Summary
מיקרוגליה הם התאים חיסוניים תושב של מערכת העצבים המרכזית (CNS) עם קיבולת גבוהה לphagocytose או לבלוע את חומר בסביבה תאית שלהם. הנה, assay החלים רחב, אמין, וכמותי מאוד להדמיה ומדידת היבלעות בתיווך מיקרוגליה של רכיבים סינפטיים מתואר.
Abstract
Phagocytosis הוא תהליך שבו תא בולע חומר (כל תא, חלקי תא, פסולת, וכו ') בסביבה תאית המקיפה אותה ולאחר מכן מעכל את החומר הזה, בדרך כלל באמצעות השפלה lysosomal. מיקרוגליה הם התאים חיסוניים תושב של מערכת העצבים המרכזית (CNS) שphagocytic פונקציה שתואר במגוון רחב של תנאים ממחלה ניוונית של מערכת עצבים (, אישור לדוגמא בטא עמילואיד במחלת אלצהיימר) להתפתחות של המוח בריא (למשל, הסינפטי גיזום) 1-6. הפרוטוקול הבא הוא assay היבלעות פותח כדי לחזות ולכמת היבלעות בתיווך מיקרוגליה של תשומות presynaptic במערכת retinogeniculate עכבר פיתוח 7. בעוד assay זה שימש להערכת תפקוד מיקרוגליה בהקשר המסוים הזה, בגישה דומה ניתן להשתמש כדי להעריך phagocytes אחר בכל רחבי המוח (למשל, האסטרוציטים) ושאר הגוף(למשל, מקרופאגים היקפיים), כמו גם בהקשרים אחרים שבהם שיפוץ הסינפטי מתרחש (למשל, פגיעה במוח / מחלה).
Introduction
מעגלי Synaptic לשפץ לאורך החיים של בעלי חיים. במוח המתפתח, הסינפסות יוצרות עודפות וחייבות לעבור גיזום הסינפטי הכולל את ההסרה סלקטיבית של קבוצת משנה של סינפסות ותחזוקה וחיזוק של סינפסות אלה שנותר 8-10. תהליך זה הוא הכרחי כדי להשיג אופייני קישוריות המדויקת של מערכת העצבים הבוגרת. במבוגרים, סינפסות יכולות להיות גם פלסטיק, במיוחד בהקשר של למידה וזיכרון. הקושרת המבנית של פלסטיות זה חשב לכלול את התוספת ו / או חיסול של קוצים הדנדריטים וboutons presynaptic 11-13. בנוסף לתפקידים אלה במערכת העצבים בריאה, שיפוץ הסינפטית מעורב גם ב12,14,15 מחלה של מערכה / פציעת עצבים. כך למשל, בעקבות פגיעה בחוט השדרה, האקסונים נותקו חייבים לאחר מכן לשפץ ויוצרים סינפסות חדשות כדי להשיג 16-19 התאוששות תפקודי.
NT "> מתעוררים כהיבט חשוב של פלסטיות הסינפטית הוא התהליך של phagocytosis או היבלעות של סינפסות המיועדות להסרת 3,5,20. לאחרונה הראו תופעה זו בהקשר של גיזום הסינפטי במוח בריא, לאחר הלידה העכבר 7. באופן ספציפי , מיקרוגליה, תושב התאים חיסוניים במערכת העצבים המרכזית וphagocytes, הוצגו לבלוע תשומות presynaptic במהלך תקופת שיא ובאזור של גיזום הסינפטי התפתחותי, הגרעין לאחר הלידה הגבי לרוחב הברכיתיים (dLGN) של התלמוס. מצור גנטי או תרופתי של היבלעות זו הביא לגירעונות מתמשך בקישוריות הסינפטית.בפרוטוקול זה, אנו מתארים assay אמין וכמותי מאוד למדוד היבלעות בתיווך תא בלען של תשומות סינפטי. לענין סעיף זה, assay זה יוצג בהקשר של מערכת פיתוח retinogeniculate, הכוללת תאי הגנגליון ברשתית (RGCs) המתגוררת ברשתית כיפרויקט תשומות presynaptic לdLGN (איור 1 א). כדי להתחיל, אסטרטגית תיוג lysosomal השפלה עמידה אנטרוגדית תתואר, המשמשת כדי להמחיש תשומות presynaptic RGC ספציפיות בdLGN (איור 1) 7,21. בעקבות התיאור הזה, מתודולוגיה מפורטת להדמיה ומדידת כמותית היבלעות באמצעות מיקרוסקופיה confocal בשילוב עם 3 ממדים (3D) משטח נפח טיוח יינתן. מתודולוגיה זו מבוססת על הכנת רקמה קבועה, אך עשוי גם להיות מותאמת לשימוש בבדיקות הדמיה בשידור חי. חשוב מכך, בזמן שassay אומת בהקשר של מערכת retinogeniculate בריאה, לאחר הלידה, ניתן היה להחיל את אותן טכניקות כדי להעריך אינטראקציות אחרות התא בלען נוירון בכל רחבי המוח, ובמהלך המחלה, כמו גם תפקוד תא בלען במערכות איברים אחרים.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. אנטרוגרדית תיוג של תשומות Presynaptic RGC
הערה: כל הניסויים של השימוש בבעלי חיים נבדקו ופיקוח של ועדת טיפול בבעלי החיים ושימוש המוסדית (IACUC) בהתאם לכל הנחיות NIH.
- לעקר שדה ומכשירים.
- הרדימי עכבר עם isoflurane 4% כרך בחדר אינדוקציה פרספקס (isoflurane% כרך זה עובד על עכברי יילודים למבוגרים). שים לב לעכברים הדוק כדי למנוע יתר ההרדמה. זהירות: הימנע משאיפה עם פינוי גז פסולת ואקום.
- אחרי 1-3 דק ', (עכברים מבוגרים ידרשו פחות זמן) להבטיח רמה הנאותה של הרדמה מושגת על ידי צובט את הזנב (אין תגובה צריכה להיות שנצפתה) והתבוננות קצב נשימה (קצב צריך להיות איטי ויציב).
- העבר את העכבר מתחת למיקרוסקופ סטריאו בחרטומו בצד ואת מקומה אספקת 3-4 isoflurane% כרך על החוטם (ילודים <יום הלידה 10 (P10) ~ 4% כרך;> P10 ~ 3% כרך).
- לחשוף את לובן העין. להזרקה של ילודים לפני פתיחת העין, השתמש במספריים באביב קטנים כדי לפתוח את העפעף ולמשוך בחזרה את העור כדי לחשוף את לובן העין. לעכברים מבוגרים, להשתמש באצבעות כדי למשוך בחזרה את העור שמסביב לעין כדי לחשוף את לובן העין. זהירות: בילודים, לפעמים קיצוץ נוסף בניצב בפינה של העין היא הכרחית. היזהר בעת חיתוך הפינה של העפעף כפי שיש כלי דם שאם לחתוך, ידממו יתר על המידה.
- שימוש במחט סטרילית G 30.5 לנקב חור קטן בצד של העין בקו שבו בלובן העין מתחילה. תשמור על עצמך כדי למנוע נזק לעדשה על ידי החדרת המחט רק רחוק מספיק שפוע הולך לתוך העין.
- לאפשר לזגוגית לזרום החוצה מהבור ולהשתמש המוליך כותנה שקצה סטרילי כדי לספוג את הנוזל.
- ברגע שהזגוגית הפסיקה זורמת מתוך החור, להכניס מחט הסתיימה בוטה מצורפת מזרק המילטון מראש עם צבע אנטרוגדית התחקותלתוך החור. זהירות: הכנס מחט באיטיות כדי למנוע ניקוב הצד של העין האחר או פגיעה בעדשה.
- לאט לאט להזריק צבע לתוך העין. בדרך כלל, רעלן הכולרה β המקטע מצומדת ל594 Alexa, 647, או 488 (CTB-594, CTB-647, או CTB-488, 5-6 מיקרוגרם / μl) משמש לanterogradely תשומות RGC עקבות. לילודים (P10 ≤) 1-2 μl מספיק ולעכברים> P10 ~ 3 μl מספיק. הערה: צבעי Alexa הם עמידים במיוחד לשפלת lysosomal
- השאר את המחט לתוך החור לכמה שניות ולאחר מכן להסיר באיטיות.
- השתמש המוליך כותנה שקצהו כדי לספוג את נוזלים עודפים ולמנוע מצבע דולף החוצה.
- למרוח כמות קטנה של משחה אנטיביוטית לעין. אם העין נפתחה בניתוח, בעדינות למקם את העפעפיים יחד.
- אם הזרקה בשני העיניים, לחזור על הליך בעין השנייה.
- הזרקה (ים) הבא, להשאיר את העכבר תחת מנורת חום או על משטח חום עד שהוא מתחיל להתאושש מanesthesia.
- חזור עכבר לכלוב בבית נקי ולפקח כדי לוודא שהוא ער לחלוטין לפני ההחזרה למושבה.
2. הכן רקמות הדמיה
פרוטוקול הכנת רקמה זו משמש לעכברי כתב שבי phagocytes מסומנים עם סמני ניאון (למשל, CX3CR1-EGFP למיקרוגליה). אם קו כתב אינו זמין, החוקר יכול immunostain סעיפי רקמות (ראה דיון).
- ~ 24 שעות לאחר ההזרקה, להקריב את העכבר ולנתח את המוח.
- זרוק לתקן את המוח בצינור פלקון מלא paraformaldehyde 4% (PFA) הלילה ב 4 ° C. זהירות: PFA הוא רעיל. הימנע משאיפה וחשיפת עור על ידי השימוש במנדף או על שולחן downdraft ולובש ציוד מגן אישי. הערות: הקיבוע יכול להיות קצר יותר (≥ 4 שעות). בנוסף, במקום לתקן טיפה, 4% זלוף PFA יכול לשמש אחריו לתקן 2-24 ירידת שעה. עם זאת, השוואה של ינקבד לרדת מוחות יילודים ומבוגרים קבועים עולה כי אין הבדל באיכות תמונה או כימות.
- יש לשטוף 3x המוח בופר פוספט (PBS).
- יוצקים את המוח וPFA לתוך סירה שוקל ריקה.
- השתמש במרית כדי להעביר את המוח למשנהו לשקול סירה מלאה PBS.
- מוח לשטוף פעמיים נוספות ב-PBS (מוח העברה לשני יותר לשקול סירות מלאות PBS).
- להעביר את המוח לצינור פלקון מלא בתמיסת סוכרוז 30%. השאר את המוח בסוכרוז על 4 מעלות צלזיוס עד למוח שוקע לחלק התחתון של הצינור (24-48 hr).
- ברגע שהמוח כיורים, להכין את המוח לחתך. השלבים הבאים הם הכנת 40 מיקרומטר סעיפים צפים באמצעות microtome הזזה עם שלב הקפאה (יכולה לשמש גם cryostat).
- השתמש בסכין גילוח כדי להסיר חלקים של המוח שאינם נחוצים (לdLGN, להסיר את החלקים מקורי ואת הזנב של המוח).
- להקפיא את החזייהברדיד אלומיניום מעל קרח יבש. במהלך תקופה זו, להקפיא את שלב microtome ולמלא היטב בכל צלחת 24 גם עם 0.5 מיליליטר של M 0.1 חיץ פוספט (PB).
- הר את המוח הקפוא (הוא אמור להופיע אטום) על הבמה מנקודת הקיפאון.
- למרוח כמות קטנה של מתחם טמפרטורה אופטימלי חיתוך (אוקטובר) לבמה.
- ברגע שאוקטובר מתחיל לקפוא, להניח את המוח באוקטובר סוף המוח שיהיה לחתוך צריך להיות כלפי מעלה (לדוגמא, לdLGN, להתמודד עם צד הזנב למעלה).
- לכסות את המוח ואוקטובר עם קרח יבש כתוש דק דק.
- עזוב את הקרח יבש על המוח / אוקטובר ל~ 30 שניות.
- השתמש במברשת צבע גדולה כדי להסיר את הקרח היבש. המוח ואוקטובר יש להקפיא לבמה.
- בגין חתך דרך הרקמה עד שיגיע לאזור של עניין (ROI).
- ברגע שמגיע ההחזר על ההשקעה, להשתמש במברשת צבע קטנה להסרת חלקים מהלהב ולהעביר אותם לפלאט 24 גםדואר המכיל 0.1 M PB (צעד 2.5.2). שמור את מברשת הצבע לח על ידי הרטבתו ב0.1 M PB לפני הסרת חלקים מהלהב. הערה: ניתן להשאיר סעיפים ב0.1 M PB לילה בשעה 4 ° C.
- ברגע שקטעים כבר נאספו, לדמיין את תיוג אנטרוגדית תחת מיקרוסקופ לנתח ניאון ולבחור קטעים המכילים את ההחזר על ההשקעה.
- הר סעיפים בשקופית עם מברשת צבע קטנה.
- תחול בריכה קטנה של 0.1 M PB לשקופית מיקרוסקופ עמלה.
- העבר את קטע הרקמה לבריכה של PB.
- השתמש PB ומברשת צבע למזרח והתפשט לרקמות.
- השתמש Kimwipe לפתיל את PB העודף. תשמור על עצמך כדי להימנע מהפתילה את הסעיף.
- לאפשר לאוויר יבש לחלוטין.
- החל טיפה קטנה של מדיום הרכבה לכל סעיף והר coverslip על גבי (22 x 50 מ"מ, מס '1.5).
- לאטום קצוות של שקופיות עם לק ולאחסן ב -20 ° C עד פגישת הדמיה. הערה: למרות שהדמיה עםבשבוע של ההכנה מומלץ, יכולות להישמר שקופיות ב -20 מעלות צלזיוס במשך כמה שבועות לפני ההדמיה.
3. רקמות הדמיה
כל התמונות שנרכשו על מיקרוסקופ confocal דיסק מסתובב (דיסק מסתובב UltraView ווקס מיקרוסקופ confocal מצויד בלייזרי דיודה (405 ננומטר, 445 ננומטר, 488 ננומטר, 514 ננומטר, 561 ננומטר, ו640 ננומטר)). יכולות גם להיות שנרכשו תמונות על כל מיקרוסקופ עם היכולת לרכוש Z-ערימות ברזולוציה גבוהה (למשל, לייזר סריקת מיקרוסקופ confocal, מיקרוסקופ epifluorescent אחרי deconvolution, וכו '). גודל מסגרת הוא בדרך כלל 1,000 x 1,000 פיקסלים.
- מצא את ההחזר על ההשקעה בהגדלה 10X ולרכוש תמונה. הדמיה מיקרוגליה במערכת retinogeniculate, ההחזר על ההשקעה הוא סעיפי dLGN המדיאלי ביותר.
- Shift להגדלה גבוהה יותר (אובייקטיבי 60x תכנית Apo, NA = 1.4, משמש בדרך כלל).
- לרכוש שדה ראשון מבט המכיל phagocytes באמצעות 0.2 מיקרומטר Z-צעדs.
- לרכוש 15-19 שדות נוספים המכילים phagocytes לכל בעל חיים.
4. הכנת תמונות לכימות (ImageJ)
- Z-מחסנית פתוחה בImageJ.
- לכו לתפריט התמונה, צבע נבחרים וערוצי פיצול.
- לחסר רקע מהערוץ (ים) המכיל את החומר נבלע.
- בחר בחלון הערוצים המכיל את החומר נבלע (למשל, תשומות סינפטי).
- לכו לתפריט התהליך ובחר רקע חיסור. השתמש ברדיוס כדור מתגלגל של 10 פיקסלים למעקב אנטרוגדית תשומות presynaptic בdLGN. הערה: רדיוס הכדור המתגלגל נקבע באופן אמפירי. עם זאת, יש בדרך כלל להיות גדול כמו הרדיוס של האובייקט הגדול בתמונה שאינה חלק מהרקע.
- להחליק את הערוץ המכיל את תא בלען.
- בחר בחלון הערוצים המכיל את תא בלען (למשל, מיקרוגליה).
- לכו לתפריט התהליך וselect מסננים, Mean. שימוש במסנן ממוצע של 1.5 (זה מחליק את התמונה לעיבוד פני השטח בשלבים מאוחר יותר).
- לחסר רקע מהערוץ המכיל את תא בלען.
- בחר בחלון הערוצים המכיל את תא בלען (למשל, מיקרוגליה).
- לכו לתפריט התהליך, בחר רקע לחסר (הגדרות יצטרכו לקבוע באופן אמפירי). השתמש ברדיוס כדור מתגלגל של 50 פיקסלים למיקרוגליה EGFP חיובי.
- מיזוג ערוצים על ידי לחיצה על תפריט התמונה ובחירת צבע, מיזוג ערוצים.
- ההחזר על ההשקעה של יבול המכילה תא בלען מקובץ התמזג (זה הופך את פני השטח עיבוד מהיר יותר, ראה שלב 5).
- צייר תיבה מסביב להחזר על ההשקעה באמצעות כלי בחירות המלבני בסרגל הכלים.
- לכו לתפריט Image ובחר Crop.
- פיצול ערוצים שוב (ראה שלב 4.2).
- להציל את כל ערוץ כקובץ TIFF משלו.
5. הכן את התמונה לכימותבImaris
- Imaris הפתוח ולוודא כי סמל עוצמת הקול שנבחר בתפריט השמאלי העליון (איור 2).
- הערוץ הראשון פתוח של תמונה חתוכה (כל הערוצים ניתן לפתוח ראשון, רק להיות עקבי).
- הוספת הערוץ האחר (ים). עבור לתפריט עריכה, בחר להוסיף ערוצים ובחר את הערוץ הבא בקובץ. (חזור על שלב זה עבור כל ערוצים שנותרו). הערה: כדי לשנות את הצבע, ללכת לחלון התאמת תצוגה ולחץ על שם הערוץ (איור 3 א). זה יביא את תיבת דיאלוג כדי להתאים את הצבע. אם חלון התאמת התצוגה אינו גלוי, ללכת לתפריט עריכה ובחר התאמת תצוגה.
- התאם את ערכי פיקסל. לכו לתפריט Edit ובחר באפשרות מאפייני תמונה. בחלון זה, להתאים את x, y, z וערכי פיקסל (ערכים אלו תלויים במיקרוסקופ, אובייקטיבי, מצלמה, ורכישת Z-צעד וניתן למצוא בתוכנה ששמשה לרכישת התמונה).
- שלב 5.5 יגרום מאודתמונה קטנה. כדי לשנות את הגודל, לחץ על סמל Fit בפינה ימנית התחתונה (איור 2).
- בחלון התאמת תצוגה, להתאים את הבהירות והניגודיות לכל ערוץ באמצעות משולשי שמאל ואמצע.
6. 3 Rendering ממדי (3D) פני שטח של תא בלען
- בסרגל הכלים העליון, כדי להיות בטוח במצב לעלות נבחר (איור 3 ג).
- בחלון התאמת תצוגה, בטל את כל הערוצים חוץ מערוץ תא בלען. פעולה זו תסיר אותם משדה הראייה.
- לחץ על סמל Rendering השטח (איור 2).
- חלון ליצור יוצג בפינה השמאלית התחתונה (איור 4 א), לוודא את ההחזר על ההשקעה של מגזר היא לא בדוק בחלון הראשון הזה. לחץ על לחצן קדימה הכחול בתחתית.
- התאם את ההחלקה.
- בחלון הבא, בחר בערוץ תא בלען מהתפריט לנתץ (איור 4). זה מתאים אתכמות הפרטים שיהיה על פני השטח וצריך להיקבע באופן אמפירי (0.1 החלקת מיקרומטר משמשת בדרך כלל למיקרוגליה).
- בחר thresholding המוחלט.
- לחץ על הכפתור הכחול קדימה בתחתית.
- סף את התמונה.
- לחץ על היסטוגרמה וגרור עד שהתמונה עלתה כראוי (איור 4C). זה נקבע באופן אמפירי על ידי החלפה של התמונה על מנת להבטיח את המשטחים האפורים מעולף על תמונת הניאון הם ייצוג פני השטח מדויק. הערות: כדי לסובב, בחר נווט בתפריט פוינטר בצד הימני העליון של המסך (איור 3), לחץ והחזק תמונה כדי לסובב. כדי להחזיר את התמונה לכיוון מקורי, תחתון מקור בחר שמאל מתפריט התצוגה.
- לחץ על הכפתור הכחול קדימה בתחתית.
- בחלון הבא, יש אפשרות לסנן את כל משטחים על פי גודל, וכו 'אלא אם כן תמונה היא מאוד רועשת, לא לסנן ולמחוקמסנני y שיופיעו באופן אוטומטי. לחץ על החץ הירוק בתחתית כדי לסיים את פני השטח טיוח תא בלען. סט חדש של כרטיסיות יופיע (איור 5)
- במידת צורך, למחוק את כל משטחים שאינם חלקים מתא בלען של עניין.
- ודא כי אפשרות בחירה נבחרה בתפריט פוינטר (איור 3 ב).
- לחץ על כל משטח למחיקה, כך שהוא הופך לצהוב. יש להסיר משטחים מרובים, לחץ על המשטחים תוך כדי החזקת לחצן הבקרה.
- לחץ על מחק תחת לשונית העיפרון.
- בחר ולמזג את כל פני השטח של תא בלען למשטח אחד.
- לחץ על המשפך (כרטיסייה כלומר סינון; איור 5 ג).
- לחץ על הוסף.
- בחר כל מסנן, גרור את ההיסטוגרמה לשמאל קיצוני (כל המשטחים צריכים להיות צהובים).
- חזור לכרטיסיית העיפרון ולחץ על פיוס ביניהם.
- עבור לכרטיסיית הגרף (איור 5A (איור 5D). להצגת מספר פרמטרים, ללכת לסמל מפתח ברגים בפינה השמאלית התחתונה (איור 2) ובחר פרמטרים להקליט.
- רשום את נפח תא הבלע ולשמור את הקובץ לפני שתמשיך.
7. Rendering משטח 3D של נבלע חומר
- ליצור ערוץ חדש לחומר שנבלע על ידי תא בלען.
- אמנם על פני השטח תא בלען נבחר, לחץ על כרטיסיית העיפרון.
- לחץ מסכת הכל.
- בדיאלוג שיופיע, בחר את הערוץ המתאים לחומר נבלע (למשל, איתור אנטרוגדית תשומות presynaptic; איור 5 ב).
- בדוק ערוץ כפול לפני מריחת מסכה ופגע אישור.
- ערוץ חדש יופיע בחלון התאמת תצוגה המכיל רק את החומר שכבר נבלע ונמצא בישובתא בלען.
- פני השטח לעבד את הערוץ מכיל חומר נבלע וnonengulfed מוחלט.
- בטל את כל הערוצים בחלון התאמת תצוגת פרט לערוץ ולעלה ובטל את פני השטח שנוצר לתא בלען.
- לחץ על סמל עיבוד פני השטח שוב (ראה שלב 6.3) וליצור משטח לערוץ באמצעות אותם השלבים כפי שתואר לתא בלען (שלבים 6.4-6.11). הערות: הקפד לבחור את הערוץ הנכון לפני ההחלקה וקביעת ערכי סף (שלב 6.5; איור 4). רשמו את ערך הסף (ראה שלב 6.6; איור 4C). ניתן גם להשיג ערך זה אחרי פני שטח העיבוד הוא להשלים (כרטיסיית מוט; איור 5A).
- רשום את הנפח של החומר נבלע ולא נבלע בסך הכל ולשמור את הקובץ לפני שתמשיך.
- משטח לעבד חומר נבלע (חומר בתוך תא בלען).
- דמיין הקרינה של רקהערוץ החדש של חומר נבלע (ראה צעד 7.2.1).
- בצע את אותם צעדים כאמור לעיל (שלבים 7.2-7.3). הערות: הקפד לבחור את הערוץ הנכון מניתץ התפריט לפני ההחלקה (לבחור את הערוץ החדש שנוצר בשלב 7.1). בחלון הסף, להזין באופן ידני את ערך הסף שנקבע לעיבוד החומר בסך הכל נבלע ולא נבלע (ראה צעד 7.2.2).
- רשום את הנפח של החומר נבלע ולשמור את הקובץ לפני שתמשיך.
8. חשב את הנפח הכולל של שדה צפייה
- ליצור משטח חדש לכל ערוץ.
- בחלון קביעת ערכי הסף (שלב 6.6), חלק את ההיסטוגרמה כל הדרך לצד השמאל, כך שכל השדה הוא על פני השטח.
- לסיים את פני השטח את כל השדה ולהקליט את הנפח (שלבים 6.7-6.11).
- שמור את הקובץ.
9. לחשב את כמות חומר phagocytosed
- לחשב את הצפיפות שלערוץ בסך הכל נבלע ולא נבלע חומר באמצעות האלגוריתם הבא:
נפח סה"כ נבלע ולא נבלעו חומר (שלב 7.3) / נפח של שדה (שלב 8). - חישוב היבלעות% לתא באמצעות האלגוריתם הבא:
(כרך של נבלע חומר (שלב 7.5) / נפח כולל של תא בלען (שלב 6.11)) x 100
הערות: כדי לפצות על הבדלים בגודל תא, הנתונים מנורמלים לנפח הכולל של תא בלען. אם מספרים מהצעד 9.1 הם משתנים מאוד על פני שדות, זה עשוי להיות נחוץ כדי לנרמל את הנתונים מצעד 9.2 לחישוב ב9.1.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
לאחרונה, השתמשנו assay היבלעות זו כדי לחזות ולכמת היבלעות בתיווך המיקרוגלים של תשומות presynaptic במערכת retinogeniculate הפיתוח (איור 1) 7. RGCs מעכברים הטרוזיגוטיים CX3CR1-EGFP אותרו anterogradely עם CTB-594 וCTB-647 בעיני ימין ועל השמאל, בהתאמה. בעקבות מעקב זה, מיקרוגליה EGFP החיוביים בתוך dLGN היו הדמיה. תמונות אלו בהמשך פני השטח שניתנו למדידות נפח.
באמצעות טכניקה זו, מצאנו כי במהלך תקופת שיא של שיפוץ הסינפטי התפתחותית בתוך dLGN (P5), תשומות presynaptic נבלעות ע"י מיקרוגליה (איור 6). כמה כמו 4 ימים מאוחר יותר, כאשר כמות גדולה של שיפוץ היא כמעט מלאה (P9), יש ירידה דרמטית בכמות תשומות נבלעו. בנוסף, היבלעות וגיזום הם שיבשו בעכברים חסרים בחלבונים השייכים למפל משלימים הקלאסי7 (איור 6), כמו גם בעקבות מניפולציה של ירי עצבי (מידע לא מוצג).
איור 1. האסטרטגיה להעריך היבלעות בתיווך מיקרוגליה של תשומות presynaptic RGC 7.) סכמטי של אסטרטגית התחקות אנטרוגרדית. כניסות שמאל וימין עין RGC הן לייחס עם CTB-647 (כחול) וCTB-594 (אדום), בהתאמה. היבלעות בתיווך Microglia (ירוקה) של תשומות היא תמונה בהגדלה נמוכה נציג של יום הלידה dLGN 5 עכבר (P5) העריכה לאחר מכן. ב ') בעקבות איתור אנטרוגדית של שמאל (כחול) וימינה (אדום) תשומות העין. סרגל קנה מידה = 100 מיקרומטר. Ci) מיקרוגליה (EGFP, ירוק) שנדגמו מאזור הגבול של שמאל (כחול) וימינה (תשומות אדומות) העין (הבלעה בבוקר). כת"ש) אונג> כל הקרינה CTB מחוץ נפח microglial כבר מופחתים תשומות חושפניות RGC (אדום וכחול), כי כבר נבלעו (חיצים שהורחב בהבלעה). CIII) עיבוד פני שטח של המיקרוגלים והקיפה תשומות RGC. מרווחים של רשת קו = 5 מיקרומטר. די) מיקרוגליה נציג (ירוקה, EGFP) מP5 dLGN. תשומות RGC מסומנות עם CTB-594 (אדום) וlysosomes מסומנים עם אנטי CD68 (כחול). DiI) כל הקרינה CTB מחוץ למיקרוגליה נפח הוסרה חושף נבלע תשומות RGC (אדום) וlysosomes (כחול) בתוך מיקרוגליה . (ירוק) Diii) תשומות רוב RGC (אדום) הם מקומיים לחלוטין בתוך lysosomes CD68-חיובי (כחול; חצים לבנים) דיב-v) ערוצי CD68 (דיב) וCTB (DV) לבד.. סרגל קנה מידה = 10 מיקרומטר. אנא לחץ כאן כדי לצפות בגרסה גדולה יותר של דמות זו.
"Jove_content" עבור: לשמור-together.within-page = "תמיד"> 
איור 2. סמלי תוכנת Imaris.
איור 3. חלונות ניווט כלליים בתוכנה. א) חלון התאמת התצוגה. B) פוינטר החלון. בחר יאפשר בחירה של משטחים מסוימים. נווט יאפשר הסיבוב של תמונה בשדה הראייה. C) זה הכרחי כדי להיות במצב לעלות למשטח טיוח הנפח.
איור 4. עיבוד פני שטח בתוכנה.) יצירת חלון. ב ') חלקing חלון. בחר את הערוץ אל פני השטח מלמשוך למטה בתפריט (המודגש בצהוב). ג) קביעת ערכי סף למשטח תמונת הניאון. מודגש על ידי התיבה האדומה הוא ערך הסף שצריך להיות מוקלט לחומר נבלע ולא נבלע בסך הכל. מספר זה להיות מיושם מאוחר יותר לסף ועל פני השטח את החומר נבלע. אנא לחץ כאן כדי לצפות בגרסה גדולה יותר של דמות זו.
איור 5. קבלת מדידות נפח בתוכנה. א) כרטיסיות המופיעות הבא משטח טיוח. שים לב לשרביט, עיפרון, משפך, וכרטיסיות גרף שמזוהה בטקסט. ב ') מסכת כל התכונה לדמיין חומר נבלע בתוך התא בלען. שים לב לערוץ שבחר (אתםתיבת llow). C) התכונה תחת לשונית משפך / סינון מאפשרת הבחירה של כל המשטחים בתחום על ידי הזזה היסטוגרמה כל הדרך לצד השמאל, כך שהוא מופיע צהוב. ניתן לבחור כל מסנן לכך. ד ') תחת לשונית הגרף, ניתן להשיג מדידות נפח ומוקלטות. אנא לחץ כאן כדי לצפות בגרסה גדולה יותר של דמות זו.
איור 6. נציגי נתונים 7.) מיקרוגליה נציג שניתנו משטח מP5 (תמונת ניאון מוצגת באיור 1), P9, וdLGN עכבר P30. ריבועי מוגדל מסומנים בקו מקווקו שחור.מרווחים של רשת קו = 5 מיקרומטר. B) היבלעות של תשומות RGC הוא גדל באופן משמעותי במהלך גיזום השיא בdLGN (P5) לעומת גילים מבוגרים יותר (P9 וP30). * P <0.001 ידי כיוון אחד ANOVA, n = 3 עכברים / גיל. C) Microglia מעכברים חסרי קולטן משלים 3 (KO, פס שחור) לבלוע תשומות RGC פחות באופן משמעותי בהשוואה להמלטת WT (פס לבן). כל הנתונים הם מנורמלים לערכי שליטת WT. * P <0.04 ידי מבחן t של הסטודנט, n = 3 עכברים / גנוטיפ. כל הברים השגיאה מייצגים SEM, לחץ כאן לצפייה בתמונה גדולה יותר.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
על מנת למדוד במדויק phagocytosis, חייבים להיות מסומנים בחומרים נבלעו בצורה כזאת, כי החוקר יכול לדמיין את זה פעם אחת השפלה lysosomal התרחשה. בנוסף, נדרש הדמיה ברזולוציה גבוהה, ואחריו את השימוש בתוכנה שיאפשר לחוקר לדמיין את עוצמת הקול של כל התא ולכמת את התוכן שלה. בפרוטוקול זה, אנו מתארים שיטה אמינה וכמותי מאוד למדידת היבלעות בתיווך תא בלען באמצעות CTB מצומדת לצבעי Alexa לתווית חומר נבלע בשילוב עם מיקרוסקופיה confocal ברזולוציה גבוהה ושחזור 3D. מתודולוגיה זו נעשתה שימוש במעבדה שלנו כדי לנתח מיקרוגליה בתיווך היבלעות של תשומות presynaptic עוברות שיפוץ הסינפטי במוח המתפתח של העכבר (מערכת retinogeniculate) 7 בהצלחה. בנוסף, הוא הוכיח את עצמו בטכניקה רגישה מאוד שיכול להבחין בין שינויים עדינים בהיבלעות על פני גילאי התפתחותיים שונים under תנאים שאינם תנאים פתולוגיים ובין עכברי wildtype ונוקאאוט. עם התאמות קלות, פרוטוקול זה יכול להיות מותאם ללמוד היבלעות ברקמות חיות על ידי הדמיה זמן לשגות. בנוסף, פרוטוקול זה יכול להיות מיושם על מחקר אינטראקציות התא בלען נוירון במחלה.
אזהרות
אחד ההיבטים השימושיים ביותר של assay זה הוא היכולת לתייג את התחזיות עצביות באופן כזה שהם נשארים גלויים לאחר שנכנס למסלול השפלה lysosomal. עם זאת, משום שנוירון שכותרתו, זה עשוי להיות קשה להבחין איזה חלק של התא כבר phagocytosed. זה דורש ניתוח זהיר מאוד אזורי (למשל, אזור הסינפטי לעומת אזור הלא הסינפטי של dLGN) בשילוב עם מיקרוסקופ אלקטרונים 7. בנוסף, זה עשוי להוכיח קשה יותר באזורים אחרים במוח שבו גופי תא עצביים ותחזיות מתגוררים באותו האזור. עם זאת, אסטרטגיות תיוג חלופיות עשויות להיות מועסקות (ראו below). כמו כן, בשל מגבלות הרזולוציה של מיקרוסקופ אור, יש אפשרות שאחד יכול להעריך את כמות החומר נבלע. כתוצאה מכך, יש לנקוט זהירות כדי לאמת שחומר נבלע בתוך lysosomes. מסיבה זו, אנו משתמשים באנטי CD68 לתייג lysosomes בתוך מיקרוגליה, טיוח 3D, ונוף מאונך כדי לאמת את הפרמטרים של assay.
סוגי תאים
בנוסף למיקרוגליה, מתודולוגיה זו יכולה להיות מיושמת גם כדי לנתח את התפקיד של phagocytes האחר במוח (למשל, האסטרוציטים) ובמערכות היקפי העצבים ומערכת חיסוניים (למשל, בתאי שוואן perisynaptic, מקרופאגים, וכו '). בנוסף, בגלל CTB מצומדת לצבעי Alexa הוא נלקח כל כך בקלות על ידי רוב התאים, אסטרטגית תיוג דומה עשויה לשמש לתווית חומר נבלע בכל רחבי המוח ומערכות גוף שונים.
תיוג של חומר נבלע
כמו אלternative לCTB מצומדת לצבעי Alexa, יש לנו להשתמש באסטרטגיות הבאות כדי תווית חומר נבלע 7: 1) עכברי כתב ניאון שבRGCs תויגו עם חלבון פלואורסצנטי (למשל, tdTomato, EGFP, וכו '). 2) תיוג אנטרוגרדית עם צבע pHrodo מצומדת לdextran, צבע שמאיר רק פעם אחת זה בליזוזום. שימוש באסטרטגיות שונות אלה, ויזואליזציה וכימות של תשומות presynaptic נבלעו בתוך מיקרוגליה יכולים להיות performedwith אותן טכניקות ההדמיה וכימות. עם זאת, conjugates צבע Alexa הוא חזק ביותר בשל העמידות הגבוהה של צבע Alexa לlysosomal hydrolases 7,21. בנוסף, תיוג של חומר נבלע עם נוגדנים (למשל, אנטי VGLUT2, חלבון ועי סינפטי) כבר ניסה. עם זאת, מדובר בשיטה יחסית לא אמינה של גילוי בהתחשב בכך שרוב החלבונים מתפרקים במהירות פעם אחת בlysosomes. קשה להבחין הקרינה נמוכה בשללפירוק חלבונים על פני רקע.
בעלי חיים המשמשים
בפרוטוקול הנוכחי, מיקרוגליה הם שכותרתו fluorescently גנטי באמצעות עכברי כתב ניאון (CX3CR1-EGFP) 22. עם זאת, יש מקרים שבהם תיוג נוגדן לעומת ביטוי גנטי של בונה כתב ניאון הוא הכרחי. לדוגמא, כאשר עכברי כתב ניאון אינם זמינים לתא בלען של עניין, את השימוש של חולדות הוא הכרחי, או החוקר שירצה להביט בעכברים בנוקאאוט מבלי לחצות אותם לקו עכבר כתב ניאון. למקרים כגון אלה, יכול להיות מתויג phagocytes באמצעות אימונוהיסטוכימיה ונתונים דומים לתוצאות מניסויים באמצעות עכברי כתב ניאון 7. בעקבות חתך רקמה, אנו משתמשים בדרך כלל בפרוטוקול immunostaining סטנדרטי לסעיפים צפים 7. חשוב לבחור נוגדן שהועלה נגד חלבון שיהיה לתייג את התא כולו והתהליכים שלה. לדוגמא, למיקרוגליה תווית, יכול לשמש נגד Iba1.
יישומים רחבים יותר: בשידור חי הדמיה ומחלות
בעוד פרוטוקול זה מבוסס על ניתוח של רקמה קבועה, שינויים קלים שיאפשר את אותו ניתוח בתמונות שנרכשו על ידי הדמיה לחיות. בעקבות פגישת הדמיה הזמן לשגות, יכולות להיות מעובד Z-הערימות הבאות זהות לשלבים 4-9 בפרוטוקול זה. יתר על כן, בעוד שיש לנו ליישם פרוטוקול זה כדי להמחיש היבלעות של סינפסות במהלך שיפוץ הסינפטי התפתחותיים של מערכת העצבים המרכזית בריאים, פרוטוקול זה יכול להיות מיושם גם במודלים של מחלה. בפרט, פרוטוקול זה יכול לשמש כדי לחקור מחלות שבהן סינפסות עוברות שיפוץ משמעותי, כמו במקרה של אובדן סינפסה והתחדשות בעקבות פציעה בחוט השדרה, אובדן סינפסה המוקדם הקשורים למחלת אלצהיימר, וכו '12,14-19,23 - 26. בנוסף, ניתן גם להתאים טכניקה זו כדי ללמוד מחלות בי phagocytosis של חומר אחר מאשר סינפסות תואר, כגון מיקרוגליה / היבלעות בתיווך מקרופאג של מיאלין בdemyelinating מחלה (לדוגמא, טרשת נפוצה) והיבלעות של בטא עמילואיד במחלת אלצהיימר 5,6,27-29.
לסיכום, assay ההיבלעות שתואר כאן מציע טכניקה נוחה, לשחזור, ורגישה כדי לחקור אינטראקציות תא בלען עם הסביבה תאית שלהם. חשוב מכך, יש assay זה מגוון רחב של שימושים ויכולות שישרתו את קהילת מדעי המוח, כמו גם אלה שעובדים במערכות איברים אחרות.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
אין ניגודי האינטרסים הכריזו.
Acknowledgments
עבודה נתמכה על ידי מענקים מקרן סמית המשפחה (BS), קרן דנה (BS), תכנית ג'ון מרק מלומדים (BS), NINDS (RO1-NS-07,100,801; BS), NRSA (F32-NS-066,698; DPS), קרן ננסי וריא מרקס (DPS), NIH (P30-HD-18655; MRDDRC ההדמיה Core).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Heat pad | Vet Equip, Inc. | 965500 | |
| Warm water source for heat pad | Kent Scientific | TP-700 | |
| Stereo microscope | DSC Optical | Zeiss Opmi -6 Surgical Microscope | |
| Sliding microtome with freezing stage | Leica | SM2010 R | |
| Microtome blade | Leica | 14021607100 | |
| Fluorescent dissecting microscope | Nikon | SMZ800 with Epi-fluorescence attachment | |
| Spinning disk confocal microscope | Perkin Elmer | UltraView Vox Spinning Disk Confocal | |
| 10 µl Hamilton gas tight syringes | Hamilton | 80030 | Use a different syringe for each color dye/tracer |
| Hamilton needles | Hamilton | 7803-05, specifications: blunt, 1.5" | |
| Alexa-conjugated cholera toxin β subunit (CTB) | Invitrogen | 488: C22841 | Reconstitute in sterile saline, 80 µl (488), 100 µl (594), 20 µl (647) |
| 594: C22842 | |||
| 647: C34778 | |||
| Phosphate Buffered Saline (PBS) | Sigma | P4417-50TAB | |
| Neomycin and Polymyxin B Sulfates and Bacitracin Zinc Ophthalmic Ointment USP (antibiotic ointment) | Bausch & Lomb | 24208-780-55 | |
| 30.5 G needle | Becton Dickinson | 305106 | |
| Spring scissors | Roboz | RS-5630 | |
| Cotton-tipped applicator | Fisher | 23-400-125 | |
| Paraformaldeyde (PFA) | Electron Microscopy Sciences | 15710 | Dilute 16% to 4% in PBS. Paraformaldehye is toxic, use in a fume hood and wear personal protective equipment. |
| Dissection tools – scissors, forceps, spatula | Small scissors: Fine Science Tools | Small scissors:14370-22 | |
| Large scissors: Roboz | Large scissors: RS-6820 | ||
| #55 forceps: Fine Science Tools | #55 forceps: 11255-20 | ||
| Spatula: Ted Pella, Inc. | Spatula: 13504 | ||
| Sucrose | Sigma | S8501-5KG | Make 30% sucrose in PBS (weight/vol) |
| OCT Compound | VWR | 25608-930 | |
| Weigh boat | USA Scientific | 2347-1426 | |
| 24-well plates | BD Biosciences | 353047 | |
| Sodium phosphate monobasic | Sigma | S6566-500G | Make 0.2 M sodium phosphate monobasic (PB-A) in ddH2O and 0.2 M sodium phosphate dibasic (PB-B) in ddH2O. To make 0.1 M PB, combine 19 ml PB-A and 81 ml PB-B, fill to 200 ml with ddH2O |
| Sodium phosphate dibasic | Sigma | S5136-500G | |
| Coverslips, 22 X 50 mm, No. 1.5 | VWR | 48393 194 | |
| Charged microscope slide | VWR | 48311-703 | |
| Vectasheild | Vector Laboratories | H-1200 |
References
- Ransohoff, R. M., Perry, V. H. Microglial physiology: unique stimuli, specialized responses. Annu Rev Immunol. 27, 119-145 (2009).
- Aguzzi, A., et al. Microglia: scapegoat, saboteur, or something else. Science. 339 (6116), 156-161 (2013).
- Tremblay, M. E., et al. The role of microglia in the healthy brain. J Neurosci. 31 (45), 16064-16069 (2011).
- Hanisch, U. K., Kettenmann, H. Microglia: active sensor and versatile effector cells in the normal and pathologic brain. Nat. Neurosci. 10 (11), 1387-1394 (2007).
- Sierra, A., et al. Janus-faced microglia: beneficial and detrimental consequences of microglial phagocytosis. Front Cell Neurosci. 7, (2013).
- Dheen, S. T., et al. Microglial activation and its implications in the brain diseases. Curr Med Chem. 14 (11), 1189-1197 (2007).
- Schafer, D. P., et al. Microglia sculpt postnatal neural circuits in an activity and complement-dependent manner. Neuron. 74 (4), 691-705 (2012).
- Katz, L., Shatz, C. Synaptic activity and the constuction of cortical circuits. Science. 274 (5290), 1133-1138 (1996).
- Sanes, J. R., Lichtman, J. W. Development of the vertebrate neuromuscular junction. Annu Rev Neurosci. 22, 389-442 (1999).
- Hua, J. Y., Smith, S. J. Neural activity and the dynamics of central nervous system development. Nat Neurosci. 7 (4), 327-332 (2004).
- Holtmaat, A., Svoboda, K. Experience-dependent structural synaptic plasticity in the mammalian brain. Nat Rev Neurosci. 10 (9), 647-658 (2009).
- Butz, M., et al. Activity-dependent structural plasticity. Brain Res Rev. 60 (2), 287-305 (2009).
- Bruel-Jungerman, E., et al. Brain plasticity mechanisms and memory: a party of four. Neuroscientist. 13 (5), 492-505 (2007).
- Schafer, D. P., Stevens, B. Synapse elimination during development and disease: immune molecules take centre stage. Biochem Soc Trans. 38 (2), 476-481 (2010).
- Alexander, A., et al. The complement system: an unexpected role in synaptic pruning during development and disease. Annu Rev Neurosci. 35, 369-389 (2012).
- Brown, A., Weaver, L. C. The dark side of neuroplasticity. Exp Neurol. 235 (1), 133-141 (2012).
- Navarro, X. Chapter 27: Neural plasticity after nerve injury and regeneration. Int Rev Neurobiol. 87, 483-505 (2009).
- Tan, A. M., Waxman, S. G. Spinal cord injury, dendritic spine remodeling, and spinal memory mechanisms. Exp Neurol. 235 (1), 142-151 (2012).
- Wolpaw, J. R., Tennissen, A. M. Activity-dependent spinal cord plasticity in health and disease. Annu Rev Neurosci. 24, 807-843 (2001).
- Schafer, D. P., et al. The "quad-partite" synapse: Microglia-synapse interactions in the developing and mature CNS. Glia. 61 (1), 24-36 (2013).
- Mukhopadhyay, S., et al. Manganese-induced trafficking and turnover of the cis-Golgi glycoprotein GPP130. Mol Biol Cell. 21 (7), 1282-1292 (2010).
- Jung, S., et al. Analysis of fractalkine receptor CX(3)CR1 function by targeted deletion and green fluorescent protein reporter gene insertion. Mol Cell Biol. 20, 4106-4114 (2000).
- Knobloch, M., Mansuy, I. M. Dendritic spine loss and synaptic alterations in Alzheimer's disease. Mol Neurobiol. 37 (1), 73-82 (2008).
- Masliah, E., et al. Synaptic remodeling during aging and in Alzheimer's disease. J Alzheimers Dis. 9 (3 Suppl), 91-99 (2006).
- Yoshiyama, Y., et al. Synapse loss and microglial activation precede tangles in a P301S tauopathy mouse model. Neuron. 53 (3), 337-351 (1016).
- Milnerwood, A. J., Raymond, L. A. Early synaptic pathophysiology in neurodegeneration: insights from Huntington's disease. Trends Neurosci. 33 (11), 513-523 (2010).
- Noda, M., Suzumura, A. Sweepers in the CNS: Microglial Migration and Phagocytosis in the Alzheimer Disease Pathogenesis. Int J Alzheimers Dis. , (2012).
- Rotshenker, S. Microglia and macrophage activation and the regulation of complement-receptor-3 (CR3/MAC-1)-mediated myelin phagocytosis in injury and disease. J Mol Neurosci. 21 (1), 65-72 (2003).
- Smith, M. E. Phagocytosis of myelin in demyelinative disease: a review. Neurochem Res. 24 (2), 261-268 (1999).
