Summary
Lamprea de mar pierde la vesícula biliar y los conductos biliares durante la metamorfosis, un proceso similar a la atresia biliar humano. Un nuevo método de fijación y aclaración (CLARITY) se modificó para visualizar todo el árbol biliar mediante microscopía confocal de barrido láser. Este método proporciona una poderosa herramienta para estudiar la degeneración biliar.
Abstract
La atresia biliar es una rara enfermedad de la infancia, con un estimado de 1 en 15.000 de frecuencia en el sureste de los Estados Unidos, pero más común en los países del este de Asia, con una frecuencia reportada de 1 en 5000 en Taiwán. Aunque se sabe mucho sobre la gestión de la atresia biliar, su patogenia sigue siendo difícil de alcanzar. La lamprea marina (Petromyzon marinus) ofrece una oportunidad única para examinar el mecanismo y la progresión de la degeneración biliar. Lamprea de mar se desarrollan a través de tres etapas de la vida distintas: larva, parasitarias y adultos. Durante la transición de larvas a juveniles parasitaria, la lamprea de mar sufren metamorfosis con dramática reorganización y remodelación en la morfología externa y los órganos internos. En el hígado, todo el sistema se pierde biliar, incluyendo la vesícula biliar y el árbol biliar. Un nuevo método desarrollado la llamada "CLARIDAD" se modificó para aclarar todo el hígado y el cruce con el intestino en metamórfica lamprea de mar. Laproceso de degeneración biliar fue visualizado y discernido durante la lamprea de mar metamorfosis mediante el uso de microscopía confocal de barrido láser. Este método proporciona una poderosa herramienta para estudiar la atresia biliar en un modelo animal único.
Introduction
Lamprea de mar desarrollarse a través de tres etapas de la vida distinta 1,2. Lamprea marina larvas (L) pasan la mayor parte de tiempo en madrigueras como filtradores bentónicos. Después de pasar por siete etapas metamórficas de cambios drásticos en la morfología externa y la reorganización de los órganos internos 3, a los juveniles (JV) entran en una etapa parasitaria durante el cual se alimentan de sangre y fluidos de los tejidos del pez hospedador, el aumento de la masa corporal de más de 100 veces . 1.0 del a 1,5 años que se alimentan de los peces de acogida en el mar o grandes lagos, los adultos dejan de alimentación durante el comienzo de la primavera y migran hacia los ríos para desovar y luego mueren 1,2.
Durante la metamorfosis, el hígado lamprea de mar pierde la vesícula biliar y el árbol biliar, un fenotipo mutante evolutivo que imita la enfermedad infante humano atresia biliar. Atresia biliar infantil es una enfermedad hepática pediátrica rara con complicaciones médicas graves 4,5,6,7, 8.9.10, sin embargo, la patogenia y etiología de la atresia biliar son en gran parte desconocidos 4. Los pacientes con atresia biliar mueren dentro de los dos años después del nacimiento a menos que la intervención quirúrgica (procedimiento de Kasai) se lleva a cabo 5. Posteriormente, estos pacientes requieren un amplio manejo clínico y, a menudo el trasplante hepático 6. Se han propuesto muchas teorías sobre la etiopatogenia atresia biliar, como la infección viral, malformación congénita, enfermedad autoinmune, y el insulto tóxico. Sin embargo, la contribución de cada uno para el desarrollo de la atresia biliar no son concluyentes 7,8,9,10.
A diferencia de los niños que sufren atresia biliar patológica, la lamprea de mar se someten desarrollo programado atresia biliar sin una amplia necroinflamación, fibrosis o cirrosis 10. Los animales pueden sufrir colestasis transitoria durante este proceso 10, pero adaptarse a este trastorno del desarrolloa través de la síntesis de novo y de la secreción de sales biliares en el intestino después de la atresia biliar desarrollo, además de los mecanismos conocidos, tales como la reducción de la síntesis de sales biliares en el hígado 11. Este proceso de desarrollo de la lamprea de mar proporciona la única conocida oportunidad de examinar el progreso de la atresia biliar.
Un nuevo método desarrollado la llamada "CLARIDAD" permite obtener imágenes de alta resolución en los sistemas nervioso de mamíferos complejos mediante la transformación de tejido intacto en un hidrogel nanoporoso ópticamente transparente 12. El uso de la lamprea de mar hígado y un protocolo CLARIDAD modificada, las imágenes intactas de tejido de la degeneración biliar puede ser documentado a lo largo de la metamorfosis de hígado.
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Protocol
1. Preparación de la Solución
- Hacer 1 L de 10x 0,1 M solución salina tamponada con fosfato (PBS, pH 7,4): Pesar 26,2 g de fosfato de sodio (monobásico), 115 g de fosfato de sodio (dibásico), y 87,66 g de NaCl. Disolver en aproximadamente 800 ml de H 2 O destilada, ajustar el pH, y llevar el volumen hasta 1 litro con H2O destilada
- Hacer 1 L de solución salina tampón fosfato 0,1 M (pH 7,4): Tomar 100 ml de 10x PBS y añadir 900 ml de H2O destilada
- Hacer 1 L de 0,1 M de tampón fosfato salino (pH 7,4) con 0,1% de Triton X-100: Tomar 100 ml de 10x de PBS, añadir 1 ml de Triton X-100, y llevar el volumen hasta 1 L con H2O destilada
- Hacer 1 L de 0,1 M de 10x tampón de fosfato (PB, pH 7,4): Pesar 26,2 g de fosfato de sodio (monobásico) y 115 g de fosfato de sodio (dibásico). Disolver en aproximadamente 800 ml de H 2 O destilada, ajustar el pH, y llevar el volumen hasta 1 litro con H2O destilada
- Hacer 1 L 0,1 M tampón fosfato (pH 7,4): Tome 100 ml 10x PB,y añadir 900 ml de agua destilada H 2 O.
- Hacer 1 L 0,1 M tampón fosfato (pH 7,4) con 0,1% Triton X-100: Tomar 100 ml 10x PB, añadir 1 ml de Triton X-100, y llevar el volumen hasta 1 litro con H2O destilada
- Hacer solución de 400 ml de monómero de hidrogel (4% de acrilamida, 0,25% de bis-acrilamida, 4% de paraformaldehído, persulfato de amonio 0,0075%, 0,0005% de saponina en PBS 0,1 M): Pesar 0,3 g de persulfato de amonio y 0,2 g de saponina. Añadir 210 ml de H2O destilada, 40 ml de 40% de acrilamida, 10 ml de 2% de bis-acrilamida, 40 ml de 10x de PBS (pH 7,4), 100 ml de 16% de paraformaldehído, y mezclar bien.
- Haga solución clarificadora 4 L (4% SDS en ácido bórico 0,2 M): Pesar 49,464 g de ácido bórico y 160 g de SDS. Disolver en aproximadamente 3,5 l de H 2 O destilada, ajustar el pH a 8,5 con NaOH, y llevar el volumen hasta 4 L.
- Hacer 1 L de solución de glicerol al 80%: Medir 800 ml de glicerol, añadir 200 ml de H 2 O destilada y mezclar bien.
2. Preparación de Tejido
- Preparar la solución de monómero de hidrogel y 10 ml de alícuota a cada tubo de centrífuga de 15 ml.
- Diseccionar todo el tejido y fijar en el hidrogel durante 2 días a 4 ° C. Asegúrese de que la solución de hidrogel es al menos 10 veces el volumen del tejido.
- Llevar el tejido fijado de hidrogel (en el tubo de centrífuga de 15 ml) a una campana de humos.
- Polimerizar el tejido fijado hidrogel añadiendo 5 l de TEMED, mezclar bien y dejar reposar en la campana de extracción a temperatura ambiente durante 2-3 horas.
- Retire el exceso de gel a fondo. Nota: gel extra obstaculizará el proceso de compensación y la penetración de anticuerpos durante la tinción.
- Incubar el tejido fijado en 10 ml de compensación solución en un agitador incubador a 70 rpm y 50 ° C durante varios días hasta que el tejido se vuelve transparente. Cambie solución de limpieza de al menos una vez por día y eliminar el exceso de gel a partir del tejido cuando se cambia la solución de aclarado.
- Enjuague el tejido en 10 ml de PB 0,1 M con 0,1% de Triton X-100 al 70 rpm y de 37 ° C durante la noche. Repita este paso 3 veces y eliminar el exceso de gel a partir del tejido cuando se cambia la solución tampón.
- Incubar el tejido aclarado en la solución de anticuerpo primario en PB con 0,1% de Triton X-100 a 70 rpm y 37 ° C durante 2 días. Nota: Asegúrese de suficiente solución de anticuerpo primario para sumergir todo el tejido.
- Enjuague el tejido en 10 ml de PB con 0,1% de Triton X-100 a 70 rpm y 37 ° C durante la noche. Repita este paso 3 veces y eliminar el exceso de gel a partir del tejido cuando se cambia la solución tampón.
- Realice los pasos siguientes en un cuarto oscuro o con poca luz. Cubra las muestras con papel de aluminio para evitar la decoloración foto.
- Incubar el tejido aclarado con la solución de anticuerpo secundario fluorescente en PB con 0,1% de Triton X-100 y el suero de bloqueo a 70 rpm y 37 ° C durante 1 día.
- Enjuague el tejido en 10 ml de PB con 0,1% de Triton X-100 a 70 rpm y 37 ° C durante la noche. Repita este paso 3 veces y retire el exceso de gel fesde el tejido cuando el cambio de la solución tampón.
- Enjuague el tejido en 10 ml de PBS a 70 rpm y 37 ° C durante la noche. Repita este paso 3 veces y eliminar el exceso de gel a partir del tejido cuando se cambia la solución tampón.
- Incubar el tejido se aclara en 80% de glicerol a 70 rpm y 37 ° C durante la noche.
- Guarde el tejido teñido fluorescente a 4 ° C antes de la microscopía confocal.
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Representative Results
Varios acontecimientos importantes del desarrollo se producen en el sistema hepatobiliar durante la lamprea de mar metamorfosis. El conducto biliar y la vesícula biliar sufren apoptosis y degenerado (Figura 1). Combinando el método de clarificación modificado y tinción con hígado marcador de células citoqueratina 19 (CK19, presente en ambos cholangiocytes y hepatocitos antes y después de la metamorfosis 13) y Bcl2 marcador anti-apoptótica usando microscopía confocal, todo el sistema biliar fue capturado a lo largo del eje Z ( la Figura 2) y la estructura de 3 dimensiones fue reconstruido (Figura 3). El escaneo láser microscopía confocal se utilizó para llevar a cabo la sección óptica a través del hígado intacto desde la mayor parte del sistema biliar está incrustado dentro del hígado, excepto el cruce donde el conducto biliar entra en el intestino. El proceso degenerativo se produce en etapas metamórficas 2-4, a partir de pequeñas conductillos biliares periféricas hacia el centro de la gran intrahepatic conducto biliar común (Figura 2), en consonancia con estudios anteriores 10.
Figura 1. Degeneración de la vesícula biliar durante la lamprea de mar metamorfosis. Lamprea de mar pierde la vesícula biliar (flechas negras) durante la metamorfosis. Las muestras fueron tomadas de los animales con la morfología externa entre etapas metamórficas 2 y 3, es decir, ojo redondo y sin (fase 2) o con (etapa 3) aguda diferenciación del iris y la pupila, proyecciones papilares prominentes similares en la superficie dorsal interna de la vía oral campana (ambas etapas), de los labios de la campana oral (etapa 2) que forman una entrada rectangular en la cavidad oral (etapa 3), o el hocico "pug-como" (etapa 3) 3 espese. Tenga en cuenta que la vesícula biliar también cambió de color que indica las diferencias en la producción de bilis.I: delgado. L:. Hígado Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Figura 2. Confocal de imágenes que muestran el árbol biliar en el hígado lamprea marina durante la metamorfosis. Las muestras fueron tomadas de los animales con morfología externa entre las etapas metamórficas 2 y 3. Los paneles superiores se toman desde la parte anterior, y los paneles inferiores de la extremidad posterior. Imágenes de hígado marcador de células citoqueratina 19 (1:100 ratón-anti-CK19; tiñeron con 2 mg / ml de Alexa Fluor 350-de cabra anti-IgG de ratón; azul) y el marcador anti-apoptóticos Bcl2 (1:100 de conejo anti- Bcl2, manchado con 2 mg / ml Alexa Fluor 488-burro anti-conejo IgG; verde) se superponen para generar las imágenes fusionadas. Las flechas blancas indican la bárbol iliar. Las flechas negras indican el dendrítica oscuridad buscando células apoptóticas y los alrededores canalículos y conductillos en el hígado. I: delgado. L: hígado. Barra de escala:. 500 m Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Figura 3. Imágenes en 3D reconstruidas a partir confocal z-series fusionada. Imágenes 3D fueron reconstruidos a partir de la z-series confocal de tres hígados entre las etapas metamórficas 2 y 3. Secciones de óptica de las imágenes fusionadas de hígado marcador de células citoqueratina 19 (1:100 ratón anti-CK19; teñidas con Alexa Fluor 350-de cabra anti-IgG de ratón de 2 g / ml; azul) y el marcador anti-apoptóticos Bcl2 (1:100 de conejo anti-Bcl2; manchado con 2 mg / ml de Alexa Fluor 488-burro -anti-IgG de conejo; verde) se reconstruyen con el software del fabricante para generar las imágenes en 3D. Los paneles superiores son tomadas desde la parte anterior, y los paneles inferiores de la extremidad posterior. Las flechas blancas indican el árbol biliar. Las flechas negras indican el dendrítica oscuridad buscando células apoptóticas y los alrededores canalículos y conductillos en el hígado. I: delgado. L: hígado. Barra de escala:. 500 m Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
.. Figura 4 Una sección óptica confocal que muestra los conductos biliares con gotas biliares en el lumen imagen fusionada de 3 canales fluorescentes; azul: ratón-anti-c-Myc (1:100) / 2 mg Alexa Fluor 350 cabra anti-ratón IgG / ml; verde: 2 mg / ml Nissl verde; Rojo: Conejo anti-TGFβRII (1:100) / 2 mg / ml Alexa Fluor 594-burro anti-conejo. Barra de escala: 500 m. Gotitas biliares se indican por flechas negras. La muestra de hígado fue tomada entre el estadio metamórfico 2 y 3. Por favor haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
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Discussion
Este protocolo se modificó a partir de un nuevo método llamado "claridad" 12, que se reticula tejido intacto con poliacrilamida para formar un hidrogel nanoporoso, y luego despoja de la membrana plasmática del tejido para conseguir la transparencia óptica y la permeabilidad macromolecular. "CLARIDAD" permite obtener imágenes de los tejidos intactos de proyección de largo alcance y el cableado del circuito local en el sistema nervioso. Este nuevo método se puede utilizar para visualizar todo el sistema biliar en lamprea marina hígado durante la metamorfosis. Es un reto en la biología para obtener información de alta resolución y mantener la perspectiva global de un sistema complejo, como todo el sistema biliar o el sistema nervioso central mediante la incrustación convencional y métodos de la sección. Este método CLARIDAD modificado permite un rayo láser para penetrar a través de la lamprea marina hígado de larvas intacta hasta un espesor de 1 a 2 mm usando objetivo fluorescente de baja potencia (4x) en un confoca regular de escaneo láserl microscopio. Una penetración más profunda se puede lograr utilizando un más avanzada de multi-fotón microscopio confocal. Las imágenes tridimensionales pueden ser reconstruidos utilizando software de reconstrucción 3D. El logro de resultados comparables utilizando métodos convencionales sería laborioso, que implica la reconstrucción gradual de muchas secciones, y se limita a pequeños volúmenes de tejido. Este nuevo método proporciona información valiosa de los análisis estructurales de los sistemas enteros intactos 12, es menos mano de obra, más eficiente y reproducible.
Otra de las ventajas de este nuevo método es que la muestra se pueden reutilizar varias veces para la tinción con anticuerpos diferentes 12. Esto hace que la comparación entre diferentes marcadores moleculares en el mismo espécimen más fiable y reproducible. El marco estable generada por hidrogel permite la eliminación eficaz de anticuerpos sin daños de estructura fina y conserva la antigenicidad de lotiempo ng 12. La solución de aclarado desnaturaliza anticuerpos e interrumpe de unión, actuando por lo tanto como una solución de anticuerpo de decapado 12. Varias rondas de tinción se han realizado en las muestras de hígado lamprea de mar y de la estructura y la tinción seguido siendo óptima.
Hay dos grandes modificaciones en este protocolo del protocolo original "CLARIDAD" 12. (1) los reactivos generadores de radicales libres (persulfato de amonio y TEMED) se utilizaron para iniciar y acelerar la polimerización del hidrogel en lugar de VA044. VA044 es fotosensible y no está disponible en los EE.UU. (2) No se utiliza ninguna cámara de electroforesis a medida. En el método de CLARITY 12, debido al tamaño de los tejidos (cerebro de ratón vs lamprea hígado), se requiere compensación tejido electroforética para acelerar la extracción de la membrana plasmática. Para evitar el costo inicial de una cámara de electroforesis hecha a la medida, que utilizó por primera exipicadura de electroforesis en gel de agarosa en nuestro laboratorio. Esto resultó ser muy ineficiente. Sin embargo, la incubación en la solución de compensación con temperatura elevada (50 ° C) es muy eficaz en la limpieza de la membrana plasmática.
Aunque los autores de la "claridad" advierte contra el uso de saponina en el hidrogel, mejora la transparencia en el tejido de la lamprea de mar en nuestro procedimiento. Uno de los inconvenientes de la imagen confocal es que el tejido de la lamprea de mar tiene una fuerte auto-fluorescencia. La elección de los fluoróforos debe ser probado mediante la comparación de las imágenes antes y después de la tinción de inmunofluorescencia.
Durante la lamprea de mar metamorfosis, la regresión en el epitelio de la vesícula biliar comienza entre las etapas metamórficas 2 y 3. Por etapas metamórficas 4, la vesícula biliar desaparece por completo a partir de hígado de la lamprea de mar 14. La degeneración de las vías biliares es más draMatic entre fases metamórficas 3 y 4 15. Este método modificado es una poderosa herramienta para estudiar los mecanismos celulares y moleculares de la degeneración de todo el sistema biliar, que puede proporcionar ideas para la atresia biliar humana.
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Disclosures
Los autores no tienen nada que revelar.
Acknowledgments
Los autores agradecen la contribución de la Estación Biológica de Hammond Bay, Great Lakes Science Center, Servicio Geológico de EE.UU.. También agradecemos a la Dra. Melinda Frame en el Centro de Microscopía Avanzada de la Universidad del Estado de Michigan por su apoyo técnico en la microscopía confocal de barrido láser. Este estudio es apoyado por becas de la Comisión de Pesca de Lagos a YWCD y WML.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 40% acrylamide | Bio-Rad | 161-0140 | |
| 2% bis-acrylamide | Bio-Rad | 161-0142 | |
| TEMED | Bio-Rad | 161-0800 | |
| ammonium persulfate | Sigma | A3678-25G | |
| boric acid | Sigma | B7901-1KG | |
| saponin | Sigma | 47036 | |
| sodium dodecyl sulfate | Sigma | L337-500G | |
| sodium phosphate (monobasic) | Sigma | 04269-1KG | |
| sodium phosphate (dibasic) | Sigma | S5136-1KG | |
| Triton X-100 | Sigma | X100-500ML | |
| glycerol | Sigma | G9012-500ML | |
| 16% paraformaldehyde | Electron Microscopy Sciences | 15710-S | |
| NaOH pellets | EMD | SX0590-3 | |
| 15 ml centrifuge tubes | Any brand | ||
| dissecting tools | Any brand |
References
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