Summary
Havlampret miste galdeblære og galdeveje under metamorfose, en proces der ligner humant galdeatresi. En ny fiksering og afklaring metode (klarhed) blev modificeret til at visualisere hele galdetræet hjælp af laser konfokal mikroskopi. Denne metode giver et kraftfuldt værktøj til at studere galde degeneration.
Abstract
Galdeatresi er en sjælden sygdom i vorden, med en anslået 1 i 15.000 frekvens i det sydøstlige USA, men mere almindelig i østasiatiske lande, med en rapporteret frekvens på 1 i 5000 i Taiwan. Selvom meget er kendt om forvaltningen af galdeatresi, dens patogenese er stadig undvigende. Den havlampret (Petromyzon marinus) giver en enestående mulighed for at undersøge mekanismen og progression af galde degeneration. Havlampret udvikle sig gennem tre forskellige livsstadier: larve, parasitter og voksne. Under overgangen fra larver til parasitisk juvenile, havlampret undergå metamorfose med dramatisk reorganisering og ombygning i ekstern morfologi og indre organer. I leveren er hele galdeveje tabt, herunder galdeblære og galdetræet. En nyudviklet metode kaldet "klarhed" blev ændret for at tydeliggøre hele leveren og krydset med tarmen i metamorfe havlampret. Denproces biliær degeneration blev visualiseret og skelnes under havlampret metamorfose ved hjælp af laserscanning konfokal mikroskopi. Denne metode giver et kraftfuldt værktøj til at studere galdeatresi i en unik dyremodel.
Introduction
Havlampret udvikle sig gennem tre forskellige livsstadier 1,2. Larve havlampret (L) tilbringer mest tid i jordhuler som bundlevende filtratorer. Efter at have gået gennem syv metamorfe stadier af dramatiske ændringer i ydre morfologi og reorganisering i indre organer 3, de resulterende unge (JV) indtaste en parasitisk stadium, hvor de lever af blod og vævsvæsker fra host fisk, øge kropsmasse mere end 100 gange . Efter 1,0-1,5 years fodring på værten fisk i havet eller store søer, voksne ophøre fodring i det tidlige forår og migrere ud i floder for at gyde og derefter dø 1,2.
Under metamorfose, det havlampret leveren mister galdeblære og hele galdetræet, en evolutionær mutantfænotypen der efterligner den menneskelige spædbarn sygdom galdeatresi. Infant galdeatresi er en sjælden pædiatrisk leversygdom med svære medicinske komplikationer 4,5,6,7, 8,9,10, men patogenese og ætiologien af galdeatresi er stort set ukendte 4. Patienter med galdeatresi dø inden for to år efter fødslen, medmindre kirurgisk indgreb (Kasai procedure) udføres 5. Efterfølgende disse patienter kræver omfattende kliniske ledelse og ofte levertransplantation 6. Mange teorier galdeatresi ætiopatogenese er blevet foreslået, såsom virusinfektion, medfødte misdannelser, autoimmune sygdomme og toksisk spot. Men bidraget fra hver til udviklingen af galdeatresi stadig usikkert 7,8,9,10.
I modsætning til spædbørn, der lider patologisk galdeatresi undergår havlampret udviklingsmæssigt programmeret galdeatresi uden omfattende necroinflammation, fibrose eller cirrose 10. Dyrene kan lide forbigående cholestase under denne proces 10, men tilpasse sig denne udviklingsmæssige tilstandvia de novo-syntese og sekretion af galdesalte i tarmen efter udviklingsmæssige galdeatresi, udover kendte mekanismer, såsom reduktion af galdesalt syntese i leveren 11. Denne udviklingsproces i havlampret giver den eneste kendte mulighed for at undersøge udviklingen af galdeatresi.
En nyudviklet metode kaldet "klarhed" giver høj opløsning billeddannelse i komplekse pattedyr nervesystemer ved at omdanne intakt væv ind i en optisk transparent nanoporøse hydrogel 12. Brug havlampret lever og en modificeret CLARITY-protokollen, kan intakt væv billeddannelse af galde degeneration dokumenteres gennem leveren metamorfose.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. Solution Preparation
- Lav 1 L 10x 0,1 M phosphatbuffer saltvand (PBS, pH 7,4): 26,2 g natriumphosphat (monobasisk), 115 g natriumphosphat (dibasisk), og 87,66 g NaCl nøjagtighed. Opløses i cirka 800 ml destilleret H 2 O, justere pH og bringe lydstyrken op til 1 l med destilleret H 2 O.
- Lav 1 L 0,1 M phosphatpuffer saltvand (pH 7,4): Tag 100 ml 10x PBS, og der tilsættes 900 ml destilleret H 2 O.
- Lav 1 L 0,1 M fosfatbuffer saltvand (pH 7,4) med 0,1% Triton X-100: Tag 100 ml 10x PBS tilsættes 1 ml Triton X-100, og bringe lydstyrken op til 1 l med destilleret H 2 O.
- Lav 1 L 10x 0,1 M fosfatbuffer (pH 7,4): 26,2 g natriumphosphat (monobasisk), og 115 g natriumphosphat (dibasisk) afvejes. Opløses i cirka 800 ml destilleret H 2 O, justere pH og bringe lydstyrken op til 1 l med destilleret H 2 O.
- Lav 1 L 0,1 M phosphatpuffer (pH 7,4): Tag 100 ml 10x PB,og der tilsættes 900 ml destilleret H2O
- Lav 1 L 0,1 M fosfatbuffer (pH 7,4) med 0,1% Triton X-100: Tag 100 ml 10x PB, tilsættes 1 ml Triton X-100, og bringe lydstyrken op til 1 l med destilleret H 2 O.
- Gør 400 ml hydrogel monomer opløsning (4% acrylamid, 0,25% bis-acrylamid, 4% paraformaldehyd, 0,0075% ammoniumpersulfat, 0,0005% saponin i 0,1 M PBS): Afvej 0,3 g ammoniumpersulfat og 0,2 g saponin. Tilføj 210 ml destilleret H2O, 40 ml 40% acrylamid, 10 ml 2% bis-acrylamid, 40 ml 10x PBS (pH 7,4), 100 ml 16% paraformaldehyd, og bland godt.
- Lav 4 L clearing-opløsning (4% SDS i 0,2 M borsyre): 49,464 g borsyre og 160 afvejes g SDS. Opløses i omkring 3,5 L destilleret H 2 O, justere pH til 8,5 med NaOH, og bringe lydstyrken op til 4 L.
- Lav 1 L 80% glycerol opløsning: Mål 800 ml glycerol, tilsættes 200 ml destilleret H 2 O, og bland godt.
2.. Vævspræparat
- Forbered hydrogel monomeropløsning og portion 10 ml til hver 15 ml centrifugerør.
- Dissekere hele væv og fastgør hydrogelen i 2 dage ved 4 ° C. Sørg for, at hydrogel løsning er mindst 10x volumen af vævet.
- Bring hydrogel faste væv (i 15 ml centrifugeglas) til et stinkskab.
- Polymerisere hydrogel fikseret væv ved tilsætning af 5 pi TEMED, bland godt og lad det sidde i stinkskab ved stuetemperatur i 2-3 timer.
- Fjern den overskydende gel grundigt. Bemærk: Ekstra gel vil hindre clearingen og antistoffet penetration under farvning.
- Inkubér fikseret væv i 10 ml clearing opløsning i en inkubator-ryster sat til 70 rpm og 50 ° C i flere dage, indtil vævet bliver gennemsigtig. Skift clearing løsning mindst én gang om dagen, og fjern overskydende gel fra vævet, når du ændrer clearing løsning.
- Skyl vævet i 10 ml 0,1 M PB med 0,1% Triton X-100 ved 70 rpm og 37 ° C natten over. Gentag dette trin 3 gange og fjerne den overskydende gel fra vævet, når du ændrer bufferopløsning.
- Inkubér præciseret væv i det primære antistof opløsning i PB med 0,1% Triton X-100 ved 70 rpm og 37 ° C i 2 dage. Bemærk: Sørg nok primære antistof løsning til at oversvømme hele væv.
- Skyl vævet i 10 ml PB med 0,1% Triton X-100 ved 70 rpm og 37 ° C natten over. Gentag dette trin 3 gange og fjerne den overskydende gel fra vævet, når du ændrer bufferopløsning.
- Udfør følgende trin i et mørkt rum eller under dæmpet lys. Dæk prøverne med folie for at undgå foto blegning.
- Inkubér afklaret væv med fluorescerende sekundære antistof opløsning i PB med 0,1% Triton X-100 og den blokerende serum ved 70 rpm og 37 ° C i 1 dag.
- Skyl vævet i 10 ml PB med 0,1% Triton X-100 ved 70 rpm og 37 ° C natten over. Gentag dette trin 3 gange og fjerne den overskydende gel fra vævet, når du ændrer bufferopløsning.
- Skyl vævet i 10 ml PBS ved 70 rpm og 37 ° C natten over. Gentag dette trin 3 gange og fjerne den overskydende gel fra vævet, når du ændrer bufferopløsning.
- Inkubér præciseres væv i 80% glycerol ved 70 rpm og 37 ° C natten over.
- Opbevar fluorescerende farvede væv ved 4 ° C forud for konfokal mikroskopi.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Flere vigtige udviklingsmæssige begivenheder forekommer i hepatobiliær systemet under havlampret metamorfose. Galdegangen og galdeblæren undergår apoptose og degenererede (figur 1). Ved at kombinere den modificerede afklaring metode og farvning med levercelle markør cytokeratin 19 (CK19, til stede i både cholangiocytes og hepatocytter før og efter metamorfose 13) og antiapoptotisk markør Bcl2 hjælp konfokal mikroskopi blev hele galdeveje fanget langs Z-aksen ( figur 2) og 3-dimensionelle struktur blev rekonstrueret (figur 3). Laserscanning konfokal mikroskopi blev anvendt til at udføre optisk snit gennem den intakte lever da de fleste af galdesystemet er indlejret i leveren undtagen vejkryds, hvor galdegangen ind i tarmen. Den degenerative proces sker i metamorfe trin 2-4, startende fra perifere små galde ductules mod den centrale store intrahepatisk fælles galdegang (Figur 2), i overensstemmelse med tidligere undersøgelser 10.
Figur 1.. Galdeblære degeneration under havlampret metamorfose. Havlampret miste galdeblære (sorte pile) under forvandling. Prøverne blev taget fra dyr med ekstern morfologi mellem metamorfe fase 2 og 3, dvs runde øjet uden (trin 2) eller (fase 3) skarp differentiering af iris og elev, prominente papilla-lignende fremspring på den indre ryg overfladen af den orale hætte (begge trin), fortykket læber af oral hætte (trin 2) danner en rektangulær indgang i mundhulen (fase 3), eller "pug-lignende" snude (stadie 3) 3. Bemærk, at galdeblære også ændret farve, som indikerer forskelle i produktionen af galde.I: tarmen. L:. Lever Klik her for at se en større version af dette tal.
Figur 2.. Konfokale billeder, der viser galdetræet i havlampret lever under forvandling. Prøverne blev taget fra dyr med ekstern morfologi mellem metamorfe fase 2 og 3. Top paneler er taget fra den forreste, og de nederste paneler fra den bageste ende. Billeder af levercelle markør cytokeratin 19 (1:100 muse-anti-CK19; farvet med 2 ug / ml Alexa Fluor 350-gede-anti-muse-IgG, blå) og anti-apoptotisk markør Bcl2 (1:100 kanin-anti- Bcl2, farvet med 2 ug / ml Alexa Fluor 488-æsel-anti-kanin IgG, grøn) overlejres til at generere de flettede billeder. Hvide pile angiver biliary træ. Sorte pile angiver den mørke dendritiske ser apoptotiske celler og omgivende canaliculi og ductules i leveren. I: tarmen. L: leveren. Skala bar:. 500 um Klik her for at se en større version af dette tal.
Figur 3.. 3D-billeder rekonstrueret fra fusionerede konfokal z-serien. 3D billeder blev rekonstrueret fra konfokal z-serie af tre lever mellem metamorfe fase 2 og 3. Optiske sektioner af fusionerede billeder af leveren celle markør cytokeratin 19 (1:100 muse- anti-CK19; farvet med 2 ug / ml Alexa Fluor 350-gede-anti-muse-IgG, blå) og anti-apoptotisk markør Bcl2 (1:100 kanin-anti-Bcl2, farvet med 2 ug / ml Alexa Fluor 488-æsel -anti-kanin-IgG; grøn) er rekonstrueret med producentens software til at generere 3D-billeder. Toppanelerne er taget fra den forreste og de nedre paneler fra den bageste ende. Hvide pile angiver galdetræet. Sorte pile angiver den mørke dendritiske ser apoptotiske celler og omgivende canaliculi og ductules i leveren. I: tarmen. L: leveren. Skala bar:. 500 um Klik her for at se en større version af dette tal.
.. Figur 4 A konfokal optisk sektion viser galdegangene med galde dråber i lumen flettede billede fra 3 fluorescerende kanaler; blå: muse-anti-c-Myc (1:100) / 2 ug / ml Alexa Fluor 350-gede-anti-muse-IgG; grøn: 2 ug / ml Nissl grøn; Rød: Kanin-anti-TGFβRII (1:100) / 2 ug / ml Alexa Fluor 594-æsel-anti-kanin. Skala bar: 500 um. Bile dråber er angivet med sorte pile. Leveren prøve blev taget mellem metamorfe etape 2 og 3.. Klik her for at se en større version af dette tal.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Denne protokol er modificeret ud fra en ny metode kaldet "klarhed" 12, som tværbinder intakt væv med polyacrylamid til dannelse af en nanoporøse hydrogel og derefter strimler væk plasmamembranen af vævet for at opnå optisk transparens og makromolekylære permeabilitet. "Klarhed" giver intakt væv billeddannelse af langtrækkende projektion og lokale kredsløb ledninger i nervesystemet. Denne nye metode kan anvendes til at visualisere hele galdevejen hos havlampret leveren under metamorfose. Det er en udfordring i biologi for at opnå høj opløsning information og opretholde det globale perspektiv fra et komplekst system såsom hele galdeveje eller centralnervesystemet ved hjælp af konventionel indlejring og sektionering metoder. Denne modificerede CLARITY metode giver en laserstråle til at trænge gennem intakt havlampret larvestadium lever op til en tykkelse på 1 til 2 mm ved hjælp af energibesparende fluorescerende mål (4x) i en regelmæssig laserscanning confocal mikroskop. Dybere penetration kan opnås ved anvendelse af en mere avanceret multi-foton konfokalt mikroskop. Tredimensionelle billeder kan rekonstrueres ved hjælp af 3D-rekonstruktion software. Opnås sammenlignelige resultater ved hjælp af konventionelle metoder ville være besværlig, der involverer stykvis rekonstruktion af mange sektioner, og vil være begrænset til mindre væv mængder. Denne nye metode giver værdifuld information fra hele strukturelle analyser af intakte systemer 12, er mindre arbejdskrævende, mere effektiv og reproducerbar.
En anden fordel ved denne nye fremgangsmåde er, at prøven kan genbruges flere gange til farvning med forskellige antistoffer 12. Dette gør sammenligninger mellem forskellige molekylære markører i samme prøve mere pålidelig og reproducerbar. Den stabile rammer, der genereres af hydrogel tillader effektiv fjernelse af antistoffer uden fine struktur skader og vedligeholder antigenicitet for en long tid 12. Den clearing løsning denaturerer antistoffer og forstyrrer bindende, derfor optræder som et antistof-stripping løsning 12. Adskillige runder af farvning er udført i havlampret leverprøver og strukturen og farvning forblev optimal.
Der er to større ændringer i denne protokol fra den oprindelige "klarhed" protokol 12. (1) Fri radikal-genererende reagenser (ammoniumpersulfat og TEMED) blev anvendt til at initiere og fremskynde polymerisationen af hydrogelen i stedet for VA044. VA044 er lysfølsomme og ikke tilgængelig i USA (2) Nej specialbyggede elektroforese kammer anvendes. I CLARITY metode 12, på grund af størrelsen af de væv (muse hjerne vs lamprey lever) er elektroforetisk væv clearing kræves for at fremskynde ekstraktionen af plasmamembranen. For at undgå den oprindelige pris for en specialbygget elektroforese kammer, vi først brugt existikke Agarosegelelektroforese enheder i vores laboratorium. Dette viste sig at være meget ineffektiv. Inkubation i clearingen opløsning med forhøjet temperatur (50 ° C) er meget effektiv i clearing plasmamembranen.
Selv om forfatterne til "klarhed" advarede mod brugen af saponin i hydrogel, det forbedrer gennemsigtigheden i havlampret væv i vores procedure. En ulempe for konfokal billeddannelse er at havlampret væv har en stærk auto-fluorescens. Valget af fluoroforer skal afprøves ved at sammenligne billederne før og efter immunfluorescensfarvning.
Under havlampret metamorfose, regression af galdeblære epitel starter mellem metamorfe fase 2 og 3. Ved metamorfe fase 4, forsvinder galdeblære helt fra havlampret lever 14. Galdegang degeneration er mest dramatic mellem metamorfiske trin 3 og 4 15. Denne ændrede metode er et kraftfuldt værktøj til at studere de cellulære og molekylære mekanismer i degeneration af hele galdeveje, som kan give indsigt til human galdeatresi.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Forfatterne har ikke noget at afsløre.
Acknowledgments
Forfatterne anerkender det bidrag Hammond Bay Biological Station, Great Lakes Science Center, US Geological Survey. Vi takker også Dr. Melinda Frame ved Center for Advanced Microscopy ved Michigan State University for hendes tekniske support i laserscanning konfokal mikroskopi. Denne undersøgelse er støttet af tilskud fra De Store Søers Fiskerikommission til YWCD og WML.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 40% acrylamide | Bio-Rad | 161-0140 | |
| 2% bis-acrylamide | Bio-Rad | 161-0142 | |
| TEMED | Bio-Rad | 161-0800 | |
| ammonium persulfate | Sigma | A3678-25G | |
| boric acid | Sigma | B7901-1KG | |
| saponin | Sigma | 47036 | |
| sodium dodecyl sulfate | Sigma | L337-500G | |
| sodium phosphate (monobasic) | Sigma | 04269-1KG | |
| sodium phosphate (dibasic) | Sigma | S5136-1KG | |
| Triton X-100 | Sigma | X100-500ML | |
| glycerol | Sigma | G9012-500ML | |
| 16% paraformaldehyde | Electron Microscopy Sciences | 15710-S | |
| NaOH pellets | EMD | SX0590-3 | |
| 15 ml centrifuge tubes | Any brand | ||
| dissecting tools | Any brand |
References
- Applegate, V. C. Natural history of the sea lamprey (Petromyzon marinus) in Michigan. US Fish and Wildlife Service Special Science Report on Fishery Service. (55), (1950).
- Hardisty, M. W., Potter, I. C. The general biology of adult lampreys. The biology of lampreys. Hardisty, M. W., Potter, I. C. 1, New York Academic Press. 127-206 (1971).
- Youson, J. H., Potter, I. C. A description of the stages in the metamorphosis of the anadromous sea lamprey, Petromyzon marinus L. Can. J. Zool. 57, 1808-1817 (1979).
- Boomer, L. A., et al. Cholangiocyte apoptosis is an early event during induced metamorphosis in the sea lamprey, Petromyzon marinus L. J. Pediatr. Surg. 45, 114-120 (2010).
- Kasai, M., Suzuki, H., Ohashi, E., Ohi, R., Chiba, T., Okamoto, A. Technique and results of operative management of biliary atresia. World J. Surg. 2, 571-580 (1978).
- Suzuki, T., Hashimoto, T., Kondo, S., Sato, Y., Hussein, M. H. Evaluating patients’ outcome post-Kasai operation: a 19-year experience with modification of the hepatic portoenterostomy and applying a novel steroid therapy regimen. Pediatr. Surg. Int. 26, 825-830 (2010).
- Hartley, J. L., Davenport, M., Kelly, D. A. Biliary atresia. Lancet. 374, 1704-1713 (2009).
- Morecki, R., Glaser, J. H., Cho, S., Balistreri, W. F., Horwitz, M. S. Biliary atresia and reovirus type 3 infection. New Engl. J. Med. 307, 481-484 (1982).
- Shimadera, S., Iwai, N., Deguchi, E., Kimura, O., Fumino, S., Yokoyama, T. The inv mouse as an experimental model of biliary atresia. J. Pediatr. Surg. 42, 1555-1560 (2007).
- Sidon, E. W., Youson, J. H. Morphological changes in the liver of the sea lamprey, Petromyzon marinus L., during metamorphosis: I. Atresia of the bile ducts. J. Morphol. 177, 109-124 (1983).
- Yeh, C. -Y., Chung-Davidson, Y. -W., Wang, H., Li, K., Li, W. Intestinal synthesis and secretion of bile salts as an adaptation to developmental biliary atresia in the sea lamprey. Proc. Nat. Acad. Sci. U.S.A. 109, 11419-11424 (2012).
- Chung, K., et al. Structural and molecular interrogation of intact biological systems. Nature. 497, 332-337 (2013).
- Alarcón, V. B., Filosa, M. F., Youson, J. H. Cytokeratins in the liver of the sea lamprey (Petromyzon marinus) before and after metamorphosis. Cell Tissue Res. 287, 365-374 (1997).
- Youson, J. H., Ogilvie, D. R. Ultrastructural features of degeneration of the gallbladder during lamprey biliary atresia. Tissue and Cell. 22, 477-492 (1990).
- Morii, M., et al. Onset of apoptosis in the cystic duct during metamorphosis of a Japanese lamprey, Lethenteron reissneri. Anat. Rec. 293, 1155-1166 (2010).
