Summary
Les microglies sont les cellules immunitaires résidentes du système nerveux central (SNC) avec une grande capacité à phagocyter ou engloutir matériau dans leur environnement extracellulaire. Ici, un test largement applicable, fiable et hautement quantitative pour la visualisation et la mesure de l'engloutissement de la microglie médiation de composants synaptiques est décrite.
Abstract
La phagocytose est un procédé dans lequel une cellule engloutit matériau (cellule entière, des parties d'une cellule, des débris, etc) dans son environnement extracellulaire environnant et digère ce matériau, généralement par suite, la dégradation lysosomale. Les microglies sont les cellules immunitaires résidentes du système nerveux central (SNC) dont la fonction phagocytaire a été décrit dans une large gamme de conditions de maladie neuro-dégénérative (par exemple, la clairance de la bêta-amyloïde dans la maladie d'Alzheimer) pour le développement du cerveau en bonne santé (par exemple, synaptique élagage) 1-6. Le protocole suivant est un test de l'engloutissement développé de visualiser et de quantifier l'engloutissement de la microglie médiation d'entrées synaptiques dans le développement du système de retinogeniculate de la souris 7. Bien que cet essai a été utilisé pour évaluer la fonction de la microglie dans ce contexte particulier, une approche similaire peut être utilisée pour évaluer d'autres phagocytes dans l'ensemble du cerveau (par exemple, les astrocytes) et le reste du corps(par exemple, les macrophages périphériques) ainsi que d'autres contextes dans lesquels remodelage synaptique se produit (par exemple, une lésion cérébrale / maladies).
Introduction
Circuits synaptiques remodeler tout au long de la vie d'un animal. Dans le développement du cerveau, les synapses se forment dans l'excès et doivent subir l'élagage synaptique qui implique l'élimination sélective d'un sous-ensemble de synapses et le maintien et le renforcement de ces synapses qui restent 8-10. Ce procédé est nécessaire pour réaliser la connectivité caractéristique précise du système nerveux adulte. Chez l'adulte, les synapses peuvent également être en plastique, en particulier dans le contexte de l'apprentissage et de la mémoire. Les corrélats structurels de cette plasticité sont pensés pour inclure l'ajout et / ou l'élimination des épines dendritiques et boutons présynaptiques 11-13. En plus de ces rôles dans le système nerveux sain, remodelage synaptique est également impliqué dans une maladie du système nerveux / blessures 12,14,15. Par exemple, suite à une blessure de la moelle épinière, les axones sectionnés doivent ensuite remodeler et former de nouvelles synapses pour atteindre fonctionnelle 16-19 de récupération.
nt "> émergents comme un aspect important de la plasticité synaptique est le processus de phagocytose ou l'engloutissement des synapses destinés à l'élimination 3,5,20. Nous avons récemment montré ce phénomène dans le contexte de l'élagage synaptique dans le, cerveau de souris postnatale sain 7. précisément , les microglies, les cellules résidentes et les phagocytes immunitaires du système nerveux central, ont été présentés à engloutir entrées synaptiques au cours d'une période de pointe et dans une région de la taille synaptique développement, la dorsale postnatale latérale corps genouillé (dLGN) du thalamus. blocus génétique ou pharmacologique de cette immersion entraîné des déficits soutenus dans la connectivité synaptique.Dans ce protocole, nous décrivons un test fiable et hautement quantitative pour mesurer l'engloutissement de phagocyte médiation d'entrées synaptiques. Pour les besoins de cet article, ce dosage sera présentée dans le contexte du système retinogeniculate développement, qui comprend des cellules ganglionnaires de la rétine (RGC) résidant dans la rétine quiINVESTISSEMENTS présynaptiques à la dLGN (figure 1A). Pour commencer, une stratégie d'étiquetage antérograde résistant à la dégradation lysosomale sera décrite, qui est utilisé pour visualiser les entrées synaptiques RGC-spécifiques dans le dLGN (Figure 1) 7,21. Après cette description, une méthodologie détaillée pour l'imagerie et la mesure quantitative de l'engloutissement utilisant la microscopie confocale combinée à 3 dimensions (3D) surface rendu de volume sera donnée. Cette méthodologie est basée sur la préparation de tissu fixe mais peut aussi être adaptée pour être utilisée dans des études d'imagerie en direct. Fait important, alors que le dosage a été validé dans le contexte du système de retinogeniculate sain, postnatal, on pourrait appliquer les mêmes techniques pour évaluer d'autres interactions phagocyte des neurones dans tout le cerveau et pendant la maladie, ainsi que la fonction des phagocytes dans les autres systèmes de l'organisme.
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Protocol
1. Antérograde étiquetage des RGC présynaptiques Entrées
Remarque: Toutes les expériences impliquant l'utilisation d'animaux ont été examinés et supervisés par le soin des animaux et l'utilisation comité institutionnel (IACUC) en conformité avec toutes les directives du NIH.
- Stériliser champ et instruments.
- Anesthésier la souris avec 4 vol% d'isoflurane dans une chambre d'induction plexiglas (ce vol% d'isoflurane fonctionne pour les souris néonatales adulte). Respecter les souris de près pour éviter de trop-anesthésiant. ATTENTION: Éviter l'inhalation d'une évacuation des gaz d'échappement de vide.
- Après 1-3 min, (souris âgées auront besoin de moins de temps) d'assurer le niveau approprié de l'anesthésie est réalisée en pinçant la queue (pas de réaction doit être observé) et en observant le taux de respiration (taux devrait être lente et régulière).
- Placez la souris sous le microscope stéréo sur le côté et le lieu cône livraison 3-4% en volume isoflurane sur le museau (nouveau-nés <10 jours après la naissance (P10) ~ 4% en volume;> P10 ~ 3% en volume).
- Exposer la sclérotique. Pour l'injection de nouveau-nés avant l'ouverture des yeux, utiliser une paire de petits ciseaux à ressort pour ouvrir la paupière et retirer la peau pour exposer la sclérotique. Pour les souris plus âgées, utiliser les doigts pour retirer la peau autour des yeux pour exposer la sclérotique. ATTENTION: les nouveau-nés, parfois une autre coupe perpendiculaire au coin de l'œil est nécessaire. Faites attention lorsque vous couper le coin de la paupière comme il est un vaisseau sanguin qui, si elles sont coupées, va saigner trop.
- Utilisez une aiguille de 30,5 G stérile pour percer un petit trou dans le côté de l'œil à la ligne où la sclérotique commence. Prenez soin de ne pas endommager la lentille en insérant l'aiguille juste assez loin pour que le biseau va dans l'œil.
- Laisser le corps vitré de s'écouler hors du trou et d'utiliser un applicateur de coton-tige stérile pour absorber le liquide.
- Une fois le corps vitré a cessé de s'écouler hors du trou, insérer une aiguille à extrémité émoussée fixé à une seringue Hamilton préchargé avec antérograde traçage colorantdans le trou. ATTENTION: Insérez l'aiguille lentement pour éviter la perforation de l'autre côté de l'œil ou d'endommager la lentille.
- Injecter lentement colorant dans l'œil. Typiquement, la toxine cholérique sous-unité β conjugué à Alexa 594, 647, ou 488 (CTB-594, CTB-647, ou CTB-488, 5-6 pg / pl) est utilisé à des entrées de RGC antérograde l'état de traces. Pour les nouveau-nés (≤ P10) 1-2 pi est suffisante et pour les souris> P10 ~ 3 pi est suffisante. Remarque: colorants Alexa sont particulièrement résistants à la dégradation lysosomale
- Laissez l'aiguille dans le trou pendant quelques secondes, puis retirez lentement.
- Utilisez un coton applicateur incliné pour absorber l'excès de liquide et éviter colorant de s'échapper.
- Appliquez une petite quantité de pommade antibiotique pour les yeux. Si l'œil a été chirurgicalement ouvert, repositionner délicatement les paupières ensemble.
- Si l'injection de deux yeux, répéter la procédure sur l'autre œil.
- Après l'injection (s), laissez la souris sous une lampe chauffante ou sur un tapis de chaleur jusqu'à ce qu'il commence à se remettre de l'anesthEIES.
- Retour à la souris une cage de maison propre et surveiller pour s'assurer qu'il est complètement réveillé avant de revenir à la colonie.
2. Préparer tissus pour l'imagerie
Ce protocole de préparation de tissu est utilisé pour les souris rapporteurs dans lequel les phagocytes sont marquées avec des marqueurs fluorescents (par exemple, CX3CR1-EGFP pour microglie). Si une ligne de journaliste n'est pas disponible, l'enquêteur peut immunomarquage des coupes de tissus (voir Discussion).
- ~ 24 heures après l'injection, le sacrifice de la souris et disséquer le cerveau.
- Déposer fixer le cerveau dans un tube Falcon rempli avec du paraformaldéhyde 4% (PFA) pendant une nuit à 4 ° C. ATTENTION: PFA est toxique. Éviter l'inhalation et l'exposition de la peau à l'aide d'une hotte ou sur une table aspirante et de porter un équipement de protection individuelle. Notes: fixation peut être plus courte (≥ 4 h). En outre, au lieu de la fixation à goutte, 4% de PFA perfusion peut être utilisée suivie par une solution de 2 à 24 heures de chute. Toutefois, la comparaison des perfused abandonner cerveaux néonatales et adultes fixes n'a révélé aucune différence de qualité d'image ou la quantification.
- Rincer les 3x du cerveau dans du tampon phosphate salin (PBS).
- Verser le cerveau et PFA dans un bateau peser vide.
- Utilisez une spatule pour transférer le cerveau à l'autre peser bateau rempli de PBS.
- Laver cerveau deux fois dans du PBS (transfert cerveau à deux plus peser bateaux remplis de PBS).
- Transférer le cerveau à un tube Falcon rempli d'une solution de saccharose à 30%. Laisser le cerveau en sucrose à 4 ° C jusqu'à ce que le cerveau coule au fond du tube (24-48 h).
- Une fois le cerveau coule, préparer le cerveau pour la coupe. Les étapes suivantes sont préparation de 40 um sections flottantes en utilisant un microtome à glissière avec une étape de congélation (un cryostat peut aussi être utilisé).
- Utilisez une lame de rasoir pour enlever les parties du cerveau qui ne sont pas nécessaires (pour la dLGN, enlever les parties rostrales et caudales du cerveau).
- Congeler le soutien-gorgedans le papier d'aluminium de la glace sèche. Pendant ce temps, l'étape de congeler microtome et remplir chaque puits d'une plaque à 24 puits avec 0,5 ml de 0,1 M de tampon phosphate (PB).
- Montez le cerveau congelé (il devrait apparaître opaque) sur la scène de congélation.
- Appliquez une petite quantité de composé optimale de la température de coupe (OPO) pour la scène.
- Une fois les PTOM commence à geler, mettre le cerveau dans les PTOM. La fin du cerveau qui sera coupée doit être orientée vers le haut (par exemple, pour la dLGN, face au côté caudale vers le haut).
- Couvrir le cerveau et PTOM à la glace sèche très finement broyée.
- Ajouter de la glace sèche sur le cerveau / PTOM pour ~ 30 sec.
- Utilisez un pinceau large pour enlever la glace sèche. Le cerveau ainsi qu'entre PTOM et doivent être congelés à la scène.
- Commencer la découpe à travers le tissu jusqu'à ce que la région d'intérêt (ROI) est atteinte.
- Une fois le retour sur investissement est atteint, utiliser un petit pinceau pour enlever les sections de la lame et de les transférer à la plate 24 puitse contenant 0,1 M PB (étape 2.5.2). Maintenir le pinceau humide en le mouillant dans le PB 0,1 M avant d'enlever les sections de la lame. Remarque: Les articles peuvent être laissés dans 0,1 M PB nuit à 4 ° C.
- Une fois les articles ont été collectés, visualiser l'étiquetage antérograde sous une dissection microscope à fluorescence et de choisir les sections qui contiennent le retour sur investissement.
- Montez les sections sur une lame avec un petit pinceau.
- Appliquez une petite piscine de 0,1 M PB à une lame de microscope chargé.
- Transférer la section de tissu à la piscine de PB.
- Utilisez le PB et pinceau à orienter et à répandre le tissu.
- Utilisez une Kimwipe pour évacuer l'excès de PB. Prenez soin d'éviter mèche de la section.
- Laisser complètement sécher à l'air.
- Appliquez une petite goutte de milieu de montage dans chaque section et monter une lamelle sur le dessus (22 x 50 mm, n ° 1.5).
- Sceller les bords de lame avec le vernis à ongles et conserver à -20 ° C jusqu'à ce que la session d'imagerie. Remarque: Bien que l'imagerie pardans une semaine de préparation est conseillé, diapositives peuvent être maintenus à -20 ° C pendant plusieurs semaines avant l'imagerie.
3. Imagerie tissulaire
Toutes les images sont acquises sur un disque rotatif microscope confocal (UltraView Vox disque tournant de microscope confocal équipé de lasers à diode (405 nm, 445 nm, 488 nm, 514 nm, 561 nm et 640 nm)). Les images peuvent également être acquises sur un microscope avec la possibilité d'acquérir haute résolution z-piles (par exemple, microscope à balayage laser confocal, microscope à épifluorescence suivie par déconvolution, etc.) La taille de trame est généralement 1000 x 1000 pixels.
- Trouver ROI à un grossissement de 10X et acquérir une image. Pour imager la microglie dans le système de retinogeniculate, le retour sur investissement est les sections de dlgn plus médiales.
- Passer à un plus fort grossissement (un objectif 60X plan Apo, NA = 1,4, est généralement utilisé).
- Acquérir premier champ de vision contenant phagocytes utilisant 0,2 um z-étapes.
- Acquérir 15-19 plusieurs champs contenant des phagocytes par animal.
4. Préparer Images pour quantification (ImageJ)
- Ouvrir z-pile dans ImageJ.
- Allez dans le menu Image, sélectionnez la couleur et les chenaux séparés.
- Soustraire le fond du canal (s) contenant le matériau englouti.
- Sélectionnez la fenêtre du canal contenant le matériau englouti (par exemple, les entrées synaptiques).
- Allez dans le menu des processus et choisir le fond Soustraire. Utilisez un rayon de bal de 10 pixels pour antérograde traçage des entrées synaptiques dans le dLGN. Remarque: Le rayon de roulement à billes est déterminée de manière empirique. Cependant, il doit généralement être aussi grand que le rayon du plus grand objet dans l'image qui ne fait pas partie de l'arrière-plan.
- Lisser le canal contenant le phagocyte.
- Sélectionnez la fenêtre du canal contenant le phagocyte (par exemple, la microglie).
- Allez dans le menu des processus et select Filtres, moyennes. Utilisez un filtre moyen de 1,5 (ce adoucit l'image pour le rendu de surface dans les étapes ultérieures).
- Soustraire fond du canal contenant le phagocyte.
- Sélectionnez la fenêtre du canal contenant le phagocyte (par exemple, la microglie).
- Allez dans le menu Processus, sélectionnez fond soustraction (paramètres devront être déterminée de manière empirique). Utilisez un rayon de bal de 50 pixels pour la microglie EGFP-positif.
- Fusionner canaux en allant dans le menu de l'image et en sélectionnant Couleur, fusionner des couches.
- ROI des cultures contenant phagocyte de fichier fusionné (ce qui rend la surface de rendu plus rapide, voir l'étape 5).
- Dessinez un cadre autour de la ROI en utilisant l'outil de sélection rectangulaire dans la barre d'outils.
- Allez dans le menu Image et sélectionnez Rogner.
- Diviser canaux de nouveau (voir l'étape 4.2).
- Enregistrez chaque canal comme son propre fichier TIFF.
5. Préparer l'image pour la quantificationdans Imaris
- Imaris ouverts et assurez-vous que l'icône de volume est sélectionné dans le menu en haut à gauche (figure 2).
- Ouvrir premier canal de l'image recadrée (un des canaux peut être ouvert en premier, juste être cohérent).
- Ajouter l'autre voie (s). Allez dans le menu Edition, sélectionnez Ajouter des chaînes et sélectionner le canal suivant dans le fichier. (Répétez cette étape pour tous les autres canaux). Remarque: Pour modifier la couleur, allez à la fenêtre de réglage de l'affichage et cliquez sur le nom de la chaîne (figure 3A). Cela fera apparaître une boîte de dialogue pour ajuster la couleur. Si la fenêtre de réglage de l'affichage n'est pas visible, allez dans le menu Edition et sélectionnez Réglage de l'affichage.
- Ajuster les valeurs de pixels. Allez dans le menu Edition et sélectionnez Propriétés de l'image. Dans cette fenêtre, ajuster x, y, z et les valeurs de pixel (Ces valeurs dépendent du microscope, l'objectif, la caméra et l'acquisition z-pas et peuvent être trouvés dans le logiciel utilisé pour acquérir l'image).
- Etape 5.5 entraînera une trèspetite image. Pour redimensionner, cliquez sur l'icône Fit dans le coin en bas à droite (figure 2).
- Dans la fenêtre de réglage de l'affichage, de régler la luminosité et le contraste pour chaque canal en utilisant les triangles gauche et du milieu.
6. 3 dimensions (3D) Rendu de surface de la Phagocyte
- Dans la barre d'outils en haut, assurez-vous le mode Dépasser est sélectionné (figure 3C).
- Dans la fenêtre de réglage de l'affichage, décochez tous les canaux sauf le canal de phagocyte. Ce sera les retirer du champ de vision.
- Cliquez sur l'icône de rendu de surface (Figure 2).
- Une fenêtre de création sera affiché dans le coin inférieur gauche (figure 4A), assurez-vous Segment ROI n'est pas cochée dans cette première fenêtre. Cliquez sur le bouton bleu vers l'avant en bas.
- Réglez le lissage.
- Dans la fenêtre suivante, choisissez le canal des phagocytes dans le menu déroulant (figure 4B). Permet de régler lequantité de détails qui sera refait surface et doit être déterminé de manière empirique (0,1 um lissage est généralement utilisé pour la microglie).
- Sélectionner un seuil absolu.
- Cliquez sur le bouton bleu vers l'avant en bas.
- Seuil de l'image.
- Cliquez sur l'histogramme et glisser jusqu'à l'image est apparue appropriée (figure 4C). Ceci est déterminé de manière empirique par rotation de l'image pour assurer que les surfaces grises superposées sur l'image fluorescente sont une représentation de surface précise. Notes: Pour faire pivoter, sélectionnez Naviguer dans le menu Pointeur sur le côté supérieur droit de l'écran (figure 3B), cliquez et maintenez image à faire pivoter. Image pour revenir à l'orientation originale, sélectionnez Bas d'origine gauche dans le menu Affichage.
- Cliquez sur le bouton bleu vers l'avant en bas.
- Dans la fenêtre suivante, il ya une option pour filtrer les surfaces par taille, etc Sauf image est très bruyant, ne pas filtrer et supprimer unfiltres y qui apparaissent automatiquement. Cliquez sur la flèche verte en bas pour terminer surface rendant le phagocyte. Un nouvel ensemble d'onglets apparaît (Figure 5)
- Si nécessaire, supprimez toutes les surfaces qui ne font pas partie du phagocyte d'intérêt.
- Assurez-vous que l'option Sélectionner est sélectionné dans le menu Pointeur (figure 3B).
- Cliquez sur n'importe quelle surface pour être supprimé afin qu'il devienne jaune. Pour supprimer plusieurs surfaces, cliquer sur les surfaces tout en maintenant enfoncée la touche de commande.
- Cliquez sur Supprimer dans l'onglet Crayon.
- Sélectionner et fusionner toutes les surfaces du phagocyte dans une surface.
- Cliquez sur l'entonnoir (c'est à dire de l'onglet Filtre, figure 5C).
- Cliquez sur Ajouter.
- Choisissez n'importe quel filtre, faites glisser l'histogramme à l'extrême gauche (toutes les surfaces doivent être de couleur jaune).
- Retour à l'onglet Crayon et cliquez sur Unify.
- Accédez à l'onglet de graphique (figure 5A (figure 5D). Pour l'affichage de plusieurs paramètres, accédez à l'icône de la clé en bas à gauche (figure 2) et sélectionner les paramètres à enregistrer.
- Noter le volume du phagocyte et enregistrer le fichier avant de continuer.
7. Rendu de surface 3D de Engulfed Matériel
- Créer un nouveau canal pour le matériel qui a été englouti par le phagocyte.
- Bien que la surface des phagocytes est sélectionné, cliquez sur l'onglet de crayon.
- Cliquez masque tout.
- Dans le dialogue qui apparaît, sélectionnez le canal correspondant au matériel englouti (par exemple, le traçage antérograde d'entrées synaptiques; figure 5B).
- Vérifiez canal double avant d'appliquer le masque et cliquez sur OK.
- Un nouveau canal apparaît dans la fenêtre de réglage de l'affichage qui ne contient que le matériel qui a été englouti et est à l'intérieur duphagocyte.
- Rendre la surface du canal contenant des matières Engulfed et nonengulfed totale.
- Décochez toutes les voies dans la fenêtre de réglage de l'affichage, sauf pour le canal à surface et décocher la surface créée pour le phagocyte.
- Cliquez sur l'icône rendu de surface à nouveau (voir l'étape 6.3) et créer une surface pour le canal en utilisant les mêmes étapes que celles décrites pour le phagocyte (étapes 06.04 à 06.11). Remarques: Veillez à sélectionner le bon canal avant de lissage et d'un seuil (étape 6.5, figure 4B). Prenez note de la valeur de seuil (voir l'étape 6.6, figure 4C). Cette valeur peut également être obtenu après le rendu de la surface est complet (onglet Wand; figure 5A).
- Noter le volume de la matière englouti et non englouti totale et enregistrer le fichier avant de continuer.
- Surface rendre matériau englouti (matériau dans le phagocyte).
- Visualiser la fluorescence de seulementla nouvelle chaîne de matériel englouti (voir l'étape 7.2.1).
- Suivez les mêmes étapes que ci-dessus (étapes 7,2-7,3). Remarques: Veillez à sélectionner le canal approprié dans le menu déroulant avant de lissage (choisir la nouvelle chaîne créée à l'étape 7.1). Dans la fenêtre de seuil, entrez manuellement la valeur de seuil qui a été fixé pour rendre le matériau englouti et non englouti totale (voir l'étape 7.2.2).
- Noter le volume de la matière englouti et enregistrer le fichier avant de continuer.
8. Calculer le volume total de la Champ de vision
- Créer une nouvelle surface de n'importe quel canal.
- Dans la fenêtre de seuil (étape 6.6), faites glisser l'histogramme tout le chemin à la gauche de sorte que tout le champ est apparue.
- Terminez surfaçage tout le champ et noter le volume (étapes 6.7 à 6.11).
- Enregistrez le fichier.
9. Calculez le montant de phagocyté Matériel
- Calculer la densité de l'canal englouti totale et non englouti matériau à l'aide de l'algorithme suivant:
Volume total de Engulfed et non Engulfed Matériel (étape 7.3) / Volume de champ (étape 8). - Calculer le% d'engloutissement par cellule en utilisant l'algorithme suivant:
(Volume de Engulfed Matériel (étape 7.5) / Volume total du phagocyte (étape 6.11)) x 100
Notes: Pour tenir compte des variations de la taille des cellules, les données sont normalisées au volume total du phagocyte. Si les chiffres de l'étape 9.1 sont très variables à travers les champs, il peut être nécessaire de normaliser les données de l'étape 9.2 pour le calcul en 9.1.
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Representative Results
Récemment, nous avons utilisé ce test de l'engloutissement de visualiser et de quantifier l'engloutissement de la microglie médiation d'entrées synaptiques dans le système retinogeniculate développement (Figure 1) 7. CGR de souris hétérozygotes CX3CR1-EGFP ont été tracées avec antérograde CTB-594 et CTB-647 dans les yeux droit et gauche, respectivement. Après ce traçage, la microglie EGFP-positives dans le dLGN ont été imagées. Ces images ont ensuite été surface-rendus pour les mesures de volume.
Grâce à cette technique, nous avons constaté que pendant une période de pointe de remodelage synaptique développement dans le dLGN (P5), les entrées synaptiques sont engloutis par la microglie (figure 6). Aussi peu que 4 jours plus tard, quand une grande quantité de remodelage est presque complète (P9), on observe une réduction spectaculaire de la quantité d'entrées englouties. En outre, l'engloutissement et l'élagage sont perturbés chez les souris déficientes en protéines appartenant à la cascade du complément classique(Figure 6) ainsi qu'à la suite de la décharge neuronale manipulation (données non présentées) 7.
Figure 1. Stratégie pour évaluer l'engloutissement de la microglie médiation de RGC entrées présynaptiques 7. A) Schéma de antérograde stratégie de traçage. Entrées gauche et l'œil droit RGC sont tracées avec CTB-647 (bleu) et CTB-594 (rouge), respectivement. Microglie médiation (vert) engloutissement d'entrées est ensuite évaluée. B) Une image de faible grossissement représentant de jour postnatal de dLGN 5 (P5) de souris après antérograde traçage de gauche (bleu) et droite (rouge) des entrées de l'oeil. Barre d'échelle = 100 um. Ci) A la microglie (EGFP, vert) échantillonnés à partir de la région frontalière de gauche (bleu) et droite (rouge) entrées de l'oeil (encastrés dans B). Cii) Ciii) rendu de surface de la microglie et englouti entrées RGC. incréments de ligne de la grille = 5 um. Di) Un représentant microglie (vert, EGFP) de P5 dLGN. Révélant entrées RGC sont étiquetés avec CTB-594 (rouge) et les lysosomes sont étiquetés avec anti-CD68 (bleu). Dii) Tous CTB fluorescence en dehors du volume de la microglie a été supprimé englouti entrées RGC (rouge) et les lysosomes (bleu) dans la microglie . (vert) Diii) La plupart des entrées RGC (en rouge) sont complètement localisés dans les lysosomes CD68-positif (bleu, flèches blanches) Div-v) Le CD68 (Div) et de la CTB (Dv) canaux seul.. Barre d'échelle = 10 um. S'il vous plaît cliquer ici pour voir une version plus grande de cette figure.
Figure 2. Icônes de logiciels Imaris.
Figure 3. Des fenêtres générales de navigation dans le logiciel. A) La fenêtre de réglage de l'affichage. B) Le pointeur de la fenêtre. Sélectionnez permettra la sélection de surfaces spécifiques. Naviguer permettra la rotation d'une image dans le champ de vision. C) Il est nécessaire d'être en mode Surpass pour surface rendant le volume.
Figure 4. Rendu de surface dans le logiciel. A) La fenêtre Créer. B) Lissement fenêtre. Sélectionnez le canal à la surface à partir du menu déroulant (surligné en jaune). C) Seuillage la surface de l'image fluorescente. Marqué par la boîte rouge est la valeur de seuil qui devrait être comptabilisé pour le matériel englouti et non englouti totale. Ce numéro sera utilisé plus tard pour le seuil et la surface du matériau englouti. S'il vous plaît cliquer ici pour voir une version plus grande de cette figure.
Figure 5. L'obtention de mesures de volume dans le logiciel. A) Les onglets qui apparaissent rendu de surface suivant. Notez la baguette, Crayon, entonnoir, et les onglets Graphique qui sont identifiés dans le texte. B) Le Masque disposent tous de visualiser matériel englouti dans le phagocyte. Notez le canal sélectionné (vousllow encadré). C) La fonction sous l'onglet Entonnoir / Filtre permet la sélection de toutes les surfaces dans le domaine en faisant glisser l'histogramme tout le chemin à la gauche de sorte qu'il apparaît en jaune. Tout filtre peut être choisi pour cela. D) Sous l'onglet Graphique, les mesures de volume peuvent être obtenues et consignées. S'il vous plaît cliquer ici pour voir une version plus grande de cette figure.
Figure 6. Des données représentatives 7. A) représentatif de la microglie surface-rendu de P5 (image fluorescente est représentée sur la figure 1), P9, P30 et dLGN de la souris. Encarts élargis identifiées par un trait pointillé noir.incréments de ligne de la grille = 5 um. B) L'enlisement des entrées RGC est significativement augmenté lors de la taille maximale de la dLGN (P5) par rapport à un âge plus avancé (P9 et P30). * P <0,001 par ANOVA, n = 3 souris / âge. C) microglies provenant de souris déficientes en récepteur de complément 3 (KO, barre noire) engloutir beaucoup moins d'intrants RGC que par rapport à la même portée WT (barre blanche). Toutes les données sont normalisées à des valeurs témoins WT. * P <0,04 par le test t de Student, n = 3 souris / génotype. Toutes les barres d'erreur représentent sem Cliquez ici pour agrandir l'image.
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Discussion
Afin de mesurer avec précision la phagocytose, matériel englouti doit être étiqueté de manière à ce que le chercheur peut visualiser une fois la dégradation lysosomale s'est produite. En outre, l'imagerie haute résolution est nécessaire, suivie par l'utilisation d'un logiciel qui va permettre au chercheur de visualiser le volume de la cellule entière et quantifier son contenu. Dans ce protocole, nous décrivons une méthode très fiable et quantitative pour mesurer l'engloutissement de phagocyte médiation utilisant CTB conjugué à colorants Alexa pour marquer matériel englouti combinée avec la microscopie confocale à haute résolution et la reconstruction 3D. Cette méthodologie a été utilisée dans notre laboratoire pour analyser avec succès la microglie médiation-engloutissement d'entrées synaptiques subissant remodelage synaptique dans le cerveau de souris en développement (système de retinogeniculate) 7. En outre, il s'est avéré être une technique très sensible qui permet de distinguer des changements subtils dans l'engloutissement dans les différents âges de développement under conditions non pathologiques et entre les souris de type sauvage et knock-out. Avec quelques ajustements mineurs, ce protocole peut être adapté pour étudier l'engloutissement dans les tissus vivants par lapse imagerie en temps. En outre, ce protocole peut être appliqué pour étudier les interactions phagocyte des neurones dans la maladie.
Mises en garde
L'un des aspects les plus utiles de ce test est sa capacité à étiqueter des projections neuronales de manière à ce qu'elles restent accessibles après être entré dans une voie de dégradation lysosomale. Cependant, parce que le neurone est marqué, il peut être difficile de distinguer quelle partie de la cellule a été phagocytés. Cela nécessite une analyse très approfondie régional (par exemple, dans la région synaptique par rapport à une région non-synaptique de la dLGN) combinée avec la microscopie électronique 7. En outre, cela peut s'avérer plus difficile dans d'autres régions du cerveau où les corps et les projections de cellules neuronales se trouvent dans le même secteur. Toutefois, les stratégies en matière d'étiquetage de rechange peuvent être utilisés (voir beloe). En outre, en raison des limites de résolution de la microscopie optique, il existe une possibilité que l'on peut surestimer la quantité de matière englouti. Par conséquent, il faut prendre soin de vérifier que la matière à l'intérieur des lysosomes est englouti. Pour cette raison, nous utilisons anti-CD68 pour étiqueter les lysosomes dans la microglie, rendu 3D, et les vues orthogonales pour valider les paramètres de l'essai.
Types de cellules
En plus de la microglie, cette méthode peut également être appliquée pour analyser le rôle des autres phagocytes dans le cerveau (par exemple, les astrocytes) et dans les systèmes immunitaires et nerveux périphérique (par exemple, les cellules de Schwann périsynaptiques, macrophages, etc.) En outre, parce que la CTB conjugué à des colorants Alexa est donc facilement absorbé par la plupart des cellules, une stratégie de marquage similaire peut être utilisée pour marquer un matériau englouti dans tout le cerveau et d'autres systèmes organiques.
Étiquetage des Engulfed Matériel
A titre d'alalternative à la CTB conjugué à colorants Alexa, nous avons utilisé les stratégies suivantes pour marquer matériel englouti 7: 1) souris de rapporteur fluorescent dans lequel CGR ont été marqués par une protéine fluorescente (par exemple, tdTomato, EGFP, etc.) 2) l'étiquetage antérograde avec un colorant pHrodo conjugué à du dextrane, d'un colorant qui entre en fluorescence seulement une fois qu'il est dans un lysosome. L'utilisation de ces différentes stratégies, la visualisation et la quantification des entrées présynaptiques englouti dans les microglies peuvent être performedwith les mêmes techniques d'imagerie et de quantification. Cependant, les conjugués Alexa de colorant sont les plus robustes en raison de la forte résistance de Alexa colorant à lysosomales hydrolases 7,21. En outre, l'étiquetage des matériaux englouti avec des anticorps (par exemple, anti-VGLUT2, une protéine vésiculaire présynaptique) a été tentée. Cependant, il s'agit d'une méthode relativement fiable de détection étant donné que la plupart des protéines sont rapidement décomposés fois dans les lysosomes. Il est difficile de distinguer à faible fluorescence dueà la dégradation des protéines sur fond.
Animaux utilisés
Dans le protocole actuel, les microglies sont marquées par fluorescence en utilisant des souris génétiquement rapporteurs fluorescents (CX3CR1-EGFP) 22. Cependant, il ya des cas où l'étiquetage des anticorps contre l'expression génétique des constructions rapporteurs fluorescents est nécessaire. Par exemple, lorsque des souris rapporteurs fluorescents sont pas disponibles pour le phagocyte d'intérêt, l'utilisation de rats est nécessaire, ou le chercheur souhaite regarder souris knock-out sans les traverser en une ligne de souris rapporteur fluorescent. Pour des cas comme ceux-ci, les phagocytes peuvent être marqués par immunohistochimie et les données sont comparables aux résultats d'expériences utilisant rapporteur fluorescent souris 7. Après sectionnement de tissu, nous utilisons généralement un protocole d 'immuno norme pour les sections flottantes 7. Il est important de choisir un anticorps dirigé contre une protéine qui va étiqueter la totalité de la cellule etses processus. Par exemple, pour la microglie d'étiquette, l'anti-Iba1 peut être utilisé.
Applications plus larges: l'imagerie en direct et la maladie
Bien que ce protocole est basé sur l'analyse des tissus fixés, de légères modifications permettraient à la même analyse des images acquises par imagerie en temps réel. Après une séance faute de l'imagerie en temps, les z-piles suivantes peuvent être traitées identiques aux étapes 4-9 dans ce protocole. En outre, alors que nous avons appliqué ce protocole pour visualiser l'engloutissement des synapses au cours remodelage synaptique développement dans le SNC en bonne santé, ce protocole peut également être appliquée dans les modèles de la maladie. En particulier, ce protocole peut être utilisé pour étudier des maladies dans lesquelles les synapses subissent un remodelage important, comme dans le cas d'une perte de synapses et de régénération après une lésion de la moelle épinière, de la perte des synapses début associée à la maladie d'Alzheimer, etc 12,14-19,23 - 26. En outre, on peut également adapter cette technique pour étudier les maladies dans lesquelles phagocytosis d'un matériau autre que les synapses a été décrite, telles que les microglies / immersion dans les macrophages à médiation de la myéline dans la maladie démyélinisante (par exemple, la sclérose en plaques) et l'engloutissement de bêta-amyloïde dans la maladie d'Alzheimer 5,6,27-29.
En conclusion, le dosage de l'engloutissement décrit ici offre une technique pratique, reproductible et sensible pour étudier les interactions phagocytaires avec leur environnement extracellulaire. Important, ce dosage a une large gamme d'utilisations et de capacités qui serviront la communauté des neurosciences ainsi que ceux qui travaillent dans d'autres systèmes d'organes.
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Disclosures
Aucun conflit d'intérêt déclaré.
Acknowledgments
Travail a été soutenu par des subventions de la Fondation de la famille Smith (BS), Dana Foundation (BS), John Scholars Program Merck (BS), NINDS (RO1-NS-07100801, BS), NRSA (F32-NS-066 698; DPS), Nancy Fondation Lurie Marks (DPS), NIH (P30-HD-18655; MRDDRC Imaging Core).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Heat pad | Vet Equip, Inc. | 965500 | |
| Warm water source for heat pad | Kent Scientific | TP-700 | |
| Stereo microscope | DSC Optical | Zeiss Opmi -6 Surgical Microscope | |
| Sliding microtome with freezing stage | Leica | SM2010 R | |
| Microtome blade | Leica | 14021607100 | |
| Fluorescent dissecting microscope | Nikon | SMZ800 with Epi-fluorescence attachment | |
| Spinning disk confocal microscope | Perkin Elmer | UltraView Vox Spinning Disk Confocal | |
| 10 µl Hamilton gas tight syringes | Hamilton | 80030 | Use a different syringe for each color dye/tracer |
| Hamilton needles | Hamilton | 7803-05, specifications: blunt, 1.5" | |
| Alexa-conjugated cholera toxin β subunit (CTB) | Invitrogen | 488: C22841 | Reconstitute in sterile saline, 80 µl (488), 100 µl (594), 20 µl (647) |
| 594: C22842 | |||
| 647: C34778 | |||
| Phosphate Buffered Saline (PBS) | Sigma | P4417-50TAB | |
| Neomycin and Polymyxin B Sulfates and Bacitracin Zinc Ophthalmic Ointment USP (antibiotic ointment) | Bausch & Lomb | 24208-780-55 | |
| 30.5 G needle | Becton Dickinson | 305106 | |
| Spring scissors | Roboz | RS-5630 | |
| Cotton-tipped applicator | Fisher | 23-400-125 | |
| Paraformaldeyde (PFA) | Electron Microscopy Sciences | 15710 | Dilute 16% to 4% in PBS. Paraformaldehye is toxic, use in a fume hood and wear personal protective equipment. |
| Dissection tools – scissors, forceps, spatula | Small scissors: Fine Science Tools | Small scissors:14370-22 | |
| Large scissors: Roboz | Large scissors: RS-6820 | ||
| #55 forceps: Fine Science Tools | #55 forceps: 11255-20 | ||
| Spatula: Ted Pella, Inc. | Spatula: 13504 | ||
| Sucrose | Sigma | S8501-5KG | Make 30% sucrose in PBS (weight/vol) |
| OCT Compound | VWR | 25608-930 | |
| Weigh boat | USA Scientific | 2347-1426 | |
| 24-well plates | BD Biosciences | 353047 | |
| Sodium phosphate monobasic | Sigma | S6566-500G | Make 0.2 M sodium phosphate monobasic (PB-A) in ddH2O and 0.2 M sodium phosphate dibasic (PB-B) in ddH2O. To make 0.1 M PB, combine 19 ml PB-A and 81 ml PB-B, fill to 200 ml with ddH2O |
| Sodium phosphate dibasic | Sigma | S5136-500G | |
| Coverslips, 22 X 50 mm, No. 1.5 | VWR | 48393 194 | |
| Charged microscope slide | VWR | 48311-703 | |
| Vectasheild | Vector Laboratories | H-1200 |
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