Summary
바다 칠성 장어는 변태 동안 담낭 및 담관, 인간의 담도 폐쇄증과 유사한 과정을 잃게됩니다. 새로운 고정 및 정화 방법 (CLARITY)은 레이저 스캐닝 공 초점 현미경을 사용하여 전체 담도 트리를 시각화하기 위해 수정되었다. 이 방법은 담즙의 변성을 연구 할 수있는 강력한 도구를 제공합니다.
Abstract
담도 폐쇄증 대만에서 5000에있는보고 된 주파수 추정 1 15,000 미국 남동부에있는 주파수,하지만 동아시아 국가에서 일반적으로, 초기 단계의 희귀 질환이다. 많은 부분이 담도 폐쇄증의 관리에 대한 알려져 있지만, 그 기전은 아직 애매하다. 바다 칠성 장어 (Petromyzon의 스 marinus)는 담즙의 변성의 기전 및 진행 상황을 검사 할 수있는 독특한 기회를 제공합니다. 유충, 기생, 성인 : 바다 칠성 장어는 세 개의 서로 다른 삶의 단계를 통해 개발. 유충에서 기생 청소년으로 전환하는 동안, 바다 칠성 장어는 외부 형태와 내부 장기의 극적인 개편과 개조와 변형을 받고있다. 간, 전체 담즙의 시스템은 담낭과 담도 나무를 포함하여, 손실됩니다. "CLARITY"라는 새로 개발 된 방법은 변성 바다 칠성 장어의 장과 전체 간 접합을 명확히하기 위해 수정되었습니다.담즙의 변성의 과정은 레이저 스캐닝 공 초점 현미경을 사용하여 시각과 바다 칠성 장어 변태시 식별되었다. 이 방법은 고유 한 동물 모델에서 담도 폐쇄증을 연구 할 수있는 강력한 도구를 제공합니다.
Introduction
바다 칠성 장어 세 가지 생활을 통해 개발 1,2 단계입니다. 애벌레 바다 칠성 장어 (L)의 저서 필터 피더로 굴에서 대부분의 시간을 보낸다. 외부 형태와 내부 장기 3 개편에 극적인 변화의 일곱 변성 단계를 거쳐, 그 결과 청소년 (JV)는 질량 100 회 이상 몸을 증가, 그들이 호스트 물고기의 혈액과 조직 유체에 공급되는 동안의 기생 단계를 입력 . 바다 나 큰 호수에있는 호스트 물고기에 먹이 1.0-1.5 년 후, 성인은 이른 봄에 동안 수유를 중단하고 산란 하천으로 마이그레이션 한 후, 2 다이.
변형하는 동안, 바다 칠성 장어의 간은 담즙 방광 및 전체 담즙 나무, 인간의 유아 질환 담도 폐쇄증을 모방 진화 돌연변이 표현형을 잃는다. 유아 담도 폐쇄증은 4,5,6,7 심각한 의료 합병증이 드문 소아 간 질환입니다, 8,9,10 그러나 담도 폐쇄증의 발병 기전과 원인 4 대부분 알 수 있습니다. 외과 적 수술 (카사이 절차가) 5를 수행하지 않는 담도 폐쇄증 환자는 출생 후 2 년 이내에 사망합니다. 그 후,이 환자는 광범위한 임상 관리 및 자주 간 이식 6이 필요합니다. 담도 폐쇄증의 병인의 많은 이론은 바이러스 성 감염, 선천성 기형, 면역 질환, 독성 모욕으로 제안되었다. 그러나, 담도 폐쇄증의 발전에 각각의 기여는 7,8,9,10 결정적이 남아있다.
병적 인 담도 폐쇄증 고통을 유아는 달리, 바다 칠성 장어는 발달 광범위한 necroinflammation, 섬유증 또는 간경변 10 않고 담도 폐쇄증을 프로그램 받고있다. 동물이 과정 10시 과도 담즙을 경험하지만,이 발달 상태에 적응할 수있다를 통해 새로이 합성과 같은 간 11 담즙산 합성의 감소로 알려진 메커니즘뿐만 아니라 개발 담도 폐쇄증, 후 소장에서 담즙 소금의 분비. 바다 칠성 장어에서이 발달 과정은 담도 폐쇄증의 진행을 검토 할 수있는 유일한 알려져있는 기회를 제공합니다.
"CLARITY"라는 새로 개발 된 방법은 광학적으로 투명한 나노 다공성 하이드로 겔 (12)로 그대로 조직을 변형하여 복잡한 포유 동물의 신경계에 높은 해상도의 영상을 가능하게합니다. 바다 칠성 장어의 간 및 수정 CLARITY 프로토콜을 사용하여, 담즙 변성 그대로 - 조직 영상은 간 변형을 통해 설명 할 수있다.
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Protocol
1. 솔루션 준비
- 1 L 만들기 10X 0.1 M 인산 완충 식염수 (PBS, pH 7.4의) : 26.2 g 인산 나트륨 (일 염기성), 115g의 인산 나트륨 (이염 기성) 및 87.66 g의 염화나트륨을 단다. 약 800 ml의 증류수에 용해 H 2 O, 산도를 조정하고, 증류수 H 2 O로 1 L에 볼륨을 가져
- 1 L 0.1 M 인산 완충 생리 식염수 (산도 7.4) 제조 업체 : 100 ML 10X PBS를 가지고, 900 ㎖의 증류수 H 2 O를 추가
- 100 ㎖의 10 배 PBS를 타고, 1 ㎖ 트리톤 X-100을 추가하고, 증류수 H 2 O로 1 L까지의 볼륨을 가지고 : 1 L 0.1 M 인산 완충 생리 식염수 (산도 7.4) 0.1 % 트리톤 X-100을
- 26.2 g 인산 나트륨 (염기)과 115g 인산 나트륨 (이염을) 무게 : 1 L 배의 0.1M 인산 버퍼 (PB, 산도 7.4)을 확인합니다. 약 800 ml의 증류수에 용해 H 2 O, 산도를 조정하고, 증류수 H 2 O로 1 L에 볼륨을 가져
- 1 L 0.1 M 인산염 완충액 (pH 7.4) 제조 업체 : 타고 100 ㎖의 10 배의 PB,와 H 2 O를 증류수 900 ㎖에 추가
- 0.1 % 트리톤 X-100 1 L 0.1 M 인산염 완충액 (pH 7.4) 제조 업체 : 100 ㎖의 10 배의 PB를 타고, 1 ㎖ 트리톤 X-100을 추가하고, 증류수 H 2 O로 1 L까지의 볼륨을 일정하게
- 400 ㎖의 하이드로 겔 단량체 용액 (4 % 아크릴 아미드, 0.25 % 비스 - 아크릴 아미드, 4 % 파라 포름 알데히드, 0.0075 %의 황산 암모늄, 0.1 M PBS에 0.0005 %의 사포닌을) 확인 : 0.3 g과 황산 암모늄 0.2 g 사포닌의 무게. 210 ㎖의 증류수 H 2 O를 추가, 40 ㎖의 40 % 아크릴, 10 ㎖ 2 % 비스 - 아크릴 아미드, 40 ㎖의 10 배 PBS (산도 7.4), 100 ml의 16 % 파라 포름 알데히드, 잘 섞는다.
- (0.2 M 붕산 4 % SDS) 4 L 청산 솔루션을 만들기 : SDS G 49.464 g 붕산 160의 무게를 측정. 약 3.5 L 소주 H 2 O에 용해 NaOH로 pH가 8.5가되도록 조정하고, 4 L.에 볼륨을 가져
- 1 L 80 % 글리세롤 솔루션을 만들 : 800 ml의 글리세롤을 측정 200 ㎖의 증류수 H 2 O를 추가하고 잘 섞는다.
2. 조직 준비
- 각 15 ㎖의 원심 분리기 튜브 하이드로 겔 단량체 용액과 나누어지는 10 ㎖를 준비합니다.
- 전체 조직을 해부하고 4 ℃에서 2 일간 하이드로 겔 해결 하이드로 겔 솔루션은 적어도 10 배 조직의 볼륨이 있는지 확인하십시오.
- 흄 후드 (15 ML의 원심 분리기 튜브) 하이드로 겔 고정 된 조직을 가지고.
- , TEMED 5 μl를 추가하여 하이드로 겔 고정 된 조직을 중합 잘 섞어, 2 ~ 3 시간 동안 실온에서 흄 후드에 앉아 보자.
- 철저하게 초과 젤을 제거합니다. 주의 : 여분 겔 염색시 정산 과정과 항체의 침투를 방해 할 것이다.
- 조직이 투명하게 될 때까지 몇 일 동안 70 rpm으로 50 ° C로 설정 인큐베이터 통에 솔루션을 취소 10 ㎖에 고정 된 조직을 품어. 적어도 하루에 한 번 청소 솔루션을 변경하고 청소 솔루션을 변경하는 경우 조직에서 과잉 젤을 제거합니다.
- 70 실온에서 0.1 % 트리톤 X-100 10 ㎖ 0.1 M PB에서 조직을 헹구오후 37 ° C에서 하룻밤. 이 과정을 3 번 반복하고 완충 용액을 변경하는 경우 조직에서 과잉 젤을 제거합니다.
- 2 일간 70 rpm으로 37 ° C에서 0.1 % 트리톤 X-100와 함께 PB의 기본 항체 솔루션 명확히 조직을 품어. 참고 : 전체 조직을 물속에 충분한 기본 항체 솔루션을합니다.
- 밤새 70 rpm으로 37 ° C에서 0.1 % 트리톤 X-100과 10 ㎖의 PB의 조직을 씻어. 이 과정을 3 번 반복하고 완충 용액을 변경하는 경우 조직에서 과잉 젤을 제거합니다.
- 어두운 실내 나 어두운 곳에서 다음 단계를 수행합니다. 사진 표백을 방지하기 위해 호일로 샘플을 커버.
- 0.1 % 트리톤 X-100와 PB의 형광 차 항체 용액 1 일 동안 70 rpm으로 37 ° C에서 차단 혈청 정화 된 조직을 품어.
- 밤새 70 rpm으로 37 ° C에서 0.1 % 트리톤 X-100과 10 ㎖의 PB의 조직을 씻어. 이 과정을 3 번 반복하고 과잉 젤 F를 제거완충액을 변경할 때 티슈 롬.
- 밤새 70 rpm으로 37 ° C에서 10 ㎖ PBS에서 조직을 씻어. 이 과정을 3 번 반복하고 완충 용액을 변경하는 경우 조직에서 과잉 젤을 제거합니다.
- 70 rpm으로 37 ° C에서 하룻밤에 80 % 글리세롤에 명확히 조직을 품어.
- 이전의 공 초점 현미경에 4 ° C에서 형광 스테인드 조직을 저장합니다.
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Representative Results
몇 가지 중요한 발달 이벤트는 바다 칠성 장어 변태 동안 간담에서 발생합니다. 담관 및 담낭 세포 사멸과 퇴화 (그림 1)를 받고있다. 및 공 초점 현미경을 사용하여 항 세포 사멸 마커 Bcl2의 (cholangiocytes 및 간세포 이전과 변형 13 후 모두에 존재 CK19) 간 세포 마커 아세포 (19) 수정 된 설명 방법과 염색을 결합, 전체 담즙의 시스템은 Z 축 (함께 체포됐다 그림 2)와 3 차원 구조 (그림 3)을 재건했다. 레이저 스캐닝 공 초점 현미경은 담즙의 시스템의 대부분은 담관이 소장 들어가 접합 제외 간 내에 포함되기 때문에, 그대로 간 통해 광학적 부분을 수행하는 데 사용 하였다. 퇴행성 프로세스는 중앙의 큰 intrahep으로 주변의 작은 담즙 소관에서 시작, 변성 단계 2-4에서 발생이전 연구 (10)와 일치 ATIC 담관 (그림 2).
바다 칠성 장어 변태 동안 그림 1. 담낭 변성. 바다 칠성 장어 변태 동안 담낭 (검은 색 화살표)를 잃게됩니다. 시편 변성 단계 2와 3 사이의 외부 형태와 동물에서 찍은, (2 단계)없이 또는 (3 단계) 아이리스와 학생의 날카로운 분화, 구두의 안쪽 등의 표면에 눈에 띄는 유두 같은 돌기 둥근 눈, 즉 후드 (두 단계), 구강 사각형 입구 (3 단계), 또는 "퍼그 같은"주둥이 (3 단계) (3)을 형성 경구 후드 (2 단계)의 입술을 두껍게했다. 담즙 방광은 또한 담즙 생산의 차이를 나타내는 색상을 변경합니다.I : 소장. L :. 간 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
그림 2. 변태 동안 바다 칠성 장어의 간에서 담즙의 트리를 표시 공 초점 이미지. 표본은 최고위원회가 전방에서 가져옵니다. 변성 단계 2와 3 사이의 외부 형태와 동물에서 촬영하고, 후방의 끝에서 낮은 패널되었다. 간 세포 마커 아세포 (19)의 이미지 (1:100 마우스 방지 CK19는 2 μg 염색 / ㎖ 알렉사 플 루어 350 염소 안티 - 마우스 IgG, 파랑) 및 항 세포 사멸 마커 Bcl2의 (1:100 토끼 방지 Bcl2의; / ㎖ 알렉사 플 루어 488-당나귀 안티 - 토끼 IgG의 2 μg 염색, 녹색) 병합 된 이미지를 생성하는 중첩된다. 흰색 화살표는 B를 나타냅니다iliary 나무. 검은 색 화살표는 어두운 수지상 세포 사멸을보고 간에서 눈물 소관과 소관 주변을 나타냅니다. I : 소장. L : 간. 스케일 바 :. 500 μm의 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
병합 된 공 촛점 Z-시리즈에서 재구성 그림 3. 3D 이미지. 3D 이미지 변성 단계 2와 3 사이의 세 간의 공 촛점 Z-시리즈에서 재구성되었다. 간 세포 마커 아세포 (19)의 병합 된 이미지의 광학 부 (1:100 마우스 - 안티 CK19 2 ㎍ / ㎖의 알렉사 플 루어 350 염소 안티 - 마우스 IgG로 염색, 청색) 및 항 세포 사멸 마커 Bcl2의 (1:100 토끼 방지 Bcl2의 2 ㎍ / ㎖의 알렉사 플 루어 488 - 당나귀와 스테인드 - 안티 -토끼 IgG의; ) 녹색은 3D 이미지를 생성하는 제조 업체의 소프트웨어와 함께 복원됩니다. 상단 패널은 전방에서 촬영하고, 후방 끝에서 낮은 패널된다. 흰색 화살표는 담즙의 나무를 나타냅니다. 검은 색 화살표는 어두운 수지상 세포 사멸을보고 간에서 눈물 소관과 소관 주변을 나타냅니다. I : 소장. L : 간. 스케일 바 :. 500 μm의 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
.. 3 형광 채널의 그림 4 루멘의 담즙 방울과 담관을 보여주는 공 초점 광학 섹션을 병합 된 이미지; 블루 : 마우스 항-C-Myc와 (1:100) / 2 ㎍ / ㎖의 알렉사 플 루어 350 염소 안티 - 마우스 IgG; 녹색 : 2 ㎍ / ㎖의 Nissl 녹색; 빨강: 토끼 반 TGFβRII (1:100) / 2 ㎍ / ㎖의 알렉사 플 루어 594-당나귀 안티 - 토끼. 스케일 바 : 500 μm의. 담즙 액은 검은 색 화살표로 표시됩니다. 간 표본이 변성 단계 2와 3 사이에 촬영했다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
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Discussion
이 프로토콜은 나노 다공성 겔을 형성하기 위해 폴리 아크릴 아미드와 손상 조직을 가교 결합하고 광학 투명성 고분자 투과성을 달성하기 위해 조직의 세포막을 얻어 스트립 "CLARITY"(12)라고하는 새로운 방법에서 수정된다. "CLARITY는"장거리 투사와 신경계에있는 지역의 회로 배선의 손상 - 조직 이미징을 할 수 있습니다. 이 새로운 방법은 변태 중에 바다 칠성 장어 간 담즙의 전체 시스템을 시각화 할 수있다. 그것은 높은 해상도 정보를 획득하고, 전체 시스템 또는 담즙 종래 임베딩 사용 및 방법을 구획 중추 신경계 같은 복잡한 시스템으로부터 글로벌 시각을 유지하기 위해 생물학 도전이다. 이 변경됨 CLARITY 방법은 레이저 빔이 일정한 레이저 스캐닝 confoca 저전력 형광 대물 (4X)를 사용 1~2밀리미터의 두께까지 그대로 바다 칠성 장어 유생 간을 관통 할 수 있도록L 현미경. 깊은 관통은 더 진보 된 다중 광자 공 초점 현미경을 사용하여 달성 될 수있다. 3 차원 영상은 3D 재구성 소프트웨어를 사용하여 재구성 될 수있다. 기존의 방법을 사용하여 유사한 결과를 달성하는 것은, 힘든 수 많은 섹션의 단편적인 재건을 포함, 소규모 조직의 볼륨에 제한 될 수있다. 이 새로운 방법은 그대로 시스템 (12)의 전체 구조 분석에서 가치있는 정보를 제공하고, 덜 노동 집약적 인,보다 효율적이고 재현성.
이 새로운 방법의 또 다른 장점은 시편 (12)은 다른 항체로 염색 여러 번 재사용 될 수 있다는 것이다. 이 같은 표본 다른 분자 마커 사이의 비교가보다 안정적이고 재현합니다. 하이드로 겔에 의해 생성 된 안정적인 프레임 워크는 미세 구조의 손상없이 항체의 효과적인 제거를 허용하고 싸다에 대한 항원 성을 유지NG 시간 12. 청소 솔루션은 따라서 항체 코팅 제거 용액 (12)의 역할을 결합하는 항체 및 방해하는 행위를 변성. 염색 몇 차례는 바다 칠성 장어의 간 샘플에서 수행하고 구조와 염색 최적 남아 있었다.
원래 "CLARITY"프로토콜 12이 프로토콜의 두 가지 주요 수정 사항이 있습니다. (1) 라디칼 발생 시약 (황산 암모늄 및 TEMED)을 대신 VA044의 하이드로 겔의 중합을 개시하고 촉진하는 데 사용 하였다. VA044은 감광성 사용할 수 없습니다 미국 (2) 아니오 맞춤형 전기 챔버를 사용하지 않을 것입니다. 조직 (칠성 장어의 간 대 마우스의 뇌)의 크기로 인해 CLARITY 방법 (12)에 전기 영동 조직 청산은 세포막의 추출을 촉진하는 데 필요합니다. 맞춤형 전기 챔버의 초기 비용을 방지하기 위해, 우리는 먼저 EXI를 사용우리의 실험실에서 아가 로스 겔 전기 영동 장치를 찌르기. 이것은 매우 비효율적 인 것으로 판명. 그러나, 상승 온도 (50 ℃)와 클리어 솔루션의 배양은 세포막을 취소 매우 효과적이다.
"CLARITY"의 저자는 하이드로 겔에있는 사포닌의 사용에주의를 기울여야하지만, 우리의 절차의 바다 칠성 장어 조직의 투명성을 향상시킵니다. 공 촛점 이미징을위한 한 가지 단점은 바다 칠성 장어의 조직이 강한 자동 형광을 가지고 있다는 것입니다. 형광의 선택은 면역 형광 염색 전후의 이미지를 비교하여 테스트해야합니다.
바다 칠성 장어 변태 동안, 담낭 상피 세포의 회귀는 변성 단계 2와 3 사이에 시작됩니다. 변성 4 단계로, 담즙 방광 바다 칠성 장어의 간 14에서 완전히 사라집니다. 담관의 변성은 가장 DRA입니다매틱 변성 단계 3과 4 (15) 사이.이 수정 방법은 인간의 담도 폐쇄증에 대한 통찰력을 제공 할 수 있습니다 전체 담즙의 시스템의 변성의 세포 및 분자 메커니즘을 연구 할 수있는 강력한 도구입니다.
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Disclosures
저자가 공개하는 게 없다.
Acknowledgments
저자는 해먼드 베이 생물 역, 그레이트 레이크스 과학 센터, 미국 지질 조사국 (US Geological Survey)의 기여를 인정합니다. 우리는 또한 레이저 스캐닝 공 초점 현미경에 그녀의 기술 지원을위한 미시간 주립 대학의 고급 현미경을위한 센터에서 박사 멜린다 프레임을 감사합니다. 이 연구는 YWCD 및 WML에 대호 어업위원회에서 교부금에 의해 지원됩니다.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 40% acrylamide | Bio-Rad | 161-0140 | |
| 2% bis-acrylamide | Bio-Rad | 161-0142 | |
| TEMED | Bio-Rad | 161-0800 | |
| ammonium persulfate | Sigma | A3678-25G | |
| boric acid | Sigma | B7901-1KG | |
| saponin | Sigma | 47036 | |
| sodium dodecyl sulfate | Sigma | L337-500G | |
| sodium phosphate (monobasic) | Sigma | 04269-1KG | |
| sodium phosphate (dibasic) | Sigma | S5136-1KG | |
| Triton X-100 | Sigma | X100-500ML | |
| glycerol | Sigma | G9012-500ML | |
| 16% paraformaldehyde | Electron Microscopy Sciences | 15710-S | |
| NaOH pellets | EMD | SX0590-3 | |
| 15 ml centrifuge tubes | Any brand | ||
| dissecting tools | Any brand |
References
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