Summary
Zeeprik verliest de galblaas en galwegen tijdens metamorfose, een proces vergelijkbaar met de menselijke galgangatresie. Een nieuwe bevestiging en verduidelijking methode (duidelijkheid) werd gewijzigd om de gehele galwegen met behulp van laser scanning confocale microscopie visualiseren. Deze methode biedt een krachtig hulpmiddel om de gal degeneratie studeren.
Abstract
Galgangatresie is een zeldzame ziekte van de kindertijd, met een geschatte 1 in 15.000 frequentie in het zuidoosten Verenigde Staten, maar vaker in Oost-Aziatische landen, met een gerapporteerde frequentie van 1 in 5000 in Taiwan. Hoewel veel bekend is over het beheer van galgangatresie, de pathogenese is nog steeds ongrijpbaar. De zeeprik (Petromyzon marinus) biedt een unieke gelegenheid om het mechanisme en de progressie van de galwegen degeneratie te onderzoeken. Zeeprik ontwikkelen door middel van drie verschillende levensfasen: larvale, parasitaire, en volwassen. Tijdens de overgang van larven tot parasitaire jeugdcriminaliteit, zeeprik ondergaan metamorfose met dramatische reorganisatie en verbouwing van de externe morfologie en interne organen. In de lever wordt het gehele galwegen verloren, zoals de galblaas en galwegen. Een nieuw ontwikkelde methode genaamd "duidelijkheid" is gewijzigd om de hele lever en de kruising met de darm in metamorfe Zeeprik verduidelijken. Deproces van gal degeneratie werd gevisualiseerd en onderscheiden tijdens zeeprik metamorfose met behulp van laser scanning confocale microscopie. Deze methode biedt een krachtig hulpmiddel om galgangatresie studeren in een uniek diermodel.
Introduction
Zeeprik ontwikkelen door middel van drie verschillende levensstadia 1,2. Larvale zeeprik (L) brengen de meeste tijd in holen als benthische filter feeders. Na het doorlopen zeven metamorfe stadia dramatische veranderingen in de externe morfologie en reorganisatie in inwendige organen 3, de resulterende jongeren (JV) Voer een parasitaire fase waarin zij zich voeden met bloed en weefsel vloeistoffen uit gastheervis en maakt de lichaamsmassa meer dan 100 keer . Na 1,0 tot 1,5 jaar voeden met de gastheer vis in de oceaan of de grote meren, volwassenen ophouden borstvoeding tijdens het vroege voorjaar en migreren in rivieren om te paaien en dan sterven 1,2.
Tijdens de metamorfose, de zeeprik lever verliest de galblaas en de hele galwegen, een evolutionaire mutante fenotype dat de menselijke zuigeling ziekte galgangatresie nabootst. Zuigeling galgangatresie is een zeldzame pediatrische leverziekte met ernstige medische complicaties 4,5,6,7, 8,9,10, maar de pathogenese en etiologie van galgangatresie zijn grotendeels onbekend 4. Patiënten met galgangatresie sterven binnen twee jaar na de geboorte, tenzij chirurgische ingreep (Kasai procedure) wordt uitgevoerd 5. Vervolgens deze patiënten vereisen uitgebreide klinische behandeling en vaak levertransplantatie 6. Veel theorieën van biliaire atresie etiopathogenese voorgesteld, zoals virale infecties, aangeboren afwijking, auto-immuunziekten en toxische insult. Echter, de bijdrage van elk tot de ontwikkeling van galgangatresie blijft onduidelijk 7,8,9,10.
In tegenstelling tot de zuigelingen die pathologische galgangatresie lijden, ondergaan zeeprik ontwikkelingsgebied geprogrammeerd galgangatresie zonder uitgebreide necroinflammation, fibrose of cirrose 10. De dieren kunnen voorbijgaande cholestase lijden tijdens dit proces 10, maar aan te passen aan deze ontwikkelingsstoornis aandoeningvia de synthese en uitscheiding van galzouten in de darm na ontwikkeling biliaire atresie, naast de bekende mechanismen zoals een vermindering van galzout synthese in lever 11. Dit ontwikkelingsproces in Zeeprik biedt de enige bekende mogelijkheid om de progressie van biliaire atresie onderzoeken.
Een nieuw ontwikkelde methode genaamd "duidelijkheid" maakt hoge-resolutie beeldvorming in complexe zoogdieren zenuwstelsel door het transformeren intact weefsel in een optisch transparant nanoporeus hydrogel 12. Met behulp van de zeeprik lever en een gemodificeerd DUIDELIJKHEID protocol, kan intact weefsel beeldvorming van de galwegen degeneratie worden gedocumenteerd in de lever metamorfose.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. Oplossing Voorbereiding
- Voeg 1 L 10x 0,1 M fosfaatbuffer zoutoplossing (PBS, pH 7,4): Weeg 26,2 g natriumfosfaat (monobasisch), 115 g natriumfosfaat (dibasisch) en 87,66 g NaCl. Los op in ongeveer 800 ml gedestilleerd H 2 O, aan te passen pH, en breng het volume tot 1 L met gedestilleerd H 2 O.
- Maak 1 L 0,1 M fosfaatbuffer zoutoplossing (pH 7,4): Neem 100 ml 10x PBS en voeg 900 ml gedestilleerd H 2 O.
- Maak 1 L 0,1 M fosfaatbuffer zoutoplossing (pH 7,4) met 0,1% Triton X-100: Neem 100 ml 10x PBS, voeg 1 ml Triton X-100, en breng het volume tot 1 L met gedestilleerd H 2 O.
- Voeg 1 L 10x 0,1 M fosfaatbuffer (PB, pH 7,4): Weeg 26,2 g natriumfosfaat (monobasisch) en 115 g natriumfosfaat (dibasisch). Los op in ongeveer 800 ml gedestilleerd H 2 O, aan te passen pH, en breng het volume tot 1 L met gedestilleerd H 2 O.
- Maak 1 L 0,1 M fosfaatbuffer (pH 7,4): Neem 100 ml 10x PB,en voeg 900 ml gedestilleerd H2O
- Maak 1 L 0,1 M fosfaatbuffer (pH 7,4) met 0,1% Triton X-100: Neem 100 ml 10x PB, voeg 1 ml Triton X-100, en breng het volume tot 1 L met gedestilleerd H 2 O.
- Voeg 400 ml hydrogel monomeeroplossing (4% acrylamide, 0,25% bis-acrylamide, 4% paraformaldehyde, 0,0075% ammoniumpersulfaat, 0,0005% saponine in 0,1 M PBS): Weeg 0,3 g ammoniumpersulfaat en 0,2 g saponine. Voeg 210 ml gedestilleerd H2O, 40 ml 40% acrylamide, 10 ml 2% bis-acrylamide, 40 ml 10x PBS (pH 7,4), 100 ml 16% paraformaldehyde en meng.
- Maak 4 L clearing-oplossing (4% SDS in 0,2 M boorzuur): Weeg 49,464 g boorzuur en 160 g SDS. Los op in ongeveer 3,5 L gedestilleerd H2O, pH op 8,5 met NaOH en breng het volume tot 4 L.
- Maak 1 L 80% glycerol oplossing: Meet 800 ml glycerol, voeg 200 ml gedestilleerd H 2 O, en meng goed.
2. Tissue Voorbereiding
- Bereid hydrogel monomeeroplossing en hoeveelheid 10 ml elk 15 ml centrifugebuis.
- Ontleden het gehele weefsel en fixeer het hydrogel gedurende 2 dagen bij 4 ° C. Controleer of de hydrogel oplossing tenminste 10x het volume van het weefsel.
- Breng de hydrogel vaste weefsel (in de 15 ml centrifugebuis) een zuurkast.
- Polymeriseren de hydrogel vaste weefsel door toevoeging van 5 pl TEMED, meng goed en laat zitten in de zuurkast bij kamertemperatuur gedurende 2-3 uur.
- Verwijder de overtollige gel grondig. Let op: Extra gel zal het clearing proces en het antilichaam penetratie tijdens kleuring belemmeren.
- Incubeer de vaste weefsel in 10 ml clearing oplossing in een incubator schudder ingesteld op 70 tpm en 50 ° C gedurende enkele dagen tot het weefsel doorzichtig. Wijzig clearing oplossing ten minste eenmaal per dag en verwijder de overtollige gel uit het weefsel bij het veranderen van de clearing oplossing.
- Spoel het weefsel in 10 ml 0,1 M PB met 0,1% Triton X-100 bij 70 ruur en 37 ° C gedurende de nacht. Herhaal deze stap 3 keer en verwijder de overtollige gel uit het weefsel bij het wijzigen van de bufferoplossing.
- Incubeer de geklaarde weefsel in het primaire antilichaam oplossing PB met 0,1% Triton X-100 bij 70 tpm en 37 ° C gedurende 2 dagen. Opmerking: Maak genoeg primaire antilichaam oplossing voor het hele weefsel onderdompelen.
- Spoel het weefsel in 10 ml PB met 0,1% Triton X-100 bij 70 tpm en 37 ° C gedurende de nacht. Herhaal deze stap 3 keer en verwijder de overtollige gel uit het weefsel bij het wijzigen van de bufferoplossing.
- Voer de volgende stappen in een donkere kamer of bij weinig licht. Bedek de monsters met folie van de foto's bleken te voorkomen.
- Incubeer de geklaarde weefsel met de fluorescerende secundaire antilichaam oplossing PB met 0,1% Triton X-100 en de blokkering serum bij 70 tpm en 37 ° C gedurende 1 dag.
- Spoel het weefsel in 10 ml PB met 0,1% Triton X-100 bij 70 tpm en 37 ° C gedurende de nacht. Herhaal deze stap 3 keer en verwijder de overtollige gel from het weefsel wanneer u de bufferoplossing.
- Spoel het weefsel in 10 ml PBS bij 70 tpm en 37 ° C gedurende de nacht. Herhaal deze stap 3 keer en verwijder de overtollige gel uit het weefsel bij het wijzigen van de bufferoplossing.
- Incubeer de geklaarde weefsel in 80% glycerol bij 70 rpm en 37 ° C gedurende de nacht.
- Bewaar de tl-lood weefsel bij 4 ° C voorafgaand aan confocale microscopie.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Enkele belangrijke ontwikkelingsstoornissen gebeurtenissen in het Lever-/galstelsel tijdens Zeeprik metamorfose. De galwegen en de galblaas ondergaan apoptose en gedegenereerde (figuur 1). Het combineren van de gemodificeerde verduidelijking werkwijze en kleuring met levercellen cytokeratine 19 (CK19, aanwezig in zowel cholangiocyten en hepatocyten voor en na metamorfose 13) en anti-apoptotische marker Bcl2 via confocale microscopie werd de volledige galwegen gevangen langs de Z-as ( Figuur 2) en de 3-dimensionale structuur is opgebouwd (figuur 3). Laser scanning confocale microscopie werd gebruikt om optische doorsnede voeren door de intacte lever aangezien de meeste van de galwegen in de lever is ingebed behalve de kruising waar de galwegen komt in de darm. De degeneratieve proces vindt plaats in metamorfe stadia 2-4, vanuit perifere kleine gal ductules naar de centrale grote intrahepatische galbuis (figuur 2), in overeenstemming met eerdere studies 10.
Figuur 1. Galblaas degeneratie tijdens Zeeprik metamorfose. Zeeprik verliest de galblaas (zwarte pijlen) tijdens metamorfose. De monsters werden genomen bij dieren met externe morfologie tussen metamorfe fasen 2 en 3, dat wil zeggen rond oog zonder (fase 2) of met (fase 3) scherpe differentiatie van iris en pupil, prominent papillen-achtige uitsteeksels aan de binnenkant dorsale oppervlak van de orale kap (beide fasen), verdikte lippen van orale kap (fase 2) vormen een rechthoekig entree in de mondholte (fase 3), of "pug-achtige" snuit (fase 3) 3. Merk op dat de galblaas ook veranderd kleur wijzen op verschillen in de gal productie.I: darm. L:. Lever Klik hier om een grotere versie van deze afbeelding te bekijken.
Figuur 2. Confocale beelden die de galwegen in Zeeprik lever tijdens metamorfose. De monsters werden genomen bij dieren met externe morfologie tussen metamorfe fasen 2 en 3. Top panelen zijn afkomstig uit de voorste en de onderste panelen van het achterste einde. Afbeeldingen van levercel cytokeratine 19 (1:100 muis-anti-CK19, gekleurd met 2 ug / ml Alexa Fluor 350-geit-anti-muis IgG, blauw) en anti-apoptotische marker Bcl2 (1:100 konijn-anti- BCL2, gekleurd met 2 ug / ml Alexa Fluor 488-ezel-anti-konijn IgG; groen) tot een totale samengevoegde beelden te genereren. Witte pijlen geven de biliary boom. Zwarte pijlen geven de donkere dendritische kijken apoptotische cellen en omringende canaliculi en ductuli in de lever. I: darm. L: lever. Schaalbalk:. 500 pm Klik hier om een grotere versie van deze afbeelding te bekijken.
Figuur 3. 3D-beelden gereconstrueerd uit samengevoegde confocale z-serie. 3D-beelden werden gereconstrueerd op basis van de confocale z-serie van drie levers tussen metamorfe fasen 2 en 3. Optische delen van samengevoegde beelden van levercel cytokeratine 19 (1:100 muis- anti-CK19, gekleurd met 2 ug / ml Alexa Fluor 350 geit-anti-muis IgG, blauw) en anti-apoptotische marker Bcl2 (1:100 konijn-anti-Bcl2, gekleurd met 2 ug / ml Alexa Fluor 488-ezel -anti-konijn IgG; groen) gereconstrueerd software van de fabrikant om de 3D beelden te genereren. Top panelen uit de voorste en de onderste panelen van het achterste einde. Witte pijlen geven de galwegen. Zwarte pijlen geven de donkere dendritische kijken apoptotische cellen en omringende canaliculi en ductuli in de lever. I: darm. L: lever. Schaalbalk:. 500 pm Klik hier om een grotere versie van deze afbeelding te bekijken.
.. Figuur 4 Een confocale optische doorsnede van galwegen met gal druppels in het lumen samengevoegde afbeelding van 3 TL-kanalen; blauw: muis-anti-c-Myc (1:100) / 2 ug / ml Alexa Fluor 350 geit-anti-muis IgG; groen: 2 ug / ml Nissl groen; Rood: Konijn-anti-TGFβRII (1:100) / 2 ug / ml Alexa Fluor 594-ezel-anti-konijn. Schaal bar: 500 micrometer. Gal druppeltjes zijn aangegeven met zwarte pijlen. De lever specimen is gevangen tussen metamorfe fase 2 en 3. Klik hier om een grotere versie van deze afbeelding te bekijken.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Dit protocol is een modificatie van een nieuwe methode genaamd "duidelijkheid" 12, die intact weefsel verknoopt polyacrylamide met een nanoporeuze hydrogel, en ontdoet het plasmamembraan van het weefsel optische transparantie en macromoleculaire permeabiliteit bereiken. "Duidelijkheid" kunt intact weefsel beeldvorming van lange afstand projectie en lokale bedrading in het zenuwstelsel. Deze nieuwe methode kan worden gebruikt om de gehele galwegen visualiseren Zeeprik lever tijdens metamorfose. Het is een uitdaging in de biologie aan hoge-resolutie-informatie te verkrijgen en het mondiale perspectief van een complex systeem, zoals de gehele galwegen of het centrale zenuwstelsel met behulp van conventionele inbedding en snijden methoden te behouden. Deze gewijzigde CLARITY methode kan een laserstraal te dringen door de intacte Zeeprik larvale lever tot een dikte van 1 tot 2 mm met laag vermogen fluorescerende doelstelling (4x) in bijvoorbeeld een laser scanning confocal microscoop. Diepere penetratie kan worden bereikt met een meer geavanceerde multi-foton confocale microscoop. Driedimensionale afbeeldingen kunnen worden gereconstrueerd met behulp van 3D reconstructie software. Vergelijkbare resultaten verkregen met behulp van conventionele methoden zou moeizaam zijn, waarbij de fragmentarische reconstructie van vele onderdelen, en zou worden beperkt tot kleine weefsel volumes. Deze nieuwe werkwijze verschaft waardevolle informatie uit compleet structurele analyse van intacte systemen 12, minder arbeidsintensief, efficiënter en reproduceerbaar.
Een ander voordeel van deze nieuwe werkwijze is dat het monster meerdere malen kan worden hergebruikt voor kleuring met verschillende antilichamen 12. Dit maakt de vergelijking tussen verschillende moleculaire markers in hetzelfde monster betrouwbaar en reproduceerbaar. De stabiel kader gegenereerd door hydrogel zorgt effectieve verwijdering van antilichamen zonder fijne structuur schade en onderhoudt de antigeniciteit voor een long tijd 12. De clearing oplossing denatureert antilichamen en verstoort bindend, dus als een antilichaam stripoplossing 12. Verschillende rondes van kleuring zijn uitgevoerd in de zeeprik lever monsters en de structuur en kleuring bleef optimaal.
Er zijn twee belangrijke wijzigingen in dit protocol uit de originele "duidelijkheid" protocol 12. (1) Vrije radicalen genererende reagentia (ammoniumpersulfaat en TEMED) gebruikt initiëren en versnellen de polymerisatie van de hydrogel plaats van VA044. VA044 is lichtgevoelig en niet beschikbaar in de VS (2) No-custom-built elektroforese kamer wordt gebruikt. In de helderheid werkwijze 12, door de omvang van de weefsels (hersenen van muizen versus lamprey lever) wordt elektroforetische weefsel clearing nodig om de extractie van de plasmamembraan versnellen. Om de initiële kosten voor een custom-built elektroforese kamer te vermijden, hebben we voor het eerst gebruikt existing agarosegelelektroforese apparaten in ons laboratorium. Dit bleek zeer inefficiënt. Echter, incubatie in clearingoplossing met verhoogde temperatuur (50 ° C) is zeer effectief in het klaren de plasmamembraan.
Hoewel de auteurs voor "duidelijkheid" gewaarschuwd tegen het gebruik van saponine in de hydrogel, het verbetert de transparantie in de zeeprik weefsel in onze procedure. Een nadeel voor confocale beeldvorming is dat zeeprik weefsel heeft een sterke auto-fluorescentie. De keuze van fluoroforen worden getest door de beelden te vergelijken voor en na immunofluorescentie kleuring.
Tijdens Zeeprik metamorfose, de regressie van de galblaas epitheel begint tussen metamorfe fasen 2 en 3. Door metamorfose fase 4, de galblaas verdwijnt volledig uit Zeeprik lever 14. Galgang degeneratie is meest dramatic tussen metamorfe stadia 3 en 4 15. Deze gewijzigde methode is een krachtig hulpmiddel om de cellulaire en moleculaire mechanismen van de degeneratie van het gehele galwegen, die inzichten kunnen voorzien in de menselijke galgangatresie bestuderen.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
De auteurs hebben niets te onthullen.
Acknowledgments
De auteurs erkennen de bijdrage van Hammond Bay Biologisch Station, Great Lakes Science Center, US Geological Survey. We danken ook Dr Melinda Frame bij het Center for Advanced Microscopy aan de Michigan State University voor haar technische ondersteuning bij confocale laser scanning microscopie. Dit onderzoek wordt ondersteund door subsidies van de Grote Meren Visserijcommissie om YWCD en WML.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 40% acrylamide | Bio-Rad | 161-0140 | |
| 2% bis-acrylamide | Bio-Rad | 161-0142 | |
| TEMED | Bio-Rad | 161-0800 | |
| ammonium persulfate | Sigma | A3678-25G | |
| boric acid | Sigma | B7901-1KG | |
| saponin | Sigma | 47036 | |
| sodium dodecyl sulfate | Sigma | L337-500G | |
| sodium phosphate (monobasic) | Sigma | 04269-1KG | |
| sodium phosphate (dibasic) | Sigma | S5136-1KG | |
| Triton X-100 | Sigma | X100-500ML | |
| glycerol | Sigma | G9012-500ML | |
| 16% paraformaldehyde | Electron Microscopy Sciences | 15710-S | |
| NaOH pellets | EMD | SX0590-3 | |
| 15 ml centrifuge tubes | Any brand | ||
| dissecting tools | Any brand |
References
- Applegate, V. C. Natural history of the sea lamprey (Petromyzon marinus) in Michigan. US Fish and Wildlife Service Special Science Report on Fishery Service. (55), (1950).
- Hardisty, M. W., Potter, I. C. The general biology of adult lampreys. The biology of lampreys. Hardisty, M. W., Potter, I. C. 1, New York Academic Press. 127-206 (1971).
- Youson, J. H., Potter, I. C. A description of the stages in the metamorphosis of the anadromous sea lamprey, Petromyzon marinus L. Can. J. Zool. 57, 1808-1817 (1979).
- Boomer, L. A., et al. Cholangiocyte apoptosis is an early event during induced metamorphosis in the sea lamprey, Petromyzon marinus L. J. Pediatr. Surg. 45, 114-120 (2010).
- Kasai, M., Suzuki, H., Ohashi, E., Ohi, R., Chiba, T., Okamoto, A. Technique and results of operative management of biliary atresia. World J. Surg. 2, 571-580 (1978).
- Suzuki, T., Hashimoto, T., Kondo, S., Sato, Y., Hussein, M. H. Evaluating patients’ outcome post-Kasai operation: a 19-year experience with modification of the hepatic portoenterostomy and applying a novel steroid therapy regimen. Pediatr. Surg. Int. 26, 825-830 (2010).
- Hartley, J. L., Davenport, M., Kelly, D. A. Biliary atresia. Lancet. 374, 1704-1713 (2009).
- Morecki, R., Glaser, J. H., Cho, S., Balistreri, W. F., Horwitz, M. S. Biliary atresia and reovirus type 3 infection. New Engl. J. Med. 307, 481-484 (1982).
- Shimadera, S., Iwai, N., Deguchi, E., Kimura, O., Fumino, S., Yokoyama, T. The inv mouse as an experimental model of biliary atresia. J. Pediatr. Surg. 42, 1555-1560 (2007).
- Sidon, E. W., Youson, J. H. Morphological changes in the liver of the sea lamprey, Petromyzon marinus L., during metamorphosis: I. Atresia of the bile ducts. J. Morphol. 177, 109-124 (1983).
- Yeh, C. -Y., Chung-Davidson, Y. -W., Wang, H., Li, K., Li, W. Intestinal synthesis and secretion of bile salts as an adaptation to developmental biliary atresia in the sea lamprey. Proc. Nat. Acad. Sci. U.S.A. 109, 11419-11424 (2012).
- Chung, K., et al. Structural and molecular interrogation of intact biological systems. Nature. 497, 332-337 (2013).
- Alarcón, V. B., Filosa, M. F., Youson, J. H. Cytokeratins in the liver of the sea lamprey (Petromyzon marinus) before and after metamorphosis. Cell Tissue Res. 287, 365-374 (1997).
- Youson, J. H., Ogilvie, D. R. Ultrastructural features of degeneration of the gallbladder during lamprey biliary atresia. Tissue and Cell. 22, 477-492 (1990).
- Morii, M., et al. Onset of apoptosis in the cystic duct during metamorphosis of a Japanese lamprey, Lethenteron reissneri. Anat. Rec. 293, 1155-1166 (2010).
