Summary
צמד ים הים לאבד את כיס מרה ודרכי מרה במטמורפוזה, תהליך דומה לatresia מרה האנושי. קיבעון חדש ושיטת הבהרה (CLARITY) שונה כדי להמחיש את עץ המרה כולו באמצעות מיקרוסקופיה confocal סריקת לייזר. שיטה זו מספקת כלי רב עוצמה כדי לחקור ניוון מרה.
Abstract
atresia מרה הוא מחלה נדירה של ינקות, עם 1 ב15,000 תדירות מוערכת בארצות הברית דרום מזרח, אך נפוצה יותר במדינות מזרח אסיה, עם תדירות מדווחת של 1 ב5,000 בטייוואן. למרות שהרבה ידוע על ניהול atresia מרה, פתוגנזה שלה היא עדיין חמקמקה. צמד ים הים (מרינוס Petromyzon) מספק הזדמנות ייחודית לבחון את המנגנון והתקדמות של ניוון מרה. צמד ים הים לפתח דרך שלושה שלבי חיים שונים: זחל, טפיל, ומבוגרים. במהלך המעבר מזחלים לנוער טפיל, צמד ים הים עובר מטמורפוזה עם ארגון מחדש דרמטי ושיפוץ במורפולוגיה חיצונית ואיברים פנימיים. בכבד, מערכת המרה כולו הולכת לאיבוד, ובם כיס המרה ועץ המרה. שיטה חדשה שפותחה בשם "בהירות" שונה כדי להבהיר את כל הכבד והצומת עם המעי בצמד ים ים מותמרים.התהליך של ניוון מרה היה דמיינו ולהבחין במטמורפוזה צמד ים ים באמצעות מיקרוסקופיה confocal סריקת לייזר. שיטה זו מספקת כלי רב עוצמה כדי לחקור atresia מרה במודל של בעלי חיים ייחודיים.
Introduction
צמד ים ים לפתח דרך שלושה שלבי חיים שונים 1,2. צמד ים הזחל ים (L) מבלה את רוב הזמן במחילות כמו מתקני האכלת מסנן של קרקעית ים. לאחר שעובר שבעה שלבים מותמרים של שינויים דרמטיים במורפולוגיה וארגון מחדש באיברים פנימיים 3 חיצוניים, וכתוצאה מכך בני הנוער (JV) להיכנס לשלב טפיל שבמהלכו הם ניזונים דם ונוזלי רקמה מדג מארח, להגדיל את מסת הגוף יותר מ 100 פעמים . לאחר 1.0-1.5 שנות האכלה על דגי המארח בים או אגמים גדולים, מבוגרים להפסיק האכלה בתחילת האביב ונודדים לתוך נהרות כדי להשריץ ואז למות 1,2.
במהלך המטמורפוזה, כבד צמד ים הים מאבד את כיס מרה ועץ המרה כולו, פנוטיפ מוטנטי אבולוציוני המחקה את atresia המרה מחלת תינוק האנושי. atresia מרה תינוקות הוא מחלת כבד נדירה בילדים עם סיבוכים רפואיים קשים 4,5,6,7, 8,9,10, לעומת זאת פתוגנזה ואטיולוגיה של atresia המרה אינן ידועות ברוב 4. חולים עם אטרזיה המרה למות בתוך שנתיים לאחר לידה, אלא אם כן התערבות כירורגית (הליך קסאי) מתבצעת 5. כתוצאה מכך, חולים אלה מחייבים ניהול נרחב קליני ולעתים קרובות השתלה כבד 6. תאוריות של etiopathogenesis atresia מרה רבות הוצעו, כגון זיהום ויראלי, מומים מולדים, מחלות אוטואימוניות, ועלבון רעיל. עם זאת, תרומתו של כל לפיתוחה של atresia המרה נשארת חד משמעית 7,8,9,10.
בניגוד לתינוקות שסובלים atresia המרה פתולוגי, צמד ים הים לעבור בחינה התפתחותית מתוכנת atresia מרה ללא necroinflammation נרחב, סיסטיק או שחמת 10. בעלי החיים עלולים לסבול cholestasis חולפת במהלך תהליך זה 10, אבל להסתגל למצב ההתפתחותי הזהבאמצעות דה נובו סינתזה והפרשה של מלחי מרה במעי לאחר atresia מרה התפתחותי, בנוסף למנגנונים ידועים כגון הפחתה של סינתזת מלח מרה בכבד 11. תהליך התפתחותי זה בצמד ים ים מספק את ההזדמנות היחידה הידועה כדי לבחון את ההתקדמות של atresia מרה.
שיטה חדשה שפותחה בשם "בהירות" מאפשרת הדמיה ברזולוציה גבוהה במערכות עצבים של יונקים מורכבים על ידי הפיכת רקמות שלמות להידרוג'ל nanoporous השקוף אופטי 12. שימוש בכבד צמד ים ים ופרוטוקול CLARITY שונה, הדמיה בשלמות רקמות של ניוון מרה יכולה להיות מתועדת לאורך המטמורפוזה כבד.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. פתרון הכנה
- הפוך L 1 10x 0.1 M חיץ מלוח פוספט (PBS, pH 7.4): לשקול 26.2 פוספט נתרן g (monobasic), 115 פוספט נתרן g (dibasic), ו87.66 NaCl גרם. ממיסים בכ -800 מיליליטר מזוקק H 2 O, להתאים את pH, ולהעלות את עוצמת הקול ל1 ליטר עם מזוקקי H 2 O.
- הפוך מלוח 1 L 0.1 M חיץ פוספט (pH 7.4): קח 100 מיליליטר 10x PBS, ולהוסיף 900 מיליליטר מזוקק H 2 O.
- הפוך מלוח 1 L 0.1 M חיץ פוספט (pH 7.4) עם 0.1% טריטון X-100: קח 100 מיליליטר 10x PBS, להוסיף 1 מיליליטר טריטון X-100, ולהביא את הנפח של עד 1 ליטר עם מזוקקי H 2 O.
- הפוך חיץ L 1 0.1M 10x פוספט (PB, pH 7.4): לשקול 26.2 פוספט נתרן g (monobasic) ו115 פוספט נתרן g (dibasic). ממיסים בכ -800 מיליליטר מזוקק H 2 O, להתאים את pH, ולהעלות את עוצמת הקול ל1 ליטר עם מזוקקי H 2 O.
- הפוך 1 L 0.1 M חיץ פוספט (pH 7.4): קח 100 מיליליטר PB 10x,ולהוסיף 900 מיליליטר מזוקק H 2 O.
- הפוך 1 L 0.1 M חיץ פוספט (pH 7.4) עם 0.1% טריטון X-100: קח 100 PB 10x מיליליטר, להוסיף 1 מיליליטר טריטון X-100, ולהביא את הנפח של עד 1 ליטר עם מזוקקי H 2 O.
- הפוך פתרון מונומר הידרוג'ל 400 מיליליטר (acrylamide 4%, 0.25% bis-acrylamide, paraformaldehyde 4%, 0.0075% persulfate אמוניום, saponin 0.0005% ב0.1 M PBS): לשקול 0.3 persulfate אמוניום גרם ו0.2 saponin גרם. הוספת 210 מיליליטר מזוקק H 2 O, acrylamide 40 מיליליטר 40%, 10 מיליליטר 2% bis-acrylamide, 40 מיליליטר 10x PBS (pH 7.4), 100 מיליליטר paraformaldehyde 16%, ומערבבים היטב.
- הפוך פתרון 4 L סליקה (4% SDS בחומצה בור 0.2 ז): לשקול 49.464 חומצה בור גרם ו160 גרם SDS. ממיסים בH על 3.5 L מזוקק 2 O, כדי להתאים את pH 8.5 עם NaOH, ולהביא את הנפח עד 4 L.
- הפוך פתרון גליצרול 80% L 1: מדוד גליצרול 800 מיליליטר, להוסיף 200 מיליליטר מזוקק H 2 O, ומערבבים היטב.
2. הכנת רקמה
- הכן פתרון הידרוג'ל מונומר וaliquot 10 מיליליטר לכל צינור צנטריפוגות 15 מיליליטר.
- לנתח את כל הרקמות ולתקן בהידרוג'ל ל2 ימים ב 4 ° C. ודא כי פתרון הידרוג'ל הוא לפחות 10x הנפח של הרקמה.
- תביא את רקמות הידרוג'ל הקבועים (בצינור צנטריפוגות 15 מיליליטר) למכסת מנוע קטר.
- פלמר הרקמות קבועות הידרוג'ל ידי הוספת 5 μl TEMED, לערבב היטב, ולתת לשבת במנדף בטמפרטורת חדר למשך 2-3 שעות.
- הסר את הג'ל העודף ביסודיות. הערה: ג'ל במיוחד יהיה לעכב את תהליך הסליקה וחדירת הנוגדנים במהלך מכתים.
- דגירה הרקמות קבועות ב10 מיליליטר ניקוי פתרון שבייקר אינקובטור נקבעו על 70 סל"ד ו50 מעלות צלזיוס במשך כמה ימים עד שהרקמה הופכת שקופה. שינוי פתרון ניקוי לפחות פעם ביום ולהסיר את הג'ל העודף מהרקמות כאשר משנה את פתרון הסליקה.
- יש לשטוף את הרקמה ב10 מיליליטר 0.1 M PB עם 0.1% טריטון X-100 ב70 rבערב, ו37 ° C במשך לילה. חזור על פעולה זו 3 פעמים ולהסיר את הג'ל העודף מהרקמות כאשר משנה את פתרון החיץ.
- דגירה הרקמה הבהירה בפתרון הנוגדן הראשוני בPB עם 0.1% טריטון X-100 ב70 סל"ד ו37 מעלות צלזיוס למשך 2 ימים. שים לב: להפוך את פתרון נוגדן ראשוני מספיק כדי להטביע את כל הרקמות.
- יש לשטוף את הרקמה ב10 PB מיליליטר עם 0.1% טריטון X-100 ב70 סל"ד ו37 מעלות צלזיוס למשך לילה. חזור על פעולה זו 3 פעמים ולהסיר את הג'ל העודף מהרקמות כאשר משנה את פתרון החיץ.
- בצע את השלבים הבאים בחדר חשוך או תחת אור עמום. כסה את הדגימות עם נייר כסף כדי למנוע הלבנת צילום.
- דגירה הרקמה הבהירה עם פתרון הניאון המשני נוגדנים בPB עם 0.1% טריטון X-100 וסרום החסימה ב70 סל"ד ו37 מעלות צלזיוס במשך יום 1.
- יש לשטוף את הרקמה ב10 PB מיליליטר עם 0.1% טריטון X-100 ב70 סל"ד ו37 מעלות צלזיוס למשך לילה. חזור על פעולה זו 3 פעמים ולהסיר את f ג'ל העודפתrom הרקמה בעת שינוי פתרון החיץ.
- יש לשטוף את הרקמה ב10 מיליליטר PBS ב70 סל"ד ו37 מעלות צלזיוס למשך לילה. חזור על פעולה זו 3 פעמים ולהסיר את הג'ל העודף מהרקמות כאשר משנה את פתרון החיץ.
- דגירה הרקמה הבהירה בגליצרול 80% ב70 סל"ד ו37 לילה מעלות צלזיוס.
- אחסן את הרקמה הצבעונית הניאון על 4 מעלות צלזיוס לפני מיקרוסקופיה confocal.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
אירועים התפתחותיים חשובים כמה להתרחש במערכת של כיס המרה במהלך המטמורפוזה צמד ים לים. צינור המרה וכיס המרה עוברים אפופטוזיס ומנוון (איור 1). שילוב של שיטת ההבהרה שונה וצביעה עם cytokeratin כבד סמן תא 19 (CK19, בהווה בשני cholangiocytes וhepatocytes לפני ואחרי מטמורפוזה 13) וBCL2 סמן אנטי אפופטוטיים באמצעות מיקרוסקופיה confocal, מערכת המרה כולו נתפסה לאורך ציר ה-Z ( איור 2) והמבנה 3 ממדים שוחזר (איור 3). מיקרוסקופיה confocal סריקת לייזר שימשה לביצוע סעיף אופטי דרך כבד ללא פגע מאז ביותר של מערכת המרה מוטבעת בתוך הכבד, פרט לצומת שבו צינור המרה נכנס למעי. תהליך ניווניות מתרחש בשלבים מותמרים 2-4, החל מductules המרה הקטן ההיקפי לכיוון intrahep המרכזי הגדולATIC צינור מרה משותף (איור 2), עולה בקנה אחד עם מחקרים קודמים 10.
איור 1. ניוון כיס המרה במהלך המטמורפוזה צמד ים ים. צמד ים הים לאבד את כיס המרה (חיצים שחורים) במטמורפוזה. הדגימות נלקחו מבעלי חיים עם מורפולוגיה חיצונית בין שלבים מותמרים 2 ו -3, כלומר עין עגולה בלי (שלב 2), או (שלב 3) הבחנה חדה של קשתית ואישון, כמו תחזיות פטמית-בולטות על פני השטח הגבי הפנימיים של הפה מכסה המנוע (שני השלבים), מעובה שפות של מכסה המנוע אוראלי (שלב 2) ויוצרים פתח מלבני לתוך חלל הפה (שלב 3), או חוטם "כמו פאג" (שלב 3) 3. שים לב כי בכיס המרה גם שינה את הצבעים המציינים הבדלים בייצור מיצי מרה.אני: מעי. L:. כבד אנא לחץ כאן כדי לצפות בגרסה גדולה יותר של דמות זו.
איור 2. תמונות confocal מראה את עץ המרה בכבד צמד ים הים במהלך מטמורפוזה. הדגימות נלקחו מבעלי חיים עם מורפולוגיה חיצונית בין שלבים מותמרים 2 ו -3. פנלים למעלה לקוחים מקדמיים, והלוחות הנמוכים מהקצה האחורי. תמונות של cytokeratin כבד סמן תא 19 (1:100 עכבר אנטי CK19; מוכתמת ב2 מיקרוגרם / מיליליטר Alexa פלואוריד 350 העז נגד העכבר IgG; כחול) והסמן אנטי אפופטוטיים BCL2 (1:100 ארנבת אנטי BCL2; מוכתם עם 2 מיקרוגרם / IgG 488-חמור נגד ארנב מיליליטר Alexa פלואוריד; ירוק) הם על גבי מנת ליצור את התמונות הממוזגות. חצים לבנים מצביעים בעץ iliary. חיצים שחורים מצביעים הדנדריטים הכהה מחפשים תאים אפופטוטיים והסביבה canaliculi וductules בכבד. אני: מעי. L: כבד. בר סולם:. 500 מיקרומטר אנא לחץ כאן כדי לצפות בגרסה גדולה יותר של דמות זו.
איור 3. תמונות 3D שחזרו מסדרת Z-confocal ממוזג. תמונות 3D שוחזרו מסדרת Z-confocal של שלושה כבדים בין שלבים מותמרים 2 ו -3. סעיפים אופטיים של תמונות הממוזגות של cytokeratin סמן תא הכבד 19 (1:100 עכבר אנטי CK19; מוכתם ב2 מיקרוגרם / מיליליטר Alexa פלואוריד 350 העז נגד העכבר IgG; כחול) וסמן אנטי אפופטוטיים BCL2 (1:100 ארנב נגד BCL2; מוכתם ב2 מיקרוגרם / מיליליטר Alexa פלואוריד 488-חמור אנטי-ארנב IgG; ירוק) משוחזרים עם התוכנה של היצרן כדי ליצור תמונות 3D. לוחות למעלה לקוחים מקדמיים, ולוחות הנמוכים מהקצה האחורי. חצים לבנים מצביעים על עץ המרה. חיצים שחורים מצביעים הדנדריטים הכהה מחפשים תאים אפופטוטיים והסביבה canaliculi וductules בכבד. אני: מעי. L: כבד. בר סולם:. 500 מיקרומטר אנא לחץ כאן כדי לצפות בגרסה גדולה יותר של דמות זו.
תמונת איור 4 סעיף אופטי confocal מראה דרך מרה עם טיפות מרה בלומן ממוזגת מ3 ערוצי ניאון..; כחול: עכבר אנטי-c-Myc (1:100) / 2 מיקרוגרם / מיליליטר Alexa פלואוריד 350 העז נגד עכבר IgG; ירוק: ירוק Nissl 2 מיקרוגרם / מיליליטר; אדום: ארנב נגד TGFβRII (1:100) / 2 מיקרוגרם / 594-חמור נגד ארנב אלקסה פלואוריד מיליליטר. סרגל קנה מידה: 500 מיקרומטר. טיפות מרה מסומנות על ידי חצים שחורים. דגימת הכבד נלקחה בין שלב מותמרים 2 ו -3. אנא לחץ כאן כדי לצפות בגרסה גדולה יותר של דמות זו.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
פרוטוקול זה הוא שונה משיטה חדשה הנקראת "בהירות" 12, שCrosslinks רקמות שלמות עם polyacrylamide כדי ליצור הידרוג'ל nanoporous, ולאחר מכן רצועות מן קרום הפלזמה של הרקמה כדי להשיג שקיפות אופטית וחדירות macromolecular. "בהירות" מאפשרת הדמיה בשלמות רקמות של השלכה ארוך טווח וחיווט במעגל מקומי במערכת העצבים. שיטה חדשה זו יכולה לשמש גם כדי להמחיש את מערכת המרה כולו בכבד צמד ים הים במהלך מטמורפוזה. זהו אתגר בביולוגיה כדי להשיג מידע ברזולוציה גבוהה ולשמור על הפרספקטיבה הגלובלית ממערכת מורכבת כמו מערכת המרה כולו או מערכת עצבים מרכזית באמצעות הטבעה קונבנציונלית וחתך שיטות. שיטת CLARITY שונה זה מאפשרת לקרן לייזר לחדור דרך כבד זחל צמד ים ים ללא פגע עד עובי של 1 עד 2 מ"מ באמצעות אובייקטיבי צריכת חשמל נמוכה ניאון (4x) בconfoca סריקת לייזר רגילמיקרוסקופ ליטר. חדירה עמוקה יותר יכולה להיות מושגת באמצעות מיקרוסקופ confocal רב פוטון מתקדם יותר. ניתן לשחזר תמונות תלת ממדיות באמצעות תוכנת שחזור 3D. השגת תוצאות דומות בשיטות מקובלות יהיה מייגע, הכולל את השיקום ההדרגתי של קטעים רבים, ויהיה מוגבלים לנפחי רקמה קטנים. שיטה חדשה זו מספקת מידע רב ערך מניתוחים מבניים שלמים של מערכות שלמות 12, הוא פחות עתיר עבודה, יעיל יותר לשחזור.
יתרון נוסף של שיטה חדשה זו הוא כי ניתן לעשות שימוש חוזר מספר רב של פעמים את הדגימה לצביעה עם נוגדנים שונים 12. זה הופך את ההשוואה בין סמנים מולקולריים השונים באותה הדגימה יותר אמינה לשחזור. המסגרת היציבה שנוצרה על ידי הידרוג'ל מאפשרת הסרה יעילה של נוגדנים ללא נזק למבנה דק ושומרת antigenicity עבור loזמן ng 12. פתרון הסליקה denatures נוגדנים ומשבשים המחייבים, ולכן מתנהג כמו פתרון הפשטת נוגדני 12. כמה סיבובים של צביעה בוצעו בדגימות כבד צמד ים ים ואת המבנה ומכתים נשארו אופטימליים.
ישנם שני שינויים עיקריים בפרוטוקול זה מהפרוטוקול המקורי "הבהירות" 12. (1) חומרים כימיים חינם רדיקליים מניב (persulfate אמוניום וTEMED) שימשו ליזום ולהאיץ את פילמור של הידרוג'ל במקום VA044. VA044 הוא רגיש ולא זמין בארצות הברית (2) לא קאמרי אלקטרופורזה שהותקן משמש. בשיטת CLARITY 12, בשל הגודל של הרקמות (מוח עכבר לעומת כבד צמד), נדרש סליקת רקמת electrophoretic לזרז את החילוץ של קרום הפלזמה. כדי להימנע מהעלות הראשונית לתא אלקטרופורזה שהותקן, השתמשנו exi הראשוןלעקוץ מכשירי ג'ל אלקטרופורזה agarose במעבדה שלנו. זה הוכיח את עצמו מאוד לא יעיל. עם זאת, דגירה בפתרון הסליקה עם טמפרטורה שהועלתה (50 מעלות צלזיוס) היא יעילה מאוד בניקוי קרום הפלזמה.
למרות המחברים ל" בהירות "הזהירו מפני השימוש בsaponin בהידרוג'ל, זה משפר את השקיפות ברקמת צמד ים הים בהליך שלנו. חסרון אחד להדמית confocal הוא שיש רקמת צמד ים ים הקרינה אוטומטית חזקה. הבחירה של fluorophores חייבת להיבדק על ידי השוואת התמונות לפני ואחרי צביעת immunofluorescent.
במהלך המטמורפוזה צמד ים ים, רגרסיה של האפיתל כיס המרה מתחילה בין שלבים מותמרים 2 ו -3. בשלב מותמרים 4, כיס המרה נעלמת לחלוטין מכבד צמד ים ים 14. ניוון צינור מרה הוא שרוב DRAMatic בין שלבים מותמרים 3 ו -4 15. שיטה שונה זו היא כלי רב עוצמה כדי לחקור את המנגנונים התאיים ומולקולריים של הניוון של מערכת המרה כולו, אשר עשוי לספק תובנות לatresia מרה אנושית.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
יש המחברים אין לחשוף.
Acknowledgments
המחברים מודים לתרומה של מפרץ המונד ביולוגי תחנה, אגמי מרכז מדע גדול, גיאולוגי אמריקאי. אנו מודים גם למסגרת ד"ר מלינדה במרכז למיקרוסקופי מתקדם באוניברסיטת מדינת מישיגן לתמיכה הטכנית שלה במיקרוסקופיה confocal סריקת לייזר. מחקר זה נתמך על ידי מענקים מוועדת דיג האגמים הגדולים לYWCD ו-WML.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 40% acrylamide | Bio-Rad | 161-0140 | |
| 2% bis-acrylamide | Bio-Rad | 161-0142 | |
| TEMED | Bio-Rad | 161-0800 | |
| ammonium persulfate | Sigma | A3678-25G | |
| boric acid | Sigma | B7901-1KG | |
| saponin | Sigma | 47036 | |
| sodium dodecyl sulfate | Sigma | L337-500G | |
| sodium phosphate (monobasic) | Sigma | 04269-1KG | |
| sodium phosphate (dibasic) | Sigma | S5136-1KG | |
| Triton X-100 | Sigma | X100-500ML | |
| glycerol | Sigma | G9012-500ML | |
| 16% paraformaldehyde | Electron Microscopy Sciences | 15710-S | |
| NaOH pellets | EMD | SX0590-3 | |
| 15 ml centrifuge tubes | Any brand | ||
| dissecting tools | Any brand |
References
- Applegate, V. C. Natural history of the sea lamprey (Petromyzon marinus) in Michigan. US Fish and Wildlife Service Special Science Report on Fishery Service. (55), (1950).
- Hardisty, M. W., Potter, I. C. The general biology of adult lampreys. The biology of lampreys. Hardisty, M. W., Potter, I. C. 1, New York Academic Press. 127-206 (1971).
- Youson, J. H., Potter, I. C. A description of the stages in the metamorphosis of the anadromous sea lamprey, Petromyzon marinus L. Can. J. Zool. 57, 1808-1817 (1979).
- Boomer, L. A., et al. Cholangiocyte apoptosis is an early event during induced metamorphosis in the sea lamprey, Petromyzon marinus L. J. Pediatr. Surg. 45, 114-120 (2010).
- Kasai, M., Suzuki, H., Ohashi, E., Ohi, R., Chiba, T., Okamoto, A. Technique and results of operative management of biliary atresia. World J. Surg. 2, 571-580 (1978).
- Suzuki, T., Hashimoto, T., Kondo, S., Sato, Y., Hussein, M. H. Evaluating patients’ outcome post-Kasai operation: a 19-year experience with modification of the hepatic portoenterostomy and applying a novel steroid therapy regimen. Pediatr. Surg. Int. 26, 825-830 (2010).
- Hartley, J. L., Davenport, M., Kelly, D. A. Biliary atresia. Lancet. 374, 1704-1713 (2009).
- Morecki, R., Glaser, J. H., Cho, S., Balistreri, W. F., Horwitz, M. S. Biliary atresia and reovirus type 3 infection. New Engl. J. Med. 307, 481-484 (1982).
- Shimadera, S., Iwai, N., Deguchi, E., Kimura, O., Fumino, S., Yokoyama, T. The inv mouse as an experimental model of biliary atresia. J. Pediatr. Surg. 42, 1555-1560 (2007).
- Sidon, E. W., Youson, J. H. Morphological changes in the liver of the sea lamprey, Petromyzon marinus L., during metamorphosis: I. Atresia of the bile ducts. J. Morphol. 177, 109-124 (1983).
- Yeh, C. -Y., Chung-Davidson, Y. -W., Wang, H., Li, K., Li, W. Intestinal synthesis and secretion of bile salts as an adaptation to developmental biliary atresia in the sea lamprey. Proc. Nat. Acad. Sci. U.S.A. 109, 11419-11424 (2012).
- Chung, K., et al. Structural and molecular interrogation of intact biological systems. Nature. 497, 332-337 (2013).
- Alarcón, V. B., Filosa, M. F., Youson, J. H. Cytokeratins in the liver of the sea lamprey (Petromyzon marinus) before and after metamorphosis. Cell Tissue Res. 287, 365-374 (1997).
- Youson, J. H., Ogilvie, D. R. Ultrastructural features of degeneration of the gallbladder during lamprey biliary atresia. Tissue and Cell. 22, 477-492 (1990).
- Morii, M., et al. Onset of apoptosis in the cystic duct during metamorphosis of a Japanese lamprey, Lethenteron reissneri. Anat. Rec. 293, 1155-1166 (2010).
