Summary
Sea lamprett mister galleblære og galleganger under metamorfose, en prosess som ligner på menneskets biliær atresi. En ny fiksering og avklaring metode (CLARITY) ble endret for å visualisere hele galletreet ved hjelp av laserskanning konfokalmikroskopi. Denne metoden gir et kraftig verktøy for å studere galle degenerasjon.
Abstract
Biliær atresi er en sjelden sykdom i barndommen, med anslagsvis 1 i 15 000 frekvens i sørøst USA, men mer vanlig i østasiatiske land, med en rapportert frekvens av en i 5000 i Taiwan. Selv om mye er kjent om forvaltningen av galle atresi, er dens patogenesen fortsatt unnvikende. Havet lamprett (Petromyzon marinus) gir en unik mulighet til å undersøke mekanismen og progresjon av galle degenerasjon. Sea lamprett utvikle seg gjennom tre forskjellige livsstadier: larve, parasittiske, og voksne. I overgangen fra larver til parasittiske juvenile, sjø lamprett gjennomgå metamorfose med dramatisk omorganisering og ombygging i ytre morfologi og indre organer. I leveren, er hele gallesystemet tapt, inkludert galleblæren og galle treet. En nyutviklet metode kalt "CLARITY" ble endret for å klargjøre hele leveren og krysset med tarmen i metamorfe havet niøye. Denprosessen med galle degenerasjon ble visualisert og skjelnet under havet lamprett metamorfose ved hjelp av laser scanning konfokalmikroskopi. Denne metoden gir et kraftig verktøy for å studere biliær atresi i en unik dyremodell.
Introduction
Sea lamprett utvikle seg gjennom tre distinkte livsstadier 1,2. Larve havet lamprett (L) tilbringer mest tid i hulene som bunndyr filter feeders. Etter å ha gått gjennom syv metamorfe stadier av dramatiske endringer i ytre morfologi og omorganisering i indre organer 3, de resulterende yngel (JV) angir en parasittisk stadium der spiser de blod og vevsvæsker fra vertsfisk, øke kroppsmassen mer enn 100 ganger . Etter 1,0 til 1,5 år fôring på vertsfisk i havet eller store innsjøer, voksne opphøre fôring i løpet av den tidlige våren og vandrer ut i elvene for å gyte, og deretter dør 1,2.
Under metamorfosen, mister havet lamprett leveren galleblæren og hele galletreet, en evolusjonær mutant fenotype som etterligner den menneskelige spedbarn sykdom biliær atresi. Infant biliær atresi er en sjelden pediatrisk leversykdom med alvorlige medisinske komplikasjoner 4,5,6,7, 8,9,10, men patogenesen av og årsak til galle atresi er i stor grad ukjent fire. Pasienter med galle atresi dør innen to år etter fødselen med mindre kirurgisk inngrep (Kasai prosedyre) utføres fem. Deretter disse pasientene krever omfattende klinisk ledelse og ofte levertransplantasjon seks. Mange teorier om galle atresi etiopathogenesis har blitt foreslått, for eksempel viral infeksjon, medfødte misdannelser, autoimmun sykdom, og giftige fornærmelse. Men bidraget fra hver til utvikling av galle atresi er fortsatt mangelfulle 7,8,9,10.
I motsetning til spedbarn som lider patologisk biliær atresi, gjennomgå havet lamprett utviklingshemmede programmert biliær atresi uten omfattende necroinflammation, fibrose eller cirrhose 10. Dyrene kan lide transient kolestase i løpet av denne prosessen 10, men tilpasser seg dette utviklingstilstandvia de novo syntesen og sekresjon av gallesalter i tarmen etter utviklings biliær atresia, i tillegg til kjente mekanismer som for eksempel reduksjon av gallesalt-syntese i leveren 11. Denne utviklingsprosessen i sjø lamprett gir den eneste kjente mulighet til å undersøke utviklingen av galle atresi.
En nyutviklet metode kalt "CLARITY" gir høy oppløsning bildebehandling i komplekse pattedyr nervesystem ved å forvandle intakt vevet inn en optisk gjennomsiktig nanoporøse hydrogel 12. Bruke havet lamprett leveren og en modifisert CLARITY protokoll, kan dokumenteres intakt-vev avbildning av galle degenerasjon gjennom leveren metamorfose.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. Løsning Forberedelse
- Lag 1 L 10x 0,1 M fosfatbuffer saltvannsoppløsning (PBS, pH 7,4): veie 26,2 g natriumfosfat (monobasisk), 115 g natriumfosfat (dibasisk), og 87,66 g NaCl. Løs opp i ca 800 ml destillert H 2 O, justere pH, og bringe volumet opp til en L med destillert H 2 O.
- Lag 1 L 0,1 M fosfatbuffer saltvannsoppløsning (pH 7,4): ta 100 ml 10 x PBS, og tilsett 900 ml destillert H-2 O.
- Lag 1 L 0,1 M fosfatbuffer saltvannsoppløsning (pH 7,4) med 0,1% Triton X-100: ta 100 ml 10 x PBS, tilsett 1 ml Triton X-100, og bringe volumet opp til 1 liter med destillert H2O
- Lag 1 L 10x 0,1 M fosfatbuffer (PB, pH 7,4): veie 26,2 g natriumfosfat (monobasisk) og 115 g natriumfosfat (dibasisk). Løs opp i ca 800 ml destillert H 2 O, justere pH, og bringe volumet opp til en L med destillert H 2 O.
- Lag 1 L 0,1 M fosfatbuffer (pH 7,4): ta 100 ml 10x PB,og tilsett 900 ml destillert H 2 O.
- Lag 1 L 0,1 M fosfatbuffer (pH 7,4) med 0,1% Triton X-100: ta 100 ml 10x PB, tilsett 1 ml Triton X-100, og bringe volumet opp til 1 liter med destillert H2O
- Lag 400 ml hydrogel monomer-løsning (4% akrylamid, 0,25% bis-acrylamid, 4% paraformaldehyd, 0,0075% ammoniumpersulfat, 0,0005% saponin i 0,1 M PBS): Vei opp 0,3 g ammoniumpersulfat og 0,2 g saponin. Legg 210 ml destillert H2O, 40 ml 40% akrylamid, 10 ml 2% bis-akrylamid, 40 ml 10 x PBS (pH 7,4), 100 ml 16% paraformaldehyd, og bland godt.
- Gjør 4 L clearingløsning (4% SDS i 0,2 M borsyre): Vei 49,464 g borsyre og 160 g SDS. Løs opp i ca 3,5 l destillert H 2 O, justere pH til 8,5 med NaOH, og bringe volumet opp til 4 L.
- Gjør en L 80% glyserol løsning: Mål 800 ml glyserol, tilsett 200 ml destillert H 2 O, og bland godt.
2. Vevpreparerina
- Forbered hydrogel monomer-løsning og 10 ml alikvot av hver 15 ml sentrifugerør.
- Dissekere hele vev og fikse i hydrogel for to dager ved 4 ° C. Sørge for at den hydrogel-løsning er minst 10 ganger volumet av vev.
- Ta med hydrogel fast vev (i 15 ml sentrifugerør) til en avtrekkshette.
- Polymerisere hydrogel fast vev ved å legge til 5 mL TEMED, bland godt, og la sitte i avtrekksskap ved romtemperatur i 2-3 timer.
- Fjern overflødig gel grundig. Merk: Ekstra gel vil hindre ryddeprosessen og antistoff penetrasjon under farging.
- Inkuber fast vev i 10 ml fjerne oppløsning i en inkubator innstilt rister ved 70 rpm og 50 ° C i flere dager inntil vevet blir gjennomsiktig. Endre clearing løsning minst en gang per dag, og fjern overflødig gel fra vevet ved endring av clearingløsning.
- Skyll vevet i 10 ml 0,1 M PB med 0,1% Triton X-100 ved 70 rpm og 37 ° C over natten. Gjenta dette trinnet tre ganger og fjerne overflødig gel fra vevet ved endring av bufferløsning.
- Inkuber den klarede vev i den primære antistoffløsningen i PB med 0,1% Triton X-100 ved 70 rpm og 37 ° C i 2 dager. Merk: Kontroller nok primær antistoff løsning å senke hele vev.
- Skyll vevet i 10 ml PB med 0,1% Triton X-100 ved 70 rpm og 37 ° C over natten. Gjenta dette trinnet tre ganger og fjerne overflødig gel fra vevet ved endring av bufferløsning.
- Utfør følgende trinn i et mørkt rom eller svakt lys. Dekk prøvene med folie for å hindre foto bleking.
- Inkuber den klarede vev med det fluorescerende sekundært antistoff oppløsning i PB med 0,1% Triton X-100, og det blokkerende serum ved 70 rpm og 37 ° C i 1 dag.
- Skyll vevet i 10 ml PB med 0,1% Triton X-100 ved 70 rpm og 37 ° C over natten. Gjenta dette trinnet tre ganger og fjerne overflødig gel fROM vevet ved endring av bufferløsning.
- Skyll vevet i 10 ml PBS ved 70 rpm og 37 ° C over natten. Gjenta dette trinnet tre ganger og fjerne overflødig gel fra vevet ved endring av bufferløsning.
- Inkuber den klarede vevet i 80% glycerol ved 70 rpm og 37 ° C over natten.
- Oppbevar fluorescerende farget vev ved 4 ° C før konfokalmikroskopi.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Flere viktige utviklings hendelser oppstår i hepatobiliært systemet under havet lamprett metamorfose. Den gallegang og galleblæren gjennomgå apoptose og degenerert (Figur 1). Kombinere den modifiserte avklaring metoden og farging med levercelle markør cytokeratin 19 (CK19, til stede i begge cholangiocytes og hepatocytter før og etter metamorfose 13) og anti-apoptotisk markør BCL2 hjelp konfokalmikroskopi, ble hele galle systemet fanget langs Z-aksen ( figur 2), og den 3-dimensjonale strukturen ble rekonstruert (figur 3). Laser scanning konfokalmikroskopi ble brukt til å utføre optisk snitt gjennom den intakte leveren, siden det meste av gallesystemet er innebygd inne i leveren, bortsett veikryss hvor gallekanalen kommer inn i tarmen. Den degenerative prosessen skjer i metamorfe stadier 2-4, fra perifere små galle ductules mot sentrale store intrahepatic felles gallegang (figur 2), i tråd med tidligere studier 10.
Figur 1. Galleblæren degenerasjon under havet lamprett metamorfose. Sea niøye miste galleblæren (svarte piler) under metamorfose. Prøvene ble tatt fra dyr med ytre morfologi mellom metamorfe stadiene 2 og 3, det vil si rundt øyet uten (stadium 2) eller med (stadium 3) skarp differensiering av iris og elev, fremtredende papilla-lignende anslag på den indre dorsalflate den muntlige hette (begge trinn), fortykket leppene til oral hette (stadium 2) danner en rektangulær inngang inn i munnhulen (stadium 3), eller "pug-lignende" snute (stadium 3) tre. Legg merke til at galleblæren også skiftet farge indikerer forskjeller i galle produksjon.I: tarmen. L:. Leveren Vennligst klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
Figur 2. Confocal bilder som viser galletreet i sjø lamprett lever under metamorfose. Prøvene ble tatt fra dyr med ytre morfologi mellom metamorfe stadier to og tre. Top paneler er tatt fra fremre og nedre paneler fra den bakre enden. Bilder av levercelle markør cytokeratin 19 (1:100 mus-anti-CK19, beiset med 2 mg / ml Alexa Fluor 350-geit-anti-mus IgG, blå) og anti-apoptotisk markør BCL2 (1:100 kanin-anti- BCL2; farget med 2 mg / ml Alexa Fluor 488-esel-anti-kanin IgG, grønn) er overlagret til å generere de fusjonerte bilder. Hvite piler indikerer biliary treet. Svarte piler indikerer mørk dendrittiske ser apoptotiske celler og omkringliggende canaliculi og ductules i leveren. I: tarmen. L: leveren. Målestokk:. 500 mikrometer Vennligst klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
Figur 3. 3D-bilder rekonstruert fra sammenslåtte confocal z-serien. 3D-bilder ble rekonstruert fra confocal z-serien av tre lever mellom metamorfe stadier to og tre. Optiske deler av sammenslåtte bilder av levercelle markør cytokeratin 19 (1:100 muse anti-CK19, beiset med 2 mg / ml Alexa Fluor 350-geit-anti-mus IgG, blå) og anti-apoptotisk markør BCL2 (1:100 kanin-anti-BCL2; farget med 2 mg / ml Alexa Fluor 488-esel -antikaninIgG; grønn) er rekonstruert med produsentens programvare for å generere 3D-bilder. Topp panelene er tatt fra fremre og nedre paneler fra den bakre ende. Hvite piler indikerer galletreet. Svarte piler indikerer mørk dendrittiske ser apoptotiske celler og omkringliggende canaliculi og ductules i leveren. I: tarmen. L: leveren. Målestokk:. 500 mikrometer Vennligst klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
.. Figur 4 A confocal optiske delen som viser gallegangene med galledråper i lumen sammenslåtte bildet fra tre fluorescerende kanaler; blå: mus-anti-c-Myc (1:100) / 2 mikrogram / ml Alexa Fluor 350-geit-anti-mus IgG; grønt: 2 mikrogram / ml Nissl grønn; Red: Kanin-anti-TGFβRII (1:100) / 2 mikrogram / ml Alexa Fluor 594-esel-anti-kanin. Målestokk: 500 mikrometer. Bile dråper er vist med svarte piler. Leveren prøven ble tatt mellom metamorfe scenen to og tre. Vennligst klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Denne protokollen er modifisert fra en ny metode kalt "klarhet" 12, som kryssbinder intakt vev med polyakrylamid for å danne en nanoporøse hydrogel og deretter strimler bort plasmamembranen av vevet for å oppnå optisk transparens og makromolekylær permeabilitet. "CLARITY" lar intakt-vev avbildning av langtrekkende projeksjon og lokale krets ledningsnett i nervesystemet. Denne nye fremgangsmåte kan anvendes til å visualisere hele gallesystemet i sjø lamprett leveren under metamorfose. Det er en utfordring i biologi for å innhente informasjon med høy oppløsning og opprettholde den globale perspektivet fra et komplekst system som hele gallesystemet eller sentralnervesystemet ved hjelp av konvensjonelle forankring og seksjonering metoder. Denne modifiserte KLARHET metoden tillater en laserstråle til å trenge gjennom intakte sea lamprett larve leveren opp til en tykkelse på 1 til 2 mm ved hjelp av lav-effekt fluorescerende objektiv (4x) i en vanlig laser scanning confocal mikroskop. Dypere penetrering kan oppnås ved hjelp av en mer avansert multifoton konfokal mikroskop. Tredimensjonale bilder kan rekonstrueres ved hjelp av 3D-rekonstruksjon programvare. Å oppnå sammenlignbare resultater ved å bruke konvensjonelle metoder vil være arbeidskrevende, medfører den stykkevise gjenoppbygging av flere seksjoner, og ville være begrenset til små volumer vev. Denne nye fremgangsmåten tilveiebringer verdifull informasjon fra hele strukturelle analyser av intakte systemer 12, er mindre arbeidskrevende og mer effektiv og reproduserbar.
En annen fordel med denne nye metoden er at prøven kan brukes om igjen flere ganger for farging med forskjellige antistoffer 12. Dette gjør sammenligningen mellom forskjellige molekylmarkører på samme prøven mer pålitelig og reproduserbar. Den stabile rammeverk som genereres av hydrogel tillater effektiv fjerning av antistoffer uten finstruktur skader og holder antigenisitet for et long tid 12. Clearing løsning denatures antistoffer og forstyrrer bindende, derfor fungerer som et antistoff-stripping løsning 12. Flere runder med farging er utført i sjøen lamprey leverprøver og struktur og farging forble optimal.
Det er to store endringer i denne protokollen fra den opprinnelige "CLARITY" protokoll 12. (1) som danner frie radikaler reagenser (ammoniumpersulfat og TEMED) ble anvendt for å initiere og akselerere polymerisasjonen av hydrogel i stedet for VA044. VA044 er foto og ikke tilgjengelig i USA (2) Ingen spesialbygd elektroforese kammeret blir brukt. I KLARHET metode 12, på grunn av størrelsen av de vev (musehjerne g. lamprett leveren), er elektrofore vev lysning som kreves for å påskynde utvinningen av plasmamembranen. For å unngå den opprinnelige kostnaden for en spesialbygd elektroforese kammer, vi først brukt exisvi agarosegelelektroforese enheter i vårt laboratorium. Dette viste seg å være meget ineffektiv. Imidlertid er inkubasjon i rydde løsning med hevet temperatur (50 ° C) meget effektiv i å fjerne plasmamembranen.
Selv om forfatterne på "CLARITY" advarte mot bruk av saponin i hydrogel, forbedrer det åpenhet i sjøen lamprett vev i vår prosedyre. En ulempe for confocal avbildning er at havet lamprett vev har sterk auto-fluorescens. Valget av fluoroforer må testes ved å sammenligne bildene før og etter immunofluorescerende farging.
Under havet lamprett metamorfose, regresjon av galleblæren epitel starter mellom metamorfe stadier to og tre. Ved metamorfe stadium 4, forsvinner galleblæren helt fra havet lamprett leveren 14. Gallegang degenerasjon er mest dramatiskmatic mellom metamorfe stadiene 3 og 4 15. Denne modifiserte metode er et kraftig verktøy for å studere de cellulære og molekylære mekanismer av degenerasjon av hele galle systemet, noe som kan gi innsikt for menneskelig biliær atresi.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Forfatterne har ingenting å avsløre.
Acknowledgments
Forfatterne erkjenner bidrag av Hammond Bay Biological Station, Great Lakes Science Center, US Geological Survey. Vi vil også takke Dr. Melinda Frame ved Center for Advanced Mikros ved Michigan State University for hennes teknisk støtte i laserskanning konfokalmikroskopi. Denne studien er støttet med tilskudd fra Great Lakes Fishery Commission til YWCD og WML.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 40% acrylamide | Bio-Rad | 161-0140 | |
| 2% bis-acrylamide | Bio-Rad | 161-0142 | |
| TEMED | Bio-Rad | 161-0800 | |
| ammonium persulfate | Sigma | A3678-25G | |
| boric acid | Sigma | B7901-1KG | |
| saponin | Sigma | 47036 | |
| sodium dodecyl sulfate | Sigma | L337-500G | |
| sodium phosphate (monobasic) | Sigma | 04269-1KG | |
| sodium phosphate (dibasic) | Sigma | S5136-1KG | |
| Triton X-100 | Sigma | X100-500ML | |
| glycerol | Sigma | G9012-500ML | |
| 16% paraformaldehyde | Electron Microscopy Sciences | 15710-S | |
| NaOH pellets | EMD | SX0590-3 | |
| 15 ml centrifuge tubes | Any brand | ||
| dissecting tools | Any brand |
References
- Applegate, V. C. Natural history of the sea lamprey (Petromyzon marinus) in Michigan. US Fish and Wildlife Service Special Science Report on Fishery Service. (55), (1950).
- Hardisty, M. W., Potter, I. C. The general biology of adult lampreys. The biology of lampreys. Hardisty, M. W., Potter, I. C. 1, New York Academic Press. 127-206 (1971).
- Youson, J. H., Potter, I. C. A description of the stages in the metamorphosis of the anadromous sea lamprey, Petromyzon marinus L. Can. J. Zool. 57, 1808-1817 (1979).
- Boomer, L. A., et al. Cholangiocyte apoptosis is an early event during induced metamorphosis in the sea lamprey, Petromyzon marinus L. J. Pediatr. Surg. 45, 114-120 (2010).
- Kasai, M., Suzuki, H., Ohashi, E., Ohi, R., Chiba, T., Okamoto, A. Technique and results of operative management of biliary atresia. World J. Surg. 2, 571-580 (1978).
- Suzuki, T., Hashimoto, T., Kondo, S., Sato, Y., Hussein, M. H. Evaluating patients’ outcome post-Kasai operation: a 19-year experience with modification of the hepatic portoenterostomy and applying a novel steroid therapy regimen. Pediatr. Surg. Int. 26, 825-830 (2010).
- Hartley, J. L., Davenport, M., Kelly, D. A. Biliary atresia. Lancet. 374, 1704-1713 (2009).
- Morecki, R., Glaser, J. H., Cho, S., Balistreri, W. F., Horwitz, M. S. Biliary atresia and reovirus type 3 infection. New Engl. J. Med. 307, 481-484 (1982).
- Shimadera, S., Iwai, N., Deguchi, E., Kimura, O., Fumino, S., Yokoyama, T. The inv mouse as an experimental model of biliary atresia. J. Pediatr. Surg. 42, 1555-1560 (2007).
- Sidon, E. W., Youson, J. H. Morphological changes in the liver of the sea lamprey, Petromyzon marinus L., during metamorphosis: I. Atresia of the bile ducts. J. Morphol. 177, 109-124 (1983).
- Yeh, C. -Y., Chung-Davidson, Y. -W., Wang, H., Li, K., Li, W. Intestinal synthesis and secretion of bile salts as an adaptation to developmental biliary atresia in the sea lamprey. Proc. Nat. Acad. Sci. U.S.A. 109, 11419-11424 (2012).
- Chung, K., et al. Structural and molecular interrogation of intact biological systems. Nature. 497, 332-337 (2013).
- Alarcón, V. B., Filosa, M. F., Youson, J. H. Cytokeratins in the liver of the sea lamprey (Petromyzon marinus) before and after metamorphosis. Cell Tissue Res. 287, 365-374 (1997).
- Youson, J. H., Ogilvie, D. R. Ultrastructural features of degeneration of the gallbladder during lamprey biliary atresia. Tissue and Cell. 22, 477-492 (1990).
- Morii, M., et al. Onset of apoptosis in the cystic duct during metamorphosis of a Japanese lamprey, Lethenteron reissneri. Anat. Rec. 293, 1155-1166 (2010).
