
- Masliah, E., et al. Synaptic remodeling during aging and in Alzheimer's disease. J Alzheimers Dis. 9 (3 Suppl), 91-99 (2006).
- Yoshiyama, Y., et al. Synapse loss and microglial activation precede tangles in a P301S tauopathy mouse model. Neuron. 53 (3), 337-351 (1016).
- Milnerwood, A. J., Raymond, L. A. Early synaptic pathophysiology in neurodegeneration: insights from Huntington's disease. Trends Neurosci. 33 (11), 513-523 (2010).
- Noda, M., Suzumura, A. Sweepers in the CNS: Microglial Migration and Phagocytosis in the Alzheimer Disease Pathogenesis. Int J Alzheimers Dis. , (2012).
- Rotshenker, S. Microglia and macrophage activation and the regulation of complement-receptor-3 (CR3/MAC-1)-mediated myelin phagocytosis in injury and disease. J Mol Neurosci. 21 (1), 65-72 (2003).
- Smith, M. E. Phagocytosis of myelin in demyelinative disease: a review. Neurochem Res. 24 (2), 261-268 (1999).
