Summary
La lamproie marine perdre la vésicule biliaire et des voies biliaires au cours de la métamorphose, un processus similaire à l'atrésie biliaire humaine. Une nouvelle méthode de fixation et de clarification (CLARITY) a été modifié pour visualiser l'ensemble de l'arbre biliaire en utilisant la numérisation laser microscopie confocale. Cette méthode fournit un outil puissant pour étudier la dégénérescence biliaire.
Abstract
Atrésie des voies biliaires est une maladie rare de l'enfance, avec une fréquence d'environ 1 à 15 000 dans le sud-est des États-Unis, mais plus fréquente dans les pays en Asie de l'Est, avec une fréquence déclarée de 1 à 5000 à Taiwan. Bien que beaucoup est connu au sujet de la gestion de l'atrésie des voies biliaires, sa pathogénie est encore insaisissable. La lamproie marine (Petromyzon marinus) offre une occasion unique d'examiner le mécanisme et la progression de la dégénérescence des voies biliaires. La lamproie marine développer à travers trois étapes de la vie distincts: larves, parasites, et adultes. Lors du passage de larves à des mineurs parasite, la lamproie marine subir la métamorphose de la réorganisation dramatique et le remodelage de la morphologie externe et les organes internes. Dans le foie, l'ensemble du système biliaire est perdu, y compris la vésicule biliaire et des voies biliaires. Une méthode nouvellement développé appelé «clarté» a été modifié pour clarifier l'ensemble du foie et la jonction avec l'intestin dans métamorphique lamproie marine. Laprocessus de dégénérescence biliaire a été visualisée et discerné lors de la lamproie marine métamorphose en utilisant la numérisation laser microscopie confocale. Cette méthode fournit un outil puissant pour étudier atrésie des voies biliaires dans un modèle animal unique.
Introduction
La lamproie marine se développer à travers trois étapes distinctes vie 1,2. Larvaire lamproie (L) passent plus de temps dans des terriers comme filtreurs benthiques. Après avoir traversé sept étapes métamorphiques de changements dramatiques dans la morphologie externe et la réorganisation des organes internes 3, les mineurs résultant (JV) entrent dans un stade parasitaire au cours de laquelle ils se nourrissent de sang et les liquides tissulaires de poisson hôte, l'augmentation de la masse corporelle de plus de 100 fois . Après 1.0 à 1,5 ans d'alimentation sur le poisson hôte dans l'océan ou les grands lacs, les adultes cessent de s'alimenter au début du printemps et migrent dans les rivières pour frayer et mourir 1,2.
Au cours de métamorphose, le foie de la lamproie marine perd la vésicule biliaire et l'ensemble de l'arbre biliaire, un phénotype mutant évolutif qui imite la maladie infantile humaine atrésie des voies biliaires. Atrésie des voies biliaires infantile est une maladie du foie pédiatrique rare avec de graves complications médicales 4,5,6,7, 8,9,10, mais la pathogénie et l'étiologie de l'atrésie des voies biliaires sont en grande partie inconnus 4. Les patients présentant une atrésie des voies biliaires meurent dans les deux ans après la naissance, sauf si une intervention chirurgicale (procédure Kasai) est effectuée 5. Par la suite, ces patients ont besoin d'une vaste prise en charge clinique et souvent une transplantation du foie 6. De nombreuses théories de l'atrésie des voies biliaires étiopathogenèse ont été proposées, telles que l'infection virale, une malformation congénitale, maladie auto-immune, et insulte toxique. Toutefois, la contribution de chacun à l'élaboration d'atrésie des voies biliaires restent peu concluantes 7,8,9,10.
Contrairement nourrissons qui souffrent atrésie des voies biliaires pathologique, la lamproie marine subir de développement programmé atrésie des voies biliaires sans necroinflammation vaste, fibrose ou de cirrhose 10. Les animaux peuvent souffrir cholestase transitoire pendant ce processus 10, mais s'adapter à cet état de développementpar l'intermédiaire de la synthèse de novo et de la sécrétion de sels biliaires dans l'intestin après l'atrésie biliaire développementale, en plus des mécanismes connus tels que la réduction de la synthèse des sels biliaires dans le foie 11. Ce processus de développement dans la grande lamproie marine fournit la seule occasion connue pour examiner la progression de l'atrésie des voies biliaires.
Une méthode nouvellement développé appelé «clarté» permet imagerie à haute résolution dans les systèmes nerveux des mammifères complexes en transformant tissu intact dans un hydrogel nanoporeux optiquement transparent 12. Utilisation de la lamproie marine foie et un protocole de CLARITY modifié, l'imagerie des tissus intacts de la dégénérescence biliaire peut être documentée tout au long de la métamorphose du foie.
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Protocol
Une. Préparation Solution
- Faire une L 10x 0,1 M de solution saline tamponnée au phosphate (PBS, pH 7,4): Peser 26,2 g de phosphate de sodium (monobasique), 115 g de phosphate de sodium (dibasique), et 87,66 g de NaCl. Dissoudre dans environ 800 ml de H 2 O distillée, ajuster le pH, et porter le volume à 1 L avec de l'eau distillée 2 O.
- Faire une solution saline L 0,1 M de tampon phosphate (pH 7,4): Prendre 100 ml 10x PBS et ajouter 900 ml de H 2 O. distillée
- Assurez 1 L 0,1 M de tampon phosphate salin (pH 7,4) avec 0,1% de Triton X-100: Prendre 100 ml 10x PBS, ajouter 1 ml de Triton X-100, et porter le volume à 1 L avec de l'eau distillée 2 O.
- Assurez 1 L 10x 0,1 M tampon phosphate (PB, pH 7,4): Peser 26,2 g de phosphate de sodium (monobasique) et 115 g de phosphate de sodium (dibasique). Dissoudre dans environ 800 ml de H 2 O distillée, ajuster le pH, et porter le volume à 1 L avec de l'eau distillée 2 O.
- Assurez 1 L 0,1 M de tampon phosphate (pH 7,4): Prendre 100 ml 10x PB,et ajouter 900 ml d'eau distillée H 2 O.
- Assurez 1 L 0,1 M de tampon phosphate (pH 7,4) avec 0,1% de Triton X-100: Prendre 100 ml 10x PB, ajouter 1 ml de Triton X-100, et porter le volume à 1 L avec de l'eau distillée 2 O.
- Ajoutez la solution de monomère d'hydrogel de 400 ml (4% d'acrylamide, 0,25% de bis-acrylamide, du paraformaldéhyde 4%, 0,0075% de persulfate d'ammonium, 0,0005% de saponine dans du PBS 0,1 M): Peser 0,3 g de persulfate d'ammonium et 0,2 g de saponine. Ajouter 210 ml de H 2 O distillée, 40 ml 40% d'acrylamide, 10 ml 2% de bis-acrylamide, 40 ml 10x PBS (pH 7,4), 100 ml 16% de paraformaldéhyde, et bien mélanger.
- Préparer une solution de compensation de 4 L (4% de SDS dans 0,2 M d'acide borique): Peser 49,464 g d'acide borique et 160 g de SDS. Dissoudre dans environ 3,5 L H 2 O distillée, ajuster le pH à 8,5 avec NaOH, et porter le volume à 4 L.
- Assurez 1 L solution de glycérol à 80%: Mesurer 800 ml de glycérol, ajouter 200 ml de H 2 O distillée, et bien mélanger.
2. Préparation des tissus
- Préparer la solution de monomère d'hydrogel et aliquote de 10 ml de chaque tube de centrifugation de 15 ml.
- On dissèque le tissu et fixer l'ensemble dans l'hydrogel pendant 2 jours à 4 ° C. Assurez-vous que la solution d'hydrogel est d'au moins 10 fois le volume du tissu.
- Amener le tissu fixé d'hydrogel (dans le tube de centrifugation de 15 ml) à une hotte de laboratoire.
- Polymériser l'hydrogel tissu fixé en ajoutant 5 pi de TEMED, bien mélanger et laisser reposer dans la hotte à température ambiante pendant 2-3 heures.
- Retirer soigneusement le gel excès. Remarque: gel supplémentaire sera entraver le processus de compensation et de la pénétration d'anticorps pendant la coloration.
- Incuber le tissu fixé dans 10 ml de solution de compensation dans un shaker incubateur réglé à 70 tours par minute et 50 ° C pendant plusieurs jours jusqu'à ce que le tissu devient transparent. Changer solution de compensation au moins une fois par jour et enlever le gel en excès du tissu lors du changement de la solution de compensation.
- Rincer le tissu dans 10 ml de 0,1 M de PB avec 0,1% de Triton X-100 à 70 rh et à 37 ° C pendant une nuit. Répéter cette étape trois fois, et enlever le gel en excès du tissu lors du changement de la solution tampon.
- Faire incuber le tissu clarifié dans la solution d'anticorps primaire dans PB avec 0,1% de Triton X-100 à 70 rpm et 37 ° C pendant 2 jours. Remarque: solution suffisamment d'anticorps primaire pour submerger les tissus.
- Rincer le tissu dans 10 ml de PB avec 0,1% de Triton X-100 à 70 rpm et 37 ° C pendant une nuit. Répéter cette étape trois fois, et enlever le gel en excès du tissu lors du changement de la solution tampon.
- Effectuez les étapes suivantes dans une pièce sombre ou en faible lumière. Couvrir les échantillons de papier d'aluminium pour éviter photoblanchiment.
- Faire incuber le tissu avec la solution clarifiée fluorescent de l'anticorps secondaire en PB avec 0,1% de Triton X-100 et le sérum de blocage 70 tours par minute et à 37 ° C pendant 1 jour.
- Rincer le tissu dans 10 ml de PB avec 0,1% de Triton X-100 à 70 rpm et 37 ° C pendant une nuit. Répétez cette étape 3 fois et enlever le gel excès felon le tissu lors du changement de la solution tampon.
- Rincer le tissu dans 10 ml de PBS à 70 rpm et 37 ° C pendant une nuit. Répéter cette étape trois fois, et enlever le gel en excès du tissu lors du changement de la solution tampon.
- Faire incuber le tissu clarifié dans 80% de glycerol à 70 rpm et 37 ° C pendant une nuit.
- Stocker le tissu teinté fluorescente à 4 ° C avant la microscopie confocale.
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Representative Results
Plusieurs événements importants se produisent dans le développement du système hépatobiliaire au cours de la lamproie marine métamorphose. La voie biliaire et de la vésicule biliaire et subissent une apoptose dégénérée (Figure 1). La combinaison de la méthode de clarification modifié et coloration au foie marqueur de cellules cytokératine 19 (CK19, présents dans les deux cholangiocytes et les hépatocytes avant et après la métamorphose 13) et Bcl2 marqueur anti-apoptotiques en utilisant la microscopie confocale, l'ensemble du système biliaire a été capturée le long de l'axe Z ( la figure 2) et la structure en 3 dimensions a été reconstruit (figure 3). Le balayage laser microscopie confocale a été utilisée pour effectuer l'article optique par le foie intact puisque la majeure partie du système biliaire est noyée à l'intérieur du foie à l'exception de la jonction où la voie biliaire pénètre dans l'intestin. Le processus dégénératif se fait par étapes métamorphiques 2-4, à partir de périphériques de petites voies biliaires vers la grande intrahep centralsystématique canal cholédoque (figure 2), en accord avec des études antérieures 10.
Figure 1. Gall dégénérescence de la vessie pendant la lamproie marine métamorphose. Lamproie marine perdre la vésicule biliaire (flèches noires) pendant la métamorphose. Les échantillons ont été prélevés sur les animaux à la morphologie externe entre phases métamorphiques 2 et 3, c'est à dire œil rond sans (étape 2) ou avec (étape 3) de forte différenciation de l'iris et de la pupille, les projections de la papille comme importants sur la surface dorsale interne de l'oral capot (deux étapes), les lèvres de capuchon oral (stade 2) formant une entrée rectangulaire dans la cavité buccale (étape 3), ou museau "pug-like" (étape 3) 3 épaissie. A noter que la vésicule biliaire a également changé de couleur en indiquant les différences dans la production de bile.I: intestin. L:. Foie S'il vous plaît cliquer ici pour voir une version plus grande de cette figure.
Figure 2. Des images confocale montrant l'arbre biliaire dans le foie de la lamproie marine pendant la métamorphose. Les échantillons ont été prélevés sur les animaux à la morphologie externe entre phases métamorphiques 2 et 3. Top panneaux sont prises à partir de la partie antérieure, et les panneaux inférieurs de l'extrémité postérieure. Images du marqueur cellulaire hépatique cytokératine 19 (1:100 souris anti-CK19; colorés avec 2 ug / ml Alexa Fluor 350 de chèvre anti-IgG de souris, bleu) et le marqueur anti-apoptotique Bcl-2 (1:100 lapin anti- Bcl2, colorées avec 2 pg / ml Alexa Fluor 488-âne-IgG anti-lapin; vert) sont superposées pour générer les images fusionnées. Les flèches blanches indiquent la barbre iliary. Les flèches noires indiquent la dendritique obscurité à la recherche des cellules apoptotiques et canalicules et ductules dans le foie environnante. I: intestin. L: foie. Barre d'échelle:. 500 um S'il vous plaît cliquer ici pour voir une version plus grande de cette figure.
Figure 3. Des images 3D reconstruites à partir confocale fusionnée z-série. 3D images ont été reconstruites à partir de la z-série confocale de trois foies entre les stades métamorphiques 2 et 3. Sections optiques des images fusionnées de foie marqueur de cellules cytokératine 19 (1:100 de souris- anti-CK19; souillé avec 2 ug / ml Alexa Fluor 350 de chèvre anti-IgG de souris, bleu) et le marqueur anti-apoptotique Bcl-2 (1:100 lapin anti-Bcl2, colorées avec 2 pg / ml d'Alexa Fluor 488-âne anti-IgG de lapin; vert) sont reconstruits avec le logiciel du fabricant pour produire des images 3D. Les panneaux supérieurs sont extraits de la partie antérieure, et les panneaux inférieurs de l'extrémité postérieure. Les flèches blanches indiquent l'arbre biliaire. Les flèches noires indiquent la dendritique obscurité à la recherche des cellules apoptotiques et canalicules et ductules dans le foie environnante. I: intestin. L: foie. Barre d'échelle:. 500 um S'il vous plaît cliquer ici pour voir une version plus grande de cette figure.
.. Figure 4 de la section optique confocal montrant des voies biliaires avec des gouttelettes biliaires dans la lumière image fusionnée à partir de 3 canaux fluorescentes; bleu: souris anti-c-Myc (1:100) / 2 pg / ml Alexa Fluor 350 de chèvre anti-IgG de souris; vert: 2 pg / ml Nissl vert; Rouge: Lapin anti-TGFβRII (1:100) / 2 pg / ml Alexa Fluor 594-âne anti-lapin. Barre d'échelle: 500 um. gouttelettes biliaires sont indiquées par des flèches noires. Le spécimen de foie a été prise entre le stade métamorphique 2 et 3. S'il vous plaît cliquer ici pour voir une version plus grande de cette figure.
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Discussion
Ce protocole est modifié à partir d'une nouvelle méthode appelée «clarté» 12, qui réticule tissu intact avec polyacrylamide pour former un hydrogel nanoporeux, puis supprime le membrane plasmique des tissus pour assurer la transparence optique et la perméabilité macromoléculaire. «Clarté» permet l'imagerie des tissus intacts de projection à long terme et le câblage du circuit local dans le système nerveux. Cette nouvelle méthode peut être utilisée pour visualiser l'ensemble du système biliaire dans la grande lamproie marine foie pendant la métamorphose. C'est un défi en biologie pour obtenir des informations à haute résolution et de maintenir la perspective globale d'un système complexe comme l'ensemble du système biliaire ou du système nerveux central en utilisant l'incorporation classique et sectionnement méthodes. Cette méthode permet de CLARTE modifié d'un faisceau laser de pénétrer à travers la mer lamproie foie larvaire intact jusqu'à une épaisseur de 1 à 2 mm à l'aide d'objectif fluorescent de faible puissance (4x) dans un confoca régulière de balayage à laserl microscope. Pénétration plus profonde peut être réalisé en utilisant un multi-photons microscope confocal plus avancé. Des images tridimensionnelles peuvent être reconstruites en utilisant un logiciel de reconstruction 3D. Atteindre des résultats comparables en utilisant des méthodes conventionnelles serait laborieux, impliquant la reconstruction fragmentaire de plusieurs sections, et serait limitée à de petits volumes de tissus. Cette nouvelle méthode fournit des informations précieuses à partir des analyses structurales des systèmes entiers intacts 12, moins de main-d'œuvre, plus efficace et reproductible.
Un autre avantage de ce nouveau procédé est que l'échantillon peuvent être réutilisés plusieurs fois pour la coloration avec des anticorps différents 12. Cela rend la comparaison entre les différents marqueurs moléculaires dans le même spécimen plus fiable et reproductible. Le cadre stable généré par hydrogel permet une élimination efficace des anticorps sans fin endommager la structure et maintient l'antigénicité de lotemps ng 12. La solution de compensation dénature anticorps et perturbe la liaison, donc agissant comme une solution d'anticorps de décapage 12. Plusieurs cycles de coloration ont été réalisées dans les échantillons de foie de lamproie marine et la structure et la coloration resté optimale.
Il ya deux modifications majeures de ce protocole de la "clarté" protocole original 12. (1) des réactifs générateurs de radicaux libres (persulfate d'ammonium et le TEMED) ont été utilisés pour initier et accélérer la polymérisation de l'hydrogel, au lieu de VA044. VA044 est photosensible et n'est pas disponible aux États-Unis (2) Pas de chambre d'électrophorèse sur mesure est utilisé. Dans le procédé de CLARTE 12, en raison de la taille des tissus (cerveau de la souris contre la lamproie foie), la compensation de tissu électrophorétique est requis pour accélérer l'extraction de la membrane plasmique. Pour éviter le coût initial pour une chambre d'électrophorèse sur mesure, nous avons d'abord exipiquer dispositifs d'électrophorèse sur gel d'agarose dans notre laboratoire. Cela s'est avéré être très inefficace. Cependant, l'incubation dans la solution de clarification avec la température (50 ° C) est très efficace dans l'élimination de la membrane plasmique.
Bien que les auteurs de "clarté" mis en garde contre l'utilisation de la saponine dans l'hydrogel, il améliore la transparence dans le tissu de la lamproie marine dans notre procédure. Un inconvénient pour l'imagerie confocale est que le tissu de la lamproie marine a auto-fluorescence forte. Le choix des fluorophores doit être testée en comparant les images avant et après la coloration par immunofluorescence.
Au cours de la lamproie marine métamorphose, la régression de l'épithélium de la vésicule biliaire commence entre les stades métamorphiques 2 et 3. Par étape métamorphique 4, la vésicule biliaire disparaît entièrement de la lamproie marine foie 14. dégénérescence des voies biliaires est le plus dramatic entre les stades métamorphiques 3 et 4 15. Cette méthode modifiée est un outil puissant pour étudier les mécanismes cellulaires et moléculaires de la dégénérescence de l'ensemble du système biliaire, ce qui peut donner un aperçu de l'atrésie biliaire humaine.
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Disclosures
Les auteurs n'ont rien à révéler.
Acknowledgments
Les auteurs reconnaissent la contribution de la Station biologique de Hammond Bay, Great Lakes Science Center, US Geological Survey. Nous remercions également le Dr Melinda cadre au Centre de microscopie avancée à l'Université d'État du Michigan pour son soutien technique à balayage laser microscopie confocale. Cette étude est financée par des subventions de la Commission des pêcheries des Grands Lacs à YWCD et WML.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 40% acrylamide | Bio-Rad | 161-0140 | |
| 2% bis-acrylamide | Bio-Rad | 161-0142 | |
| TEMED | Bio-Rad | 161-0800 | |
| ammonium persulfate | Sigma | A3678-25G | |
| boric acid | Sigma | B7901-1KG | |
| saponin | Sigma | 47036 | |
| sodium dodecyl sulfate | Sigma | L337-500G | |
| sodium phosphate (monobasic) | Sigma | 04269-1KG | |
| sodium phosphate (dibasic) | Sigma | S5136-1KG | |
| Triton X-100 | Sigma | X100-500ML | |
| glycerol | Sigma | G9012-500ML | |
| 16% paraformaldehyde | Electron Microscopy Sciences | 15710-S | |
| NaOH pellets | EMD | SX0590-3 | |
| 15 ml centrifuge tubes | Any brand | ||
| dissecting tools | Any brand |
References
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