Summary
Mikroglia er beboeren immunceller i sentralnervesystemet (CNS) med en høy kapasitet til å phagocytose eller sluker materiale i sitt ekstracellulære miljø. Her blir en bredt anvendbar, pålitelig og meget kvantitativ analyse for å visualisere og måle microglia-mediert engulfment av synaptiske komponenter beskrevet.
Abstract
Fagocytose er en prosess hvor en celle omslutter materialet (hel celle, deler av en celle, rusk etc.) i sin omliggende ekstracellulære miljø og deretter fordøyer dette materialet, vanligvis gjennom lysosomal degradering. Mikroglia er beboeren immunceller i sentralnervesystemet (CNS) som fagocytisk funksjon er blitt beskrevet i en lang rekke forhold fra nevrodegenerative sykdommer (for eksempel beta-amyloid klaring i Alzheimers sykdom) til utvikling av det friske hjernen (f.eks synaptiske beskjæring) 1-6. Følgende protokoll er en engulfment analyse utviklet for å visualisere og kvantifisere microglia-mediert engulfment av presynaptiske innganger i den tredje muse retinogeniculate system 7. Selv om denne assay ble brukt for å vurdere microglia funksjon i denne spesielle sammenheng, kan en lignende tilnærming brukes til å vurdere andre fagocytter i hele hjernen (f.eks astrocytter) og resten av legemet(f.eks perifere makrofager) samt andre sammenhenger der oppstår synaptic ombygging (f.eks hjerneskade / sykdom).
Introduction
Synaptiske kretser remodel gjennom hele livet av et dyr. I utviklingen av hjernen, synapser dannes i overkant og må gjennomgå synaptiske beskjæring som innebærer selektiv fjerning av en undergruppe av synapser og opprettholdelse og forsterkning av disse synapser som forblir 8-10. Denne prosess er nødvendig for å oppnå den nøyaktige tilkoblings karakteristisk for den voksne nervesystemet. I den voksne, kan synapser også være plast, særlig i sammenheng med læring og hukommelse. De strukturelle korrelater med denne plastisitet er tenkt å omfatte tilsetning og / eller fjerning av dendrittutløperne og presynaptiske boutons 11-13. I tillegg til disse roller i sunt nervesystem, er synaptiske ombygging også involvert i nervesystem sykdommer / skader 12,14,15. For eksempel, etter ryggmargsskade, avkuttede axons må deretter renovere og danne nye synapser å oppnå funksjonelle utvinning 16-19.
nt "> Emerging som en viktig del av synaptisk plastisitet er prosessen med fagocytose eller engulfment av synapser bestemt for fjerning 3,5,20. Vi har nylig viste dette fenomenet i sammenheng med synaptiske beskjæring i sunn, postnatal mus hjernen 7. Spesielt , microglia, bosatt CNS immunceller og fagocytter, ble vist å sluke presynaptiske inngangene under en topp periode og i et område av utviklings synaptiske beskjæring, barsel dorsal lateral geniculate nucleus (dLGN) i thalamus. Genetisk eller farmakologisk blokade av denne engulfment resulterte i vedvarende underskudd i synaptiske tilkobling.I denne protokollen, beskriver vi en pålitelig og svært kvantitativ analyse for å måle phagocyte-mediert engulfment av presynaptiske innganger. Ved anvendelsen av denne artikkelen, vil denne analysen bli presentert i sammenheng med utviklings retinogeniculate system, som inkluderer retinal ganglion celler (RGCs) bosatt i netthinnen somprojisere presynaptiske innganger til dLGN (figur 1A). Til å begynne med vil en lysosomal degradering bestandig antero merking strategi beskrives, som brukes til å visualisere RGC-spesifikke presynaptiske innganger i dLGN (figur 1) 7,21. Etter denne beskrivelse, en detaljert metode for avbildning og kvantitativt måle engulfment ved hjelp av konfokal mikroskopi i kombinasjon med 3-dimensjonal (3D) overflatevolumgjengivelse vil bli gitt. Denne metode er basert på fast vevspreparat, men kan også tilpasses for anvendelse i levende bildediagnostikk. Viktigere, mens analysen er blitt validert i sammenheng med den friske, postnatal retinogeniculate system, kan man anvende de samme teknikkene for å vurdere andre fagocytt-neuron interaksjoner i hele hjernen og i løpet av sykdommen, så vel som phagocyte funksjon i andre organsystemer.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
En. Antero Merking av RGC presynaptiske Innganger
Merk: Alle forsøk med bruk av dyr ble anmeldt og overvåket av den institusjonelle dyr omsorg og bruk komité (IACUC) i samsvar med alle NIH retningslinjer.
- Steril feltet og instrumenter.
- Anesthetize mus med 4 vol% isofluran i en pleksiglass induksjon kammer (dette vol% isofluran fungerer for neonatal-voksen mus). Observer mus nøye for å unngå over-bedøvelse. FORSIKTIG: Unngå innånding med et vakuum avfall gassevakuering.
- Etter 1-3 min, (eldre mus vil kreve mindre tid) sørge for passende nivå av anestesi oppnås ved å klemme halen (ingen reaksjon bør observeres) og observere pustefrekvens (hastighet bør være langsom og jevn).
- Plasser musen under stereomikroskop på sin side og sted nese kjegle levere 3-4 vol% isofluran over snuten (nyfødte <postnatal dag 10 (P10) ~ 4 vol%;> P10 ~ 3 vol%).
- Expose sclera. For injeksjon av nyfødte før øynene åpne, kan du bruke et par små våren saks for å åpne øyelokk og trekke tilbake huden å eksponere sclera. For eldre mus, bruke fingrene til å trekke tilbake huden rundt øyet å avsløre sclera. FORSIKTIG: Hos nyfødte, noen ganger er nødvendig en annen vinkelrett kutt på hjørnet av øyet. Vær forsiktig når du skjærer hjørnet av øyelokket som det er en blodåre som, hvis kuttet, vil blø mye.
- Bruk av en steril 30,5 G nål til å stikke hull på et lite hull i siden av øyet på linjen hvor sclera begynner. Pass på å unngå å skade objektivet ved å stikke nålen akkurat langt nok til at skrå går inn i øyet.
- Tillat glasslegemet til å strømme ut av hullet, og å bruke en steril bomullstupp applikator for å absorbere væsken.
- Når glasslegemet har sluttet å strømme ut av hullet, sette inn en stump ended nål festet til en Hamilton sprøyte forhåndslastet med antero tracing fargestoffinn i hullet. FORSIKTIG: Sett nålen sakte for å unngå punktering den andre siden av øyet eller skade linsen.
- Sakte injisere fargestoff inn i øyet. Vanligvis er koleratoksin β subenheten konjugert til Alexa 594, 647, eller 488 (CTB-594, CTB-647, eller CTB-488, 5-6 mikrogram / mL) som brukes til anterogradely spor RGC innganger. For nyfødte (≤ P10) 1-2 mL er tilstrekkelig og for mus> P10 ~ 3 mL er tilstrekkelig. Merk: Alexa fargestoffer er spesielt motstandsdyktig mot lysosomal degradering
- La nålen i hullet i noen sekunder, og deretter sakte fjerne.
- Bruk en bomulls tippet applikator å absorbere overflødig væske og hindrer fargestoff lekker ut.
- Påfør en liten mengde av antibiotisk salve for øyet. Hvis øyet ble kirurgisk åpnet, forsiktig flytte øyelokkene sammen.
- Hvis injisere begge øynene, gjenta prosedyren på det andre øyet.
- Etter injeksjon (s), la musen under en varmelampe eller på en varmepute til den begynner å komme seg fra anesthESIA.
- Returner musen til et rent hjem bur og overvåke for å sørge for at det er helt våken før du går tilbake til kolonien.
To. Forbered Tissue for Imaging
Dette vevet forberedelse protokollen brukes for reporter mus der de fagocytter er merket med fluorescerende markører (f.eks CX3CR1-EGFP for microglia). Hvis en reporter linjen ikke er tilgjengelig, kan etterforskeren immunostain vevssnitt (se diskusjon).
- ~ 24 timer etter injeksjonen, ofrer mus og dissekere hjernen.
- Slipp løse hjernen i en Falcon rør fylt med 4% paraformaldehyd (PFA) over natten ved 4 ° C. FORSIKTIG: PFA er giftig. Unngå innånding og hudkontakt ved å bruke i et avtrekksskap eller på en downdraft bord og bruke personlig verneutstyr. Merknader: Fiksering kan være kortere (≥ 4 timer). I tillegg, i stedet for å slippe festing, 4% PFA perfusjon kan brukes etterfulgt av en 2-24 timers dråpe fix. Men sammenligning av perfused å droppe faste nyfødte og voksne hjerner viste ingen forskjell i bildekvalitet eller kvantifisering.
- Skyll hjerne 3x i fosfatbufret saltvann (PBS).
- Hell hjernen og PFA i en tom veie båt.
- Bruk av en spatel for å overføre hjernen til en annen veie båt fylt med PBS.
- Vask hjernen to ganger mer i PBS (transfer hjernen til to mer veie båter fylt med PBS).
- Overfør hjernen til en Falcon rør fylt med en 30% sukroseløsning. La hjernen hos sukrose ved 4 ° C frem til hjernen synker til bunnen av røret (24-48 timer).
- Når hjernen synker, forberede hjernen for seksjonering. Følgende trinn er fremstillingen av 40 mikrometer flytende seksjoner ved hjelp av en glidende mikrotom med en frysetrinn (a kryostaten kan også brukes).
- Bruk et barberblad for å fjerne deler av hjernen som ikke er nødvendig (for dLGN, fjerne rostral og hale deler av hjernen).
- Frys BHin på aluminiumsfolie over tørt is. I løpet av denne tiden, fryse mikrotomen trinn og fylle hver brønn av en 24-brønns plate med 0,5 ml 0,1 M fosfatbuffer (PB).
- Monter frosne hjernen (det vises ugjennomsiktig) på frysetrinn.
- Påfør en liten mengde av optimal skjæretemperatur sammensatte (OCT) til scenen.
- Når OCT begynner å fryse, legge hjernen i oktober Slutten av hjernen som vil bli kuttet skal vende opp (dvs. for dLGN, ansikt halesiden opp).
- Dekk til hjernen og oktober med meget fint knust tørris.
- La tørris på hjernen / oktober for ~ 30 sek.
- Bruk en stor pensel for å fjerne tørris. Hjernen og oktober bør fryses til scenen.
- Begynn seksjonering gjennom vevet til området av interesse (ROI) er nådd.
- Når avkastningen er nådd, kan du bruke en liten pensel for å fjerne deler fra bladet og overføre dem til 24-brønnen plate inneholder 0,1 M PB (trinn 2.5.2). Hold pensel fuktig ved å fukte den i 0,1 M PB før du fjerner seksjoner fra bladet. Merk: Profiler kan stå i 0,1 M PB over natten ved 4 ° C.
- Når seksjoner har blitt samlet inn, visualisere antero merking under et fluorescerende dissekere mikroskop og velge seksjoner som inneholder ROI.
- Monter seksjoner på et lysbilde med en liten pensel.
- Påfør et lite basseng på 0,1 M PB til et ladet objektglass.
- Overfør vevet delen av bassenget av PB.
- Bruk PB og pensel for å orientere og spre vev.
- Bruk en Kimwipe for å transportere bort overflødig PB. Pass på å unngå fukttransporterende av delen.
- Tillat å fullstendig lufttørke.
- Påfør en liten dråpe monteringsmedium til hver seksjon og montere et dekkglass på toppen (22 x 50 mm, nr. 1.5).
- Forsegle kantene av lysbilde med neglelakk og oppbevar ved -20 ° C til bildebehandling økten. Merk: Selv om bildebehandling medi en uke for fremstilling anbefales, kan slides opprettholdes ved -20 ° C i flere uker før avbildning.
Tre. Imaging Tissue
Alle bilder er kjøpt på en roterende disk confocal mikroskop (Ultra Vox roterende disk confocal mikroskop utstyrt med diode lasere (405 nm, 445 nm, 488 nm, 514 nm, 561 nm og 640 nm)). Bilder kan også være kjøpt på en hvilken som helst mikroskop med evnen til å tilegne seg høy oppløsning z-stabler (f.eks laserskanning confocal mikroskop, epifluorescent mikroskop etterfulgt av deconvolution, etc.). Rammestørrelse er typisk 1000 x 1000 piksler.
- Finn ROI på 10X forstørrelse og tilegne seg et bilde. For bildebehandling microglia i retinogeniculate systemet, er avkastningen de mest mediale dLGN seksjoner.
- Skift til høyere forstørrelse (en 60x Plan Apo objektiv, NA = 1,4, brukes vanligvis).
- Acquire første synsfelt inneholder fagocytter bruker 0,2 mikrometer z-trinnets.
- Acquire 15-19 flere felt som inneholder fagocytter per dyr.
4. Forbered Images for Kvantifisering (ImageJ)
- Åpen z-stack i ImageJ.
- Gå til Image-menyen, velg Color og Split Channels.
- Trekk fra bakgrunnen fra kanalen (e) som inneholder den omsluttet materiale.
- Velg kanalen vindu med både oppslukt materiale (f.eks presynaptiske innganger).
- Gå til Prosess-menyen og velg Trekk Bakgrunn. Bruk en rullende ball radius på 10 piksler for antero sporing av presynaptiske innganger i dLGN. Merk: Den rullende ball radius bestemmes empirisk. Imidlertid bør det generelt være like stor som radius av det største objektet i bildet som ikke er en del av bakgrunnen.
- Glatt kanalen inneholder phagocyte.
- Velg kanalvinduet inneholder phagocyte (f.eks microglia).
- Gå til Prosess-menyen og select Filters, Mean. Bruk en gjennomsnittlig filter på 1,5 (dette jevner bildet for overflategjengivelse i senere trinn).
- Trekk bakgrunn fra kanalen som inneholder phagocyte.
- Velg kanalvinduet inneholder phagocyte (f.eks microglia).
- Gå til Prosess-menyen, velg subtrahere bakgrunn (innstillinger må være empirisk bestemt). Bruk en rullende ball radius på 50 piksler for EGFP-positive microglia.
- Flett kanaler ved å gå til Image-menyen og velge farge, Merge Channels.
- Crop ROI inneholder phagocyte fra fusjonerte filen (dette gjør overflaten rende raskere, se trinn 5).
- Tegne en boks rundt avkastning ved hjelp av den rektangulære valg verktøyet på verktøylinjen.
- Gå til Image-menyen og velg Beskjær.
- Splitte kanalene på nytt (se trinn 4.2).
- Lagre hver kanal som sin egen TIFF-fil.
5. Forbered Bildet Kvantifiseringi Imaris
- Åpne Imaris og sørge for at Volum-ikonet er valgt i venstre meny (figur 2).
- Åpen første kanal for beskårne bildet (en hvilken som helst av kanalene kan åpnes først, bare være konsistent).
- Til den andre kanalen (e). Gå til Edit-menyen, velg Legg kanaler og velg neste kanal i filen. (Gjenta dette trinnet for eventuelle gjenværende kanaler). Merk: Hvis du vil endre farge, gå til Vis justeringsvinduet og klikk på kanalnavnet (figur 3A). Dette vil få opp en dialogboks for å justere fargen. Hvis skjermen justeringsvinduet ikke vises, går du til Edit-menyen og velg Skjermjustering.
- Juster pikselverdier. Gå til Edit-menyen og velg Bildeegenskaper. I dette vinduet, justere x, y og z pikselverdier (Disse verdiene er avhengig av mikroskop, objektiv, kamera, og z-trinns erverv og kan finnes i programvaren som brukes til å hente bildet).
- Trinn 5.5 vil resultere i en megetlite bilde. For å endre størrelsen, klikker du på Tilpass-ikonet nederst i høyre hjørne (figur 2).
- I Visning justeringsvinduet, justere lysstyrke og kontrast for hver kanal med venstre og midtre trekanter.
6. 3-dimensjonal (3D) Overflaterendering av phagocyte
- I den øverste verktøylinjen, være sikker på at den overgå modus er valgt (Figur 3C).
- I Visning justeringsvinduet, fjern alle kanaler unntatt phagocyte kanal. Dette vil fjerne dem fra betraktningsfelt.
- Klikk på Surface Rende ikonet (Figur 2).
- En skape vindu vil vises nederst til venstre (figur 4A), sørg Segment ROI er ukontrollert i denne første vinduet. Klikk på den blå frem knappen nederst.
- Juster utjevning.
- I det neste vinduet velger du phagocyte kanal fra rullegardinmenyen (Figur 4B). Dette justererHvor mange detaljer som vil bli dukket og bør bestemmes empirisk (0,1 mikrometer glatting brukes vanligvis for microglia).
- Velg Absolute terskelverdier.
- Klikk på den blå frem knappen nederst.
- Terskel bildet.
- Klikk på histogram og dra til bildet er dukket hensiktsmessig (Figur 4C). Dette blir bestemt empirisk ved å rotere bildet for å sikre at de grå flater er lagt på den fluoriserende bilde, er en nøyaktig representasjon overflate. Merknader: Hvis du vil rotere, velg Naviger i Pointer-menyen øverst til høyre side av skjermen (Figur 3B), klikk og hold på bildet for å rotere. Å returnere bildet til originalretning, velger Origin Bunn Venstre fra Vis-menyen.
- Klikk på den blå frem knappen nederst.
- I det neste vinduet, det er et alternativ å filtrere ut eventuelle flater etter størrelse, etc. Med mindre bildet er svært støyende, ikke filter og slette eny filtre som automatisk vises. Klikk på den grønne pilen nederst til slutt overflaten gjengi phagocyte. Et nytt sett med faner vises (figur 5)
- Om nødvendig, slette overflater som ikke er en del av phagocyte av interesse.
- Kontroller at Velg alternativet er valgt i Pointer-menyen (Figur 3B).
- Klikk på alle overflater som skal slettes, slik at det blir gul. For å slette flere flater, klikk på flatene mens du holder nede Ctrl-knappen.
- Klikk på Slett under fanen Pencil.
- Velg og slå sammen alle overflater av phagocyte inn én flate.
- Klikk på trakt (dvs. Filter-kategorien; figur 5C).
- Klikk på Legg til.
- Velg hvilken som helst filter, drar histogrammet helt til venstre (alle overflater bør være gul).
- Gå tilbake til kategorien Blyant og klikk Samordne.
- Gå til kategorien graf (Figur 5A (figur 5D). For å vise flere parametere, gå til Wrench ikonet nederst til venstre (figur 2) og velg parametere for å spille inn.
- Spill volumet på phagocyte og lagre filen før du fortsetter.
7. 3D Surface Rende omsluttet Material
- Lag en ny kanal for materiale som er omsluttet av phagocyte.
- Mens phagocyte overflaten er valgt, klikker du på fanen blyant.
- Klikk Mask All.
- I dialogen som kommer opp, velger du den kanalen som svarer til oppslukt materiale (f.eks, antero sporing av presynaptiske innganger; Figur 5B).
- Sjekk duplikat kanal før du påfører masken og trykke OK.
- En ny kanal vises i skjermjusteringsvinduet som inneholder kun det materialet som har blitt oppslukt og er inne iphagocyte.
- Overflate gjengi kanalen inneholder totalt oppslukt og nonengulfed materiale.
- Fjern alle kanalene på displayet justeringsvinduet unntak for kanalen som skal overflaten og fjern haken overflaten opprettet for phagocyte.
- Klikk på overflaten rende ikonet igjen (se trinn 6.3) og skape en overflate for kanalen ved å bruke den samme fremgangsmåten som er beskrevet for phagocyte (trinn 06.04 til 06.11). Merknader: Pass på å velge riktig kanal før avretting og terskelverdier (trinn 6.5, figur 4B). Noter terskelverdien (se trinn 6.6, figur 4C). Denne verdien kan også oppnås etter overflaten rendering er komplett (tab Wand, figur 5A).
- Spill volumet av den totale oppslukt og ikke-oppslukt materiale og lagre filen før du fortsetter.
- Overflate gjengi oppslukt materiale (materialet i phagocyte).
- Visual fluorescens av bareden nye kanalen for oppslukt materiale (se trinn 7.2.1).
- Følg de samme trinnene som ovenfor (trinn 07.02 til 07.03). Merknader: Pass på å velge riktig kanal fra nedtrekksmenyen før avretting (velg den nye kanalen opprettet i trinn 7.1). I terskelen vinduet manuelt inn terskelverdien som ble satt for å gjengi den totale oppslukt og ikke-oppslukt materiale (se trinn 7.2.2).
- Spill volumet på oppslukt materiale og lagre filen før du fortsetter.
8. Beregn totalvolumet av Field of View
- Lag en ny overflate for noen kanal.
- I thresholding vinduet (trinn 6,6), skyver histogrammet helt til venstre slik at hele feltet er dukket opp.
- Avslutt overflaten hele feltet og ta opp volumet (trinn 06.07 til 06.11).
- Lagre filen.
9. Beregne hvor mye phagocytosed Material
- Beregn tettheten avtotalt oppslukt og ikke-oppslukt materialet kanal med følgende algoritme:
Volum av Total oppslukt og Non-oppslukt Material (trinn 7.3) / Volume of Field (trinn 8). - Beregn% engulfment per celle i henhold til følgende algoritme:
(Volume omsluttet Material (trinn 7.5) / totalvolumet av den phagocyte (trinn 6.11)) x 100
Merknader: Hvis du står for variasjoner i cellestørrelse, er data normalisert til det totale volumet av phagocyte. Dersom tallene fra trinn 9.1 er svært variabel over felt, kan det være nødvendig å normalisere dataene fra trinn 9,2 til beregningen i 9.1.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Nylig har vi brukt denne engulfment analysen til å visualisere og kvantifisere microglia-mediert engulfment av presynaptiske innganger i utviklings retinogeniculate systemet (figur 1) 7. RGCs fra CX3CR1-EGFP heterozygote mus ble anterogradely spores med CTB-594 og CTB-647 til venstre og høyre øyne, henholdsvis. Etter denne tracing, ble EGFP-positive microglia innenfor dLGN avbildes. Disse bildene ble deretter overflaten-rendret for volummålinger.
Ved hjelp av denne teknikken, fant vi at i løpet av en peak periode med utviklings synaptiske ombygging innenfor dLGN (P5), er presynaptiske innganger oppslukt av mikroglia (figur 6). Så få som fire dager senere når en stor mengde av remodeling er nesten fullstendig (P9), er det en dramatisk reduksjon i mengden av omsluttet innganger. I tillegg er engulfment og beskjæring forstyrret hos mus mangelfull i proteiner som hører til den klassiske komplementkaskaden(Fig. 6) så vel som etter manipulering av neuronal avfyring (data ikke vist) syv.
Figur 1. Strategi for å vurdere microglia-mediert engulfment av RGC presynaptiske innganger 7. A) Skjematisk av antero tracing strategi. Venstre og høyre øye RGC innganger spores med CTB-647 (blå) og CTB-594 (rød), henholdsvis. Microglia-mediert (grønn) engulfment innganger senere blir vurdert. B) En representant lav forstørrelse bilde av postnatal dag 5 (P5) muse dLGN følgende antero sporing av venstre (blå) og høyre (rød) øye innganger. Scale bar = 100 mikrometer. Ci) En microglia (EGFP, grønn) samplet fra grenseregionen i venstre (blå) og høyre (rød) øye innganger (innfelt i B). Cii) cIII) Overflate gjengivelse av mikroglia og oppslukt RGC innganger. Grid linje trinn = 5 mikrometer. Di) En representant microglia (grønn, EGFP) fra P5 dLGN. RGC innganger er merket med CTB-594 (rød) og lysosomer er merket med anti-CD68 (blå). Dii) Alle CTB fluorescens utenfor microglia volum har blitt fjernet avsløre oppslukt RGC innganger (rød) og lysosomer (blå) innenfor microglia . (grønn) DIII) De fleste RGC innganger (rød) er fullstendig lokalisert innenfor CD68-positive lysosomer (blå, hvite piler) Div-V) CD68 (Div) og CTB (DV) kanaler alene.. Scale bar = 10 mikrometer. Vennligst klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
Figur 2. Imaris programvare ikoner.
Figur 3. Generelle navigasjons vinduer i programvaren. A) B Display Justeringsvinduet.) The Pointer Window. Velg vil tillate valg av bestemte overflater. Bla vil tillate rotasjon av et bilde i synsfeltet. C) Det er nødvendig å være i overgå modus for overflate gjengivelse volumet.
Figur 4. Overflaterendering i programvaren. A) Lag-vinduet. B) Glatting vinduet. Velg kanalen til overflaten fra rullegardinmenyen (merket med gult). C) thresholding overflaten til den fluorescerende bilde. Markert med den røde boksen er grenseverdien som bør registreres for totalt oppslukt og ikke-oppslukt materiale. Dette nummeret vil bli brukt senere til terskel og med overflaten oppslukt materialet. Vennligst klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
Figur 5. Innhenting volummålinger i programvaren. A) Kategorier som vises følgende overflategjengivelse. Legg merke til Wand, Blyant, trakt, og Graf faner som er identifisert i teksten. B) The Mask alle har for å visualisere oppslukt materialet i phagocyte. Legg merke til den valgte kanalen (yellow boks). C) Funksjonen under fanen trakt / Filter tillater valg av alle overflater i feltet ved å skyve histogrammet helt til venstre, slik det ser gult. Enhver filter kan bli valgt for dette. D) Under fanen Graph, kan volummålinger bli innhentet og registrert. Vennligst klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
Figur 6. Representative data 7. A) Representant overflate-rendret mikroglia fra P5 (fluorescerende bilde er vist i figur 1), P9 og P30 mus dLGN. Forstørrede innfellinger markert med en svart stiplet linje.Grid linje trinn = 5 mikrometer. B) engulfment av RGC innganger er betydelig økt i løpet av peak beskjæring i dLGN (P5) versus eldre aldersgrupper (P9 og P30). * P <0,001 ved enveis ANOVA, n = 3 mus / alder. C) Microglia fra mus mangelfull i komplement reseptor 3 (KO, svart strek) sluker betydelig færre RGC innganger som sammenlignet med WT kullsøsken (hvit strek). Alle data er normalisert til WT kontrollverdier. * P <0,04 av Student t-test, n = 3 mus / genotype. Alle feilfelt representerer sem Klikk her for å se større bilde.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
For å måle fagocytose, må omsluttet materiale være merket på en slik måte at forskeren kan visualisere det en gang lysosomal degradering har oppstått. I tillegg er høy oppløsning kreves, etterfulgt av bruk av programvare som vil gjøre det mulig for forskeren til å visualisere volumet av hele cellen og kvantifisere innholdet. I denne protokollen, beskriver vi en svært pålitelig og kvantitativ metode for å måle phagocyte-mediert engulfment hjelp CTB konjugert til Alexa fargestoffer til å merke oppslukt materiale kombinert med høy oppløsning konfokalmikroskopi og 3D rekonstruksjon. Denne metoden har vært brukt i vårt laboratorium for å kunne analysere mikroglia mediert-engulfment av presynaptiske innganger som gjennomgår synaptisk ombygging i utviklings mus hjernen (retinogeniculate system) 7. I tillegg har det vist seg å være en svært følsom teknikk som kan skille subtile endringer i engulfment tvers av ulike utviklings aldre under ikke-patologiske tilstander, og mellom villtype og knockout mus. Med mindre justeringer, kan denne protokollen tilpasses studere engulfment i levende vev etter tid lapse bildebehandling. I tillegg kan denne protokoll anvendes for å studere fagocytt-neuron interaksjoner i sykdommen.
Advarsler
En av de mest nyttige aspekter av denne analysen er evnen til å merke neuronal anslag på en slik måte at de er synlige etter inn en lysosomal degradering pathway. Men fordi neuron er merket, kan det være vanskelig å skille ut hvilken del av cellen er blitt phagocytosed. Dette krever en meget forsiktig regionale analyser (f.eks synaptiske område i forhold til en ikke-synaptisk region av dLGN) kombinert med elektronmikroskopi 7.. I tillegg, kan dette vise seg å være vanskeligere i andre områder av hjernen hvor nervecelle organer og anslag bor i samme område. Imidlertid kan alternative merking strategier benyttes (se below). Videre, på grunn av oppløsnings grensene for lysmikroskopi, er det en mulighet for at man kan overvurdere mengden omsluttet materiale. Som et resultat, må man sørge for å validere at oppslukt materialet er i lysosomer. Av denne grunn, bruker vi anti-CD68 å merke lysosomer innen microglia, 3D-rendering, og ortogonale utsikt å validere parameterne for analysen.
Celletyper
I tillegg til microglia, kan denne metoden også brukes til å analysere rollen til andre fagocytter i hjernen (f.eks astrocytter) og i det perifere nervesystemet og immunsystemet (for eksempel perisynaptic Schwann-celler, makrofager etc.). I tillegg, fordi CTB konjugert til Alexa fargestoffer blir så lett tas opp av de fleste celler, en tilsvarende merking strategi kan anvendes til å merke omsluttet materiale i hele hjernen og andre organer.
Merking av Engulfed Material
Som et alternativ til CTB konjugert til Alexa fargestoffer, har vi brukt følgende strategier for å merke oppslukt materialet 7: 1) Fluorescent reporter mus der RGCs var merket med et fluorescerende protein (f.eks, tdTomato, EGFP, etc.). 2) Antero merking med et pHrodo fargestoff konjugert til dekstran, et fargestoff som kun fluorescerer når den er i en lysosomer. Ved hjelp av disse ulike strategier, kan visualisering og kvantifisering av oppslukt presynaptiske inngangene mikroglia være performedwith de samme bildebehandling og kvantifisering teknikker. Imidlertid Alexa fargestoff konjugater er de mest robuste på grunn av den høye motstand av Alexa fargestoff til lysosomale hydrolaser 7,21. I tillegg har etiketten til omsluttet materiale med antistoffer (for eksempel anti-VGlut2, en presynaptisk vesikulært protein) blitt forsøkt. Dette er imidlertid en relativt upålitelig metode for deteksjon gitt at de fleste proteiner raskt brytes ned en gang i lysosomer. Det er vanskelig å skille lav fluorescens grunntil protein degradering enn bakgrunnen.
Dyr Brukte
I dagens protokoll, er mikroglia fluorescensmerkede genetisk bruker fluorescerende reporter mus (CX3CR1-EGFP) 22. Det finnes imidlertid tilfeller hvor antistoffmerking versus genetisk ekspresjon av fluorescerende reporter-konstruksjoner er nødvendig. Når for eksempel fluorescerende reporter mus er ikke tilgjengelig for det phagocyte av interesse, er bruk av rotter nødvendig, eller forskeren ønsker å se på knockout mus uten å krysse dem inn i et fluorescerende reporter muselinje. For tilfeller som disse, kan fagocytter merkes ved hjelp av immunhistokjemi og data er sammenlignbare med resultater fra eksperimenter ved hjelp av fluorescerende reporter mus 7. Etter vev seksjonering, vi vanligvis bruker en standard farging protokoll for flytende seksjoner 7. Det er viktig å velge et antistoff dannet mot et protein som skal merkes hele cellen, ogsine prosesser. For eksempel vil label microglia, anti-Iba1 kan brukes.
Bredere Bruksområder: Levende Imaging and Disease
Mens denne protokollen er basert på analyse av fast vev, vil små endringer aktivere samme analyse i bilder ervervet av levende avbildning. Etter en tid lapse bildebehandling økten, kan de påfølgende z-stabler behandles identisk med trinn 4-9 i denne protokollen. Videre, mens vi har brukt denne protokollen for å visualisere engulfment av synapser i utviklings synaptisk ombygging i sunn CNS, denne protokollen kan også brukes i sykdomsmodeller. Spesielt kan denne protokollen kan brukes for å studere sykdommer hvor synapser gjennomgår vesentlig ombygging, som for eksempel i tilfelle av tap av synapser og regenerering etter ryggmargsskade, tidlig synapse tap assosiert med Alzheimers sykdom, osv. 12,14-19,23 - 26. I tillegg kan man også tilpasse denne teknikken for å studere sykdommer hvori fag-ocytosis av annet materiale enn synapser er blitt beskrevet, slik som microglia / makrofag-mediert engulfment av myelin i demyeliniserende sykdom (som multippel sklerose), og engulfment av beta-amyloid ved Alzheimers sykdom 5,6,27-29.
I konklusjonen, engulfment analysen beskrevet her tilbyr en praktisk, reproduserbar, og sensitiv teknikk for å studere phagocyte interaksjoner med sin ekstracellulære miljøet. Viktigere, har denne analysen et bredt spekter av bruksområder og evner som vil tjene nevrovitenskap samfunnet så vel som de som arbeider i andre organsystemer.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Ingen interessekonflikter erklært.
Acknowledgments
Arbeidet ble støttet med tilskudd fra Smith Family Foundation (BS), Dana Foundation (BS), John Merck Scholars Program (BS), ninds (RO1-NS-07100801, BS), NRSA (F32-NS-066698, DPS), Nancy Lurie Marks Foundation (DPS), NIH (P30-HD-18655; MRDDRC Imaging Core).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Heat pad | Vet Equip, Inc. | 965500 | |
| Warm water source for heat pad | Kent Scientific | TP-700 | |
| Stereo microscope | DSC Optical | Zeiss Opmi -6 Surgical Microscope | |
| Sliding microtome with freezing stage | Leica | SM2010 R | |
| Microtome blade | Leica | 14021607100 | |
| Fluorescent dissecting microscope | Nikon | SMZ800 with Epi-fluorescence attachment | |
| Spinning disk confocal microscope | Perkin Elmer | UltraView Vox Spinning Disk Confocal | |
| 10 µl Hamilton gas tight syringes | Hamilton | 80030 | Use a different syringe for each color dye/tracer |
| Hamilton needles | Hamilton | 7803-05, specifications: blunt, 1.5" | |
| Alexa-conjugated cholera toxin β subunit (CTB) | Invitrogen | 488: C22841 | Reconstitute in sterile saline, 80 µl (488), 100 µl (594), 20 µl (647) |
| 594: C22842 | |||
| 647: C34778 | |||
| Phosphate Buffered Saline (PBS) | Sigma | P4417-50TAB | |
| Neomycin and Polymyxin B Sulfates and Bacitracin Zinc Ophthalmic Ointment USP (antibiotic ointment) | Bausch & Lomb | 24208-780-55 | |
| 30.5 G needle | Becton Dickinson | 305106 | |
| Spring scissors | Roboz | RS-5630 | |
| Cotton-tipped applicator | Fisher | 23-400-125 | |
| Paraformaldeyde (PFA) | Electron Microscopy Sciences | 15710 | Dilute 16% to 4% in PBS. Paraformaldehye is toxic, use in a fume hood and wear personal protective equipment. |
| Dissection tools – scissors, forceps, spatula | Small scissors: Fine Science Tools | Small scissors:14370-22 | |
| Large scissors: Roboz | Large scissors: RS-6820 | ||
| #55 forceps: Fine Science Tools | #55 forceps: 11255-20 | ||
| Spatula: Ted Pella, Inc. | Spatula: 13504 | ||
| Sucrose | Sigma | S8501-5KG | Make 30% sucrose in PBS (weight/vol) |
| OCT Compound | VWR | 25608-930 | |
| Weigh boat | USA Scientific | 2347-1426 | |
| 24-well plates | BD Biosciences | 353047 | |
| Sodium phosphate monobasic | Sigma | S6566-500G | Make 0.2 M sodium phosphate monobasic (PB-A) in ddH2O and 0.2 M sodium phosphate dibasic (PB-B) in ddH2O. To make 0.1 M PB, combine 19 ml PB-A and 81 ml PB-B, fill to 200 ml with ddH2O |
| Sodium phosphate dibasic | Sigma | S5136-500G | |
| Coverslips, 22 X 50 mm, No. 1.5 | VWR | 48393 194 | |
| Charged microscope slide | VWR | 48311-703 | |
| Vectasheild | Vector Laboratories | H-1200 |
References
- Ransohoff, R. M., Perry, V. H. Microglial physiology: unique stimuli, specialized responses. Annu Rev Immunol. 27, 119-145 (2009).
- Aguzzi, A., et al. Microglia: scapegoat, saboteur, or something else. Science. 339 (6116), 156-161 (2013).
- Tremblay, M. E., et al. The role of microglia in the healthy brain. J Neurosci. 31 (45), 16064-16069 (2011).
- Hanisch, U. K., Kettenmann, H. Microglia: active sensor and versatile effector cells in the normal and pathologic brain. Nat. Neurosci. 10 (11), 1387-1394 (2007).
- Sierra, A., et al. Janus-faced microglia: beneficial and detrimental consequences of microglial phagocytosis. Front Cell Neurosci. 7, (2013).
- Dheen, S. T., et al. Microglial activation and its implications in the brain diseases. Curr Med Chem. 14 (11), 1189-1197 (2007).
- Schafer, D. P., et al. Microglia sculpt postnatal neural circuits in an activity and complement-dependent manner. Neuron. 74 (4), 691-705 (2012).
- Katz, L., Shatz, C. Synaptic activity and the constuction of cortical circuits. Science. 274 (5290), 1133-1138 (1996).
- Sanes, J. R., Lichtman, J. W. Development of the vertebrate neuromuscular junction. Annu Rev Neurosci. 22, 389-442 (1999).
- Hua, J. Y., Smith, S. J. Neural activity and the dynamics of central nervous system development. Nat Neurosci. 7 (4), 327-332 (2004).
- Holtmaat, A., Svoboda, K. Experience-dependent structural synaptic plasticity in the mammalian brain. Nat Rev Neurosci. 10 (9), 647-658 (2009).
- Butz, M., et al. Activity-dependent structural plasticity. Brain Res Rev. 60 (2), 287-305 (2009).
- Bruel-Jungerman, E., et al. Brain plasticity mechanisms and memory: a party of four. Neuroscientist. 13 (5), 492-505 (2007).
- Schafer, D. P., Stevens, B. Synapse elimination during development and disease: immune molecules take centre stage. Biochem Soc Trans. 38 (2), 476-481 (2010).
- Alexander, A., et al. The complement system: an unexpected role in synaptic pruning during development and disease. Annu Rev Neurosci. 35, 369-389 (2012).
- Brown, A., Weaver, L. C. The dark side of neuroplasticity. Exp Neurol. 235 (1), 133-141 (2012).
- Navarro, X. Chapter 27: Neural plasticity after nerve injury and regeneration. Int Rev Neurobiol. 87, 483-505 (2009).
- Tan, A. M., Waxman, S. G. Spinal cord injury, dendritic spine remodeling, and spinal memory mechanisms. Exp Neurol. 235 (1), 142-151 (2012).
- Wolpaw, J. R., Tennissen, A. M. Activity-dependent spinal cord plasticity in health and disease. Annu Rev Neurosci. 24, 807-843 (2001).
- Schafer, D. P., et al. The "quad-partite" synapse: Microglia-synapse interactions in the developing and mature CNS. Glia. 61 (1), 24-36 (2013).
- Mukhopadhyay, S., et al. Manganese-induced trafficking and turnover of the cis-Golgi glycoprotein GPP130. Mol Biol Cell. 21 (7), 1282-1292 (2010).
- Jung, S., et al. Analysis of fractalkine receptor CX(3)CR1 function by targeted deletion and green fluorescent protein reporter gene insertion. Mol Cell Biol. 20, 4106-4114 (2000).
- Knobloch, M., Mansuy, I. M. Dendritic spine loss and synaptic alterations in Alzheimer's disease. Mol Neurobiol. 37 (1), 73-82 (2008).
- Masliah, E., et al. Synaptic remodeling during aging and in Alzheimer's disease. J Alzheimers Dis. 9 (3 Suppl), 91-99 (2006).
- Yoshiyama, Y., et al. Synapse loss and microglial activation precede tangles in a P301S tauopathy mouse model. Neuron. 53 (3), 337-351 (1016).
- Milnerwood, A. J., Raymond, L. A. Early synaptic pathophysiology in neurodegeneration: insights from Huntington's disease. Trends Neurosci. 33 (11), 513-523 (2010).
- Noda, M., Suzumura, A. Sweepers in the CNS: Microglial Migration and Phagocytosis in the Alzheimer Disease Pathogenesis. Int J Alzheimers Dis. , (2012).
- Rotshenker, S. Microglia and macrophage activation and the regulation of complement-receptor-3 (CR3/MAC-1)-mediated myelin phagocytosis in injury and disease. J Mol Neurosci. 21 (1), 65-72 (2003).
- Smith, M. E. Phagocytosis of myelin in demyelinative disease: a review. Neurochem Res. 24 (2), 261-268 (1999).
