Summary
海のヤツメウナギは変態期胆嚢や胆管、人間の胆道閉鎖症と同様のプロセスを失う。新しい固定および清澄法（CLARITY）はレーザー走査共焦点顕微鏡を用いて全体胆ツリーを視覚化するために変更されました。この方法では、胆管の変性を研究するための強力なツールが用意されています。
Abstract
胆道閉鎖症は、台湾の5000での1の報告された頻度で、南東米国では推定1 15000周波数で、乳児期の稀な疾患であるが、東アジア諸国の方が一般的。多くは胆道閉鎖症の管理について知られているが、その病因は依然としてとらえどころのないです。海のヤツメウナギ（Petromyzon·マリナス ） は、胆管変性のメカニズムおよび進行を検討するユニークな機会を提供します。幼虫に寄生し、大人：海のヤツメウナギは、次の3つのライフステージを経て発達する。幼虫から寄生少年への移行時には、海のヤツメウナギは外部形態や内臓の劇的再編·改造して変態を受ける。肝臓では、全体の胆道系は胆嚢や胆管系を含めて、失われます。 「CLARITY」と呼ばれる新たに開発された方法は、変成海のヤツメウナギにおける腸と肝臓全体との接合部を明確にするために変更されました。ザ·胆変性のプロセスは、レーザー走査共焦点顕微鏡を用いて可視化し、ウミヤツメ変態中に識別した。この方法では、ユニークな動物モデルにおける胆道閉鎖症を研究するための強力なツールが用意されています。
Introduction
海のヤツメウナギは、次の3つのライフステージを通して1,2を開発しています。幼虫海のヤツメウナギ（L）は、底生フィルターフィーダーなどの巣穴に最も時間を費やしています。外部形態や内臓3における再編の劇的な変化の7変成岩の段階を経て、結果の少年（JV）が質量100回以上体を増やし、彼らはホストの魚由来の血液や組織液を餌その間に寄生段階に入る。海や大きな湖にあるホストの魚を食べて1.0から1.5年後には、大人が早春の間に給餌を中止し、産卵する河川に移行してから、1,2ダイ 。
変態中に、海のヤツメウナギの肝は、胆嚢や胆管系全体、人間の幼児疾患胆道閉鎖症を模倣進化の変異体の表現型を失う。乳児胆道閉鎖症は、重度の合併症を持つ稀な小児肝疾患である4,5,6,7、8,9,10は、しかし胆道閉鎖症の病因および病因は4不明な点が多い。外科的介入（葛西手順は）5実行されない限り、胆道閉鎖症の患者は生後2年以内に死亡する。その後、これらの患者は、広範な臨床管理と、多くの場合、肝移植6が必要です。胆道閉鎖症の病因の多くの理論は、このようなウイルス感染、先天性奇形、自己免疫疾患および毒性傷害として提案されている。しかし、胆道閉鎖症の発展にそれぞれの寄与は7,8,9,10決定的まま。
病理学的胆道閉鎖症に苦しむ乳幼児とは異なり、海のヤツメウナギは、広範な壊死炎症、線維症または肝硬変10なしで発生的にプログラムされた胆道閉鎖症を起こす。動物は、このプロセスの間に10の過渡胆汁うっ滞を受けるが、この発達状態に適合させることができる経由新規合成および肝臓11における胆汁酸塩の合成の減少として知られているメカニズムに加えて、発達胆道閉鎖症、後腸内の胆汁酸塩の分泌。海のヤツメウナギのこの発達過程は、胆道閉鎖症の進行を検討する唯一の既知の機会を提供しています。
「CLARITY」と呼ばれる新たに開発された方法は、光学的に透明なナノ多孔性ハイドロゲル12に無傷組織を形質転換することにより、複雑な哺乳類の神経系での高分解能イメージングを可能にします。海のヤツメウナギ肝臓と変更された透明度のプロトコルを使用して、胆管変性症の完全な組織のイメージングは、肝臓変態を通じて文書化することができます。
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Protocol
1。溶液の調製
- 26.2グラムのリン酸ナトリウム（一塩基性）、115グラムのリン酸ナトリウム（二塩基性）、および87.66グラムのNaClを秤量：1 L 10×0.1 Mリン酸緩衝生理食塩水（PBS、pH7.4）で行う。約800ミリリットル蒸留水に溶解し、O、pHを調整し、蒸留H 2 Oで1リットルにボリュームを持ち出す
- L 1 0.1 Mリン酸緩衝生理食塩水（pH7.4）で作る：100ミリリットル10×PBSを取り、900 mlの蒸留H 2 Oを加える
- 0.1％トリトンX-100で1 L 0.1 Mリン酸緩衝生理食塩水（pH7.4）に行います、100ミリリットル10倍のPBSを取る1ミリリットルのTriton X-100を追加し、蒸留H 2 Oで1リットルにボリュームを持ち出す
- 26.2グラムのリン酸ナトリウム（一塩基性）を秤量し、115グラムのリン酸ナトリウム（二塩基性）：1 Lの10倍の0.1Mリン酸バッファー（PB、pH7.4）で行う。約800ミリリットル蒸留水に溶解し、O、pHを調整し、蒸留H 2 Oで1リットルにボリュームを持ち出す
- L 1 0.1 Mリン酸緩衝液（pH7.4）を作る：100mlの10×PBを取るとH 2 Oを蒸留900ミリリットルを追加
- 0.1％トリトンX-100で1 L 0.1 Mリン酸緩衝液（pH7.4）を作る：100ミリリットル10倍のPBを取る1mlのトリトンX-100を追加し、蒸留H 2 Oで1リットルまでの体積を
- 400ミリリットルヒドロゲルモノマー溶液（4％アクリルアミド、0.25％ビス - アクリルアミド、4％パラホルムアルデヒド0.0075％の硫酸アンモニウム、0.1 M PBS中の0.0005％サポニン）を作る0.3グラムの過硫酸アンモニウムおよび0.2グラムのサポニンを秤量する。 H 2 Oを蒸留210ミリリットル、40ミリリットルの40％アクリルアミド、10ミリリットルの2％ビスアクリルアミド、40ミリリットル10倍のPBS（pH7.4）で、100ミリリットル16％パラホルムアルデヒドを追加して、よく混ぜる。
- 4 Lクリア溶液（0.2Mのホウ酸4％SDS）を作る：49.464グラムのホウ酸と160グラムのSDSを秤量する。 、約3.5 L 蒸留水に溶解し、NaOHでpHを8.5に調整し、4 Lにボリュームを持ち出す
- 1Lの80％グリセロール溶液を加えます。、800ミリリットルグリセロールを測定し200ミリリットル蒸留水を加え、よく混ぜる。
2。組織標本
- 各15ミリリットル遠心管にハイドロゲルモノマー溶液と分量10ミリリットルを用意します。
- 全組織を解剖し、4℃で2日間、ヒドロゲル中に修正ヒドロゲル溶液は、少なくとも10倍の組織のボリュームであることを確認してください。
- ドラフトに（15ミリリットルの遠心管中）ハイドロゲル固定された組織を持って来る。
- 、5μlのTEMEDを追加することにより、ハイドロゲル固定された組織を重合よく混ぜ、2〜3時間室温でヒュームフードに座ってみましょう。
- 徹底的に余分なジェルを取り外します。注意：余分ゲルが染色の際にクリア処理し、抗体の浸透の妨げになる。
- 組織が透明になるまで数日間70回転と50℃に設定したインキュベーターシェーカーでソリューションをクリアする10ミリリットル中に固定された組織をインキュベートする。少なくとも一日一回クリアするソリューションを変更し、清算ソリューションを変更する際に、組織から余分なゲルを取り除く。
- 70 rでの0.1％トリトンX-100、10 mlの0.1 M PBで組織をすすぐ午後と37℃で一晩。この手順を3回繰り返し、緩衝液を変更する際に、組織から余分なゲルを取り除く。
- 2日間、70 rpmで37℃、0.1％トリトンX-100でPBの一次抗体溶液中で清澄組織をインキュベートする。注：組織全体を水没するのに十分な一次抗体溶液を加えます。
- 一晩70 rpmで37℃、0.1％トリトンX-100で10mlのPBで組織をすすぐ。この手順を3回繰り返し、緩衝液を変更する際に、組織から余分なゲルを取り除く。
- 暗い部屋で、または薄暗い光の下で、次の手順を実行します。写真の退色を防ぐために、ホイルでサンプルをカバーしています。
- 0.1％トリトンX-100 PB蛍光二次抗体溶液および1日70 rpmで37℃でブロッキング血清を清澄組織をインキュベートする。
- 一晩70 rpmで37℃、0.1％トリトンX-100で10mlのPBで組織をすすぐ。この手順を3回繰り返し、余分なゲルFを削除緩衝液を変更するときに、組織をROM等を用いることができる。
- 一晩70回転と37℃で10 mlのPBSで組織をすすぐ。この手順を3回繰り返し、緩衝液を変更する際に、組織から余分なゲルを取り除く。
- 70 rpmで37℃で一晩、80％グリセロールで明らかに組織をインキュベートする。
- 前共焦点顕微鏡に4℃で蛍光染色した組織を格納します。
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Representative Results
いくつかの重要な発生事象は、海のヤツメウナギ変態中に肝胆道系に発生する。胆管や胆嚢は、アポトーシスと縮退します（ 図1）を受ける。 （全体胆管系は、Z軸に沿って捕捉し、（変態13前後の胆管細胞および肝細胞の両方に存在CK19）、肝細胞マーカーサイトケラチン19、共焦点顕微鏡を用いて抗アポトーシスマーカーのBcl2で修飾浄化方法及び染色を組み合わせる図2）および3次元構造は（ 図3）再構成した。レーザー走査共焦点顕微鏡法は、胆管系のほとんどは、胆管が腸に入るジャンクション以外は、肝臓の内部に埋め込まれているので、無傷の肝臓を介して光学部を実行するために使用した。変性プロセスは、中央に大きなintrahepに向かって、周辺の小さな胆小管から開始し、変成段階2-4で発生した以前の研究10と整合ATIC総胆管（ 図2）。
図1。海ヤツメウナギ変態期胆嚢変性。海ヤツメウナギは変態時に胆嚢（黒矢印）を失う。標本は、変成岩のステージ2と3の間の外部形態を動物から採取した、（ステージ2）なしで、または（ステージ3）虹彩と瞳孔の急激な分化、口腔の内側の背側表面上の目立つ乳頭状の突起と丸い目、すなわちフード（両段階）、口腔内の長方形の入り口（ステージ3）、または「パグのような」鼻（ステージ3）3を形成する経口フード（ステージ2）の唇を厚くし。胆嚢は、胆汁の生産の違いを示す色を変更したことに注意してください。私：腸。 L：肝臓、この図の拡大版を表示するには、こちらをクリックしてください。
図2。変身中に海のヤツメウナギ肝臓で胆管を示す共焦点画像。標本は、トップパネルは、前方から取得されます。変成岩のステージ2と3の間の外部形態を動物から採取し、後端から下方パネルました。肝細胞のマーカーであるサイトケラチン19の画像（1:100マウス抗CK19は、2μgの染色/ mlのアレクサフルーア350ヤギ抗マウスIgG、青）および抗アポトーシスマーカーのBcl2（1:100のウサギ抗Bcl2の、2μg/ mlのアレクサフルーア488ロバ抗ウサギIgGで染色し、緑色）がマージされた画像を生成するために重ね合わされる。白い矢印は、Bを示しているiliary木。黒い矢印は、暗い樹状アポトーシス細胞を見て、肝臓内の細管と小管の周囲を示している。私：腸。 L：肝臓。スケールバー：500μmで、この図の拡大版を表示するには、こちらをクリックしてください。
マージされた共焦点Zシリーズから再構成し、図3。3D画像。3D画像が変成岩のステージ2と3の間に3肝臓の共焦点Zシリーズから再構築された。肝細胞のマーカーであるサイトケラチン19のマージされた画像の光学切片（1:100、マウスを、抗CK19、2μg/ mlのアレクサフルーア488-ロバで染色し、青）および抗アポトーシスマーカーのBcl2（1:100ウサギ抗Bcl2の、2μg/ mlのアレクサフルーア350-ヤギ抗マウスIgGで染色した - 抗ウサギIgG;緑色）の3D画像を生成する製造業者のソフトウェアを使用して再構成される。トップパネルは、前方から撮影し、後端から下方パネルれている。白い矢印は、胆管を示している。黒い矢印は、暗い樹状アポトーシス細胞を見て、肝臓内の細管と小管の周囲を示している。私：腸。 L：肝臓。スケールバー：500μmで、この図の拡大版を表示するには、こちらをクリックしてください。
図4の内腔における胆汁液滴と胆管を示す共焦点光学部 3の蛍光チャンネルからの合成画像。。。青：マウス抗c-Mycの（1:100）/ 2μg/ mlのアレクサフルーア350-ヤギ抗マウスIgG;緑：2μg/ mlのニッスル緑;レッド：ウサギ抗TGFβRII（1:100）/ 2μg/ mlのアレクサフルーア594-ロバ抗ウサギ。スケールバー：500μmである。胆汁液滴は黒矢印で示されている。肝臓片を変成ステージ2と3の間に撮影された。 この図の拡大版を表示するには、こちらをクリックしてください。
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Discussion
このプロトコルは、ナノ多孔性ヒドロゲルを形成するためにポリアクリルアミドで無傷組織を架橋し、次いで、光透過性および巨大分子透過性を達成するために組織の原形質膜を剥ぎ「CLARITY」12と呼ばれる新たな方法から変更される。 「透明度」長距離突起と神経系におけるローカル回路配線の完全な組織のイメージングを可能にする。この新しい方法は、変態時にウミヤツメ肝臓胆管系全体を視覚化するために使用することができる。これは、高解像度の情報を取得し、そのような全体の胆管系または従来の埋め込みおよびセクショニングの方法を用いて、中枢神経系のような複雑なシステムのグローバルな視点を維持するために、生物学における課題である。このCLARITY修飾方法は、レーザビームは、通常のレーザ走査confoca低電力蛍光対物レンズ（4×）により1〜2mmの厚さまでそのまま海のヤツメウナギ幼生肝臓を貫通することを可能にするL顕微鏡。より深い浸透は、より高度な多光子共焦点顕微鏡を用いて達成することができる。三次元画像は、3次元再構成ソフトウェアを使用して再構成することができる。従来の方法を使用して同等の結果を達成することは、面倒であり、多くの部分の断片的な再構築を伴う、小さな組織体積に制限されるであろう。この新しいメソッドは、そのままシステム12の全体の構造解析から貴重な情報を提供し、より少ない労働集約的な、より効率的で再現性がある。
この新しい方法の別の利点は、試料は12の異なる抗体での染色のために複数回再利用できることである。これは、同じ試料中の異なる分子マーカーとの比較は、より信頼性と再現します。ヒドロゲルによって生成された安定したフレームワークは、微細構造の損傷なしに抗体を効果的に除去を可能にし、LOのための抗原性を維持しますNG時間12。決済ソリューションは、抗体を変性し、それゆえ、抗体剥離液12として機能して、バインディングが中断されます。染色のいくつかのラウンドは、海のヤツメウナギ肝臓サンプルで行われており、構造や染色は最適なままであった。
オリジナルの「CLARITY」プロトコル12からこのプロトコルにおける二つの主要な変更があります。 （1）フリーラジカル生成試薬（過硫酸アンモニウムおよびTEMED）は、代わりにVA044のヒドロゲルの重合を開始し、促進するために使用した。 VA044は（2）いいえ特注の泳動槽を使用していない米国では、感光性と使用できません。組織（ヤツメウナギ肝臓対マウス脳）のサイズに起因CLARITY法12において、電気泳動組織のクリアが原形質膜の抽出を促進するために必要とされる。特注の電気泳動チャンバの初期コストを回避するためには、まずEXIを用い我々の研究室でアガロースゲル電気泳動デバイスを刺す。これは非常に非効率的であることが判明した。しかし、隆起した温度（50℃）を有する透明溶液中でのインキュベーションは、原形質膜をクリアするのに非常に有効である。
「CLARITY」の著者は、ヒドロゲル中のサポニンの使用に対して警告したが、それは私たちの手続きの海ヤツメウナギ組織の透明性を向上させます。共焦点イメージングのための一つの欠点は、海のヤツメウナギ組織は強い自己蛍光を有することである。フルオロフォアの選択は、免疫蛍光染色前後の画像を比較することでテストする必要があります。
海のヤツメウナギ変態中に、胆嚢上皮の退行が変成ステージ2と3の間で開始されます。変成ステージ4で、胆嚢は、海のヤツメウナギの肝14から完全に消えます。胆管変性が最も劇的であるmaticの変成ステージ3と4の間で15。この修正された方法は、ヒト胆道閉鎖症のための洞察を提供することが全体の胆道系の変性の細胞および分子メカニズムを研究するための強力なツールです。
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Disclosures
著者らは、開示することは何もありません。
Acknowledgments
著者は、ハモンドベイ生物駅、グレイトレイクスサイエンスセンター、米国地質調査所の貢献を認めている。また、レーザー走査型共焦点顕微鏡の彼女の技術的なサポートのためのミシガン州立大学の高度な顕微鏡のためのセンターで博士メリンダ·フレームに感謝。この研究は、YWCDとWMLへの五大湖漁業委員会からの補助金によってサポートされています。
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 40% acrylamide | Bio-Rad | 161-0140 | |
| 2% bis-acrylamide | Bio-Rad | 161-0142 | |
| TEMED | Bio-Rad | 161-0800 | |
| ammonium persulfate | Sigma | A3678-25G | |
| boric acid | Sigma | B7901-1KG | |
| saponin | Sigma | 47036 | |
| sodium dodecyl sulfate | Sigma | L337-500G | |
| sodium phosphate (monobasic) | Sigma | 04269-1KG | |
| sodium phosphate (dibasic) | Sigma | S5136-1KG | |
| Triton X-100 | Sigma | X100-500ML | |
| glycerol | Sigma | G9012-500ML | |
| 16% paraformaldehyde | Electron Microscopy Sciences | 15710-S | |
| NaOH pellets | EMD | SX0590-3 | |
| 15 ml centrifuge tubes | Any brand | ||
| dissecting tools | Any brand |
References
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