Summary
सागर एक प्रकार की मछली कायापलट दौरान पित्ताशय और पित्त नलिकाएं, मानव पित्त अविवरता लिए इसी तरह की एक प्रक्रिया खो देते हैं. एक नए निर्धारण और स्पष्टीकरण विधि (स्पष्टता) लेजर स्कैनिंग confocal माइक्रोस्कोपी का उपयोग पूरे पित्त पेड़ कल्पना करने के लिए संशोधित किया गया था. इस विधि पित्त अध: पतन का अध्ययन करने के लिए एक शक्तिशाली उपकरण प्रदान करता है.
Abstract
पित्त अविवरता ताइवान में 5000 में 1 की एक रिपोर्ट आवृत्ति के साथ एक अनुमान के अनुसार 1 15,000 में दक्षिण पूर्व संयुक्त राज्य अमेरिका में आवृत्ति, लेकिन पूर्वी एशियाई देशों में आम है, के साथ बचपन की एक दुर्लभ बीमारी है. ज्यादा पित्त अविवरता के प्रबंधन के बारे में जाना जाता है, अपनी रोगजनन अभी भी मायावी है. समुद्र एक प्रकार की मछली (Petromyzon Marinus) पित्त अध: पतन की व्यवस्था है और प्रगति की जांच के लिए एक अनूठा अवसर प्रदान करता है. लार्वा, परजीवी, और वयस्क: सागर एक प्रकार की मछली तीन अलग जीवन चरणों के माध्यम से विकसित करना. लार्वा से परजीवी किशोर के संक्रमण के दौरान, समुद्र एक प्रकार की मछली बाहरी आकारिकी और आंतरिक अंगों में नाटकीय पुनर्गठन और remodeling के साथ कायापलट गुजरना. जिगर में, पूरे पित्त प्रणाली पित्ताशय और पित्त पेड़ सहित, खो दिया है. "स्पष्टता" नामक एक नव विकसित विधि रूपांतरित समुद्र एक प्रकार की मछली में आंत के साथ पूरे जिगर और जंक्शन स्पष्ट करने के लिए संशोधित किया गया था.पित्त अध: पतन की प्रक्रिया लेजर स्कैनिंग confocal माइक्रोस्कोपी का उपयोग करके कल्पना और समुद्र एक प्रकार की मछली कायापलट दौरान discerned किया गया था. इस पद्धति का एक अनूठा पशु मॉडल में पित्त अविवरता अध्ययन करने के लिए एक शक्तिशाली उपकरण प्रदान करता है.
Introduction
सागर एक प्रकार की मछली तीन अलग जीवन के माध्यम से विकसित 1,2 चरणों. लार्वा समुद्र एक प्रकार की मछली (एल) benthic फिल्टर भक्षण के रूप में बिलों में सबसे अधिक समय खर्च करते हैं. बाहरी आकारिकी और आंतरिक अंगों 3 में पुनर्गठन में नाटकीय परिवर्तन के सात रूपांतरित चरणों से गुजरने के बाद, जिसके परिणामस्वरूप किशोरों (जेवी) बड़े पैमाने पर 100 से अधिक बार शरीर में वृद्धि, वे मेजबान मछली से रक्त और ऊतकों के तरल पदार्थ को खाते हैं, जिसके दौरान एक परजीवी चरण में प्रवेश . सागर या बड़ी झीलों में मेजबान मछली पर खिला 1.0-1.5 वर्षों के बाद, वयस्कों जल्दी वसंत ऋतु के दौरान खिला संघर्ष और अंडे के लिए नदियों में विस्थापित और फिर 1,2 मर जाते हैं.
कायापलट के दौरान, समुद्र एक प्रकार की मछली जिगर पित्ताशय और पूरे पित्त पेड़, मानव शिशु रोग पित्त अविवरता mimics कि एक विकासवादी उत्परिवर्ती phenotype खो देता है. शिशु पित्त अविवरता 4,5,6,7 गंभीर चिकित्सा जटिलताओं के साथ एक दुर्लभ बाल चिकित्सा जिगर की बीमारी है, 8,9,10, हालांकि पित्त अविवरता के रोगजनन और एटियलजि 4 काफी हद तक अनजान हैं. शल्य चिकित्सा हस्तक्षेप (Kasai प्रक्रिया) 5 किया जाता है जब तक कि पित्त अविवरता के साथ मरीजों को जन्म के बाद दो साल के भीतर मर जाते हैं. बाद में, इन रोगियों व्यापक नैदानिक प्रबंधन और अक्सर यकृत प्रत्यारोपण 6 की आवश्यकता होती है. पित्त अविवरता etiopathogenesis के कई सिद्धांतों ऐसे वायरल संक्रमण, जन्मजात विकृति, autoimmune रोग, और विषाक्त अपमान के रूप में प्रस्तावित किया गया है. हालांकि, पित्त अविवरता के विकास के लिए प्रत्येक का योगदान 7,8,9,10 अधूरी बनी हुई है.
रोग पित्त अविवरता भुगतना कि शिशुओं के विपरीत, समुद्र एक प्रकार की मछली developmentally व्यापक necroinflammation, फाइब्रोसिस या सिरोसिस 10 बिना पित्त अविवरता क्रमादेशित गुजरना. पशु इस प्रक्रिया 10 के दौरान क्षणिक पित्तस्थिरता पीड़ित है, लेकिन इस विकास के हालत के लिए अनुकूल हो सकता हैके माध्यम से नए सिरे से संश्लेषण और जिगर 11 में पित्त नमक संश्लेषण की कमी के रूप में जाना जाता तंत्र के अलावा विकास पित्त अविवरता, के बाद आंत में पित्त लवण का स्राव. समुद्र एक प्रकार की मछली में इस विकास प्रक्रिया पित्त अविवरता की प्रगति की जांच के लिए ही जाना जाता अवसर प्रदान करता है.
"स्पष्टता" नामक एक नव विकसित विधि एक ऑप्टिकली पारदर्शी nanoporous हाइड्रोजेल 12 में बरकरार ऊतक बदलने से जटिल स्तनधारी नर्वस सिस्टम में उच्च संकल्प इमेजिंग में सक्षम बनाता है. समुद्र एक प्रकार की मछली जिगर और एक संशोधित स्पष्टता प्रोटोकॉल का प्रयोग, पित्त अध: पतन का बरकरार ऊतक इमेजिंग जिगर कायापलट भर में प्रलेखित किया जा सकता है.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. समाधान तैयार
- 1 एल बनाओ 10x 0.1 एम फॉस्फेट बफर खारा (पीबीएस, 7.4 पीएच): 26.2 ग्राम सोडियम फास्फेट (समाक्षारीय), 115 ग्राम सोडियम फास्फेट (द्विक्षारकीय), और 87.66 छ NaCl वजन. लगभग 800 मिलीलीटर आसुत एच 2 में भंग हे, पीएच को समायोजित, और आसुत एच 2 ओ के साथ 1 एल मात्रा को लाने के
- 1 एल 0.1 एम फॉस्फेट बफर खारा (7.4 पीएच) बनाओ: 100 मिलीलीटर 10x पीबीएस ले लो, और 900 मिलीलीटर आसुत एच 2 ओ जोड़
- 100 मिलीलीटर 10x पीबीएस लो, 1 मिलीलीटर ट्राइटन X-100 जोड़ने, और आसुत एच 2 ओ के साथ 1 एल के लिए ऊपर मात्रा लाने: 1 एल 0.1 एम फॉस्फेट बफर खारा (7.4 पीएच) 0.1% ट्राइटन X-100 के साथ बनाओ
- 26.2 ग्राम सोडियम फास्फेट (समाक्षारीय) और 115 ग्राम सोडियम फास्फेट (द्विक्षारकीय) वजन: 1 एल 10x 0.1M फॉस्फेट बफर (पंजाब, 7.4 पीएच) बनाते हैं. लगभग 800 मिलीलीटर आसुत एच 2 में भंग हे, पीएच को समायोजित, और आसुत एच 2 ओ के साथ 1 एल मात्रा को लाने के
- 1 एल 0.1 एम फॉस्फेट बफर (7.4 पीएच) बनाओ: लो 100 मिलीलीटर 10x पंजाब,और एच 2 ओ आसुत 900 मिलीलीटर जोड़ने
- 0.1% ट्राइटन X-100 के साथ 1 एल 0.1 एम फॉस्फेट बफर (7.4 पीएच) बनाओ: 100 मिलीलीटर 10x पंजाब लो, 1 मिलीलीटर ट्राइटन X-100 जोड़ने, और आसुत एच 2 ओ के साथ 1 एल के लिए ऊपर मात्रा लाना
- 400 मिलीलीटर हाइड्रोजेल मोनोमर समाधान (4% acrylamide, 0.25% बीआईएस acrylamide, 4% paraformaldehyde, 0.0075% अमोनियम persulfate, 0.1 एम पीबीएस में 0.0005% सैपोनिन) बनाओ: 0.3 ग्राम अमोनियम persulfate और 0.2 ग्राम सैपोनिन वजन. 210 मिलीलीटर आसुत एच 2 जोड़ें हे, 40 एमएल 40% acrylamide, 10 मिलीलीटर 2% बीआईएस acrylamide, 40 एमएल 10x पीबीएस (7.4 पीएच), 100 एमएल 16% paraformaldehyde, और अच्छी तरह से मिश्रण.
- (0.2 एम बोरिक एसिड में 4% एसडीएस) 4 एल समाशोधन समाधान करें: एसडीएस जी 49.464 ग्राम बोरिक एसिड और 160 वजन. , के बारे में 3.5 एल आसुत एच 2 ओ में भंग NaOH के साथ 8.5 पीएच को समायोजित, और 4 एल को मात्रा को लाने के
- 1 एल 80% ग्लिसरॉल समाधान करें:, 800 मिलीलीटर ग्लिसरॉल उपाय 200 मिलीलीटर आसुत एच 2 हे जोड़ने के लिए, और अच्छी तरह से मिश्रण.
2. ऊतक तैयारी
- प्रत्येक 15 मिलीलीटर अपकेंद्रित्र ट्यूब हाइड्रोजेल मोनोमर समाधान और विभाज्य 10 मिलीलीटर की तैयारी.
- पूरे ऊतक काटना और 4 डिग्री सेल्सियस पर 2 दिनों के लिए हाइड्रोजेल में तय हाइड्रोजेल समाधान कम से कम 10x ऊतक की मात्रा है कि सुनिश्चित करें.
- एक धूआं हुड के लिए (15 मिलीलीटर अपकेंद्रित्र ट्यूब में) हाइड्रोजेल तय ऊतक लाओ.
- , TEMED 5 μl जोड़कर हाइड्रोजेल तय ऊतक भाजन मिश्रण अच्छी तरह से, और 2-3 घंटे के लिए कमरे के तापमान पर धूआं हुड में बैठते हैं.
- अच्छी तरह से अतिरिक्त जेल निकालें. नोट: अतिरिक्त जेल धुंधला दौरान समाशोधन प्रक्रिया और एंटीबॉडी प्रवेश में बाधा होगी.
- ऊतक पारदर्शी हो जाता है जब तक कई दिनों के लिए 70 rpm और 50 डिग्री सेल्सियस पर एक मशीन सेट प्रकार के बरतन में समाधान समाशोधन 10 मिलीलीटर में तय ऊतक सेते हैं. कम से कम एक बार प्रति दिन समाशोधन समाधान बदलें और समाशोधन समाधान बदलते जब ऊतक से अतिरिक्त जेल हटा दें.
- 70 आर में 0.1% ट्राइटन X-100 के साथ 10 मिलीलीटर 0.1 एम पंजाब में ऊतक कुल्लाPM और 37 डिग्री सेल्सियस रातोंरात. इस चरण 3 बार दोहराएँ और बफर समाधान बदलते जब ऊतक से अतिरिक्त जेल हटा दें.
- 2 दिनों के लिए 70 rpm और 37 डिग्री सेल्सियस पर 0.1% ट्राइटन X-100 के साथ पंजाब में प्राथमिक एंटीबॉडी समाधान में स्पष्ट किया ऊतक सेते हैं. नोट: पूरे ऊतक डूब पर्याप्त प्राथमिक एंटीबॉडी समाधान करें.
- रातोंरात 70 rpm और 37 डिग्री सेल्सियस पर 0.1% ट्राइटन X-100 के साथ 10 मिलीलीटर पंजाब में ऊतक कुल्ला. इस चरण 3 बार दोहराएँ और बफर समाधान बदलते जब ऊतक से अतिरिक्त जेल हटा दें.
- एक अंधेरे कमरे में या मंद रोशनी के नीचे निम्न चरणों का पालन. तस्वीर विरंजन रोकने के लिए पन्नी के साथ नमूनों को कवर किया.
- 0.1% ट्राइटन X-100 के साथ पंजाब में फ्लोरोसेंट माध्यमिक एंटीबॉडी समाधान और 1 दिन के लिए 70 rpm और 37 डिग्री सेल्सियस पर अवरुद्ध सीरम के साथ स्पष्ट किया ऊतक सेते हैं.
- रातोंरात 70 rpm और 37 डिग्री सेल्सियस पर 0.1% ट्राइटन X-100 के साथ 10 मिलीलीटर पंजाब में ऊतक कुल्ला. इस चरण 3 बार दोहराएँ और अतिरिक्त जेल एफ को हटानेबफर समाधान बदलते जब ऊतक रोम.
- रातोंरात 70 rpm और 37 डिग्री सेल्सियस पर 10 मिलीलीटर पीबीएस में ऊतक कुल्ला. इस चरण 3 बार दोहराएँ और बफर समाधान बदलते जब ऊतक से अतिरिक्त जेल हटा दें.
- 70 rpm और 37 डिग्री सेल्सियस रातोंरात पर 80% ग्लिसरॉल में स्पष्ट किया ऊतक सेते हैं.
- पूर्व confocal माइक्रोस्कोपी के लिए 4 डिग्री सेल्सियस पर फ्लोरोसेंट दाग ऊतक स्टोर.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
कई महत्वपूर्ण विकासात्मक घटनाओं समुद्र एक प्रकार की मछली कायापलट दौरान Hepatobiliary प्रणाली में होते हैं. पित्त नली और पित्ताशय apoptosis और पतित (चित्रा 1) से गुजरना. और confocal माइक्रोस्कोपी का उपयोग विरोधी apoptotic मार्कर BCL2 (cholangiocytes और hepatocytes से पहले और कायापलट 13 के बाद दोनों में मौजूद CK19,) जिगर सेल मार्कर cytokeratin 19 के साथ संशोधित स्पष्टीकरण विधि और धुंधला संयोजन, पूरे पित्त प्रणाली Z-अक्ष (साथ पकड़ा गया चित्रा 2) और 3 आयामी संरचना (चित्रा 3) को खंगाला गया था. लेजर स्कैनिंग confocal माइक्रोस्कोपी पित्त प्रणाली के सबसे पित्त नली आंत में प्रवेश करती है जहां जंक्शन छोड़कर जिगर के अंदर एम्बेडेड है के बाद से बरकरार जिगर के माध्यम से ऑप्टिकल अनुभाग प्रदर्शन करने के लिए इस्तेमाल किया गया था. अपक्षयी प्रक्रिया केंद्रीय बड़ी intrahep की ओर परिधीय छोटे पित्त ductules से शुरू रूपांतरित चरणों 2-4 में होता हैपहले के अध्ययनों 10 के साथ संगत atic आम पित्त नली (चित्रा 2),.
समुद्र एक प्रकार की मछली कायापलट दौरान चित्रा 1. पित्ताशय अध: पतन. सागर एक प्रकार की मछली कायापलट दौरान पित्ताशय (काला तीर) खो देते हैं. नमूनों रूपांतरित चरणों 2 और 3 के बीच बाहरी आकृति विज्ञान के साथ जानवरों से ले जाया गया, (चरण 2) के बिना या (स्टेज 3) आईरिस और शिष्य के तेज भेदभाव, मौखिक के भीतर की पृष्ठीय सतह पर प्रमुख papilla की तरह के अनुमानों के साथ दौर आंख यानी हुड (दोनों चरणों), मौखिक गुहा में एक आयताकार प्रवेश द्वार (स्टेज 3), या "पग की तरह" थूथन (स्टेज 3) 3 बनाने मौखिक हुड (चरण 2) के होठों thickened. पित्ताशय भी पित्त उत्पादन में मतभेद का संकेत रंग बदला कि ध्यान दें.मैं: आंत. एल. जिगर इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें.
चित्रा 2. कायापलट दौरान समुद्र एक प्रकार की मछली जिगर में पित्त पेड़ दिखा Confocal छवियों. नमूनों शीर्ष पैनल पूर्वकाल से ले रहे हैं. रूपांतरित चरणों 2 और 3 के बीच बाहरी आकृति विज्ञान के साथ जानवरों से ली गई है, और पीछे के अंत से कम पैनल थे. जिगर सेल मार्कर cytokeratin 19 की छवियाँ (1:100 माउस विरोधी CK19, 2 ग्राम के साथ दाग / एमएल एलेक्सा Fluor 350 बकरी विरोधी माउस आईजीजी, नीला) और विरोधी apoptotic मार्कर BCL2 (1:100 खरगोश विरोधी BCL2; / एमएल एलेक्सा Fluor 488-गधा विरोधी खरगोश आईजीजी 2 ग्राम के साथ दाग, हरा) मर्ज किए गए छवियों को उत्पन्न करने के लिए आरोपित कर रहे हैं. सफेद तीर बी का संकेतiliary पेड़. काला तीर अंधेरे वृक्ष के समान apoptotic कोशिकाओं देख रहे हैं और जिगर में canaliculi और ductules आसपास के संकेत मिलता है. मैं: आंत. एल: जिगर. स्केल बार:. 500 माइक्रोन इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें.
मर्ज किए गए confocal जेड श्रृंखला से खंगाला चित्रा 3. 3 डी छवियों. 3 डी छवियों रूपांतरित चरणों 2 और 3 के बीच तीन यकृत की confocal जेड श्रृंखला से खंगाला गया. जिगर सेल मार्कर cytokeratin 19 के मर्ज किए गए चित्रों में से ऑप्टिकल वर्गों (1:100 माउस विरोधी CK19, 2 ग्राम / एमएल एलेक्सा Fluor 350 बकरी विरोधी माउस आईजीजी के साथ दाग, नीला) और विरोधी apoptotic मार्कर BCL2 (1:100 खरगोश विरोधी BCL2, 2 ग्राम / एमएल एलेक्सा Fluor 488-गधा के साथ दाग विरोधीखरगोश आईजीजी; ) ग्रीन 3 डी छवियों को उत्पन्न करने के लिए निर्माता के सॉफ्टवेयर के साथ खंगाला जाता है. शीर्ष पैनल पूर्वकाल से ली गई है, और पीछे के अंत से कम पैनल हैं. सफेद तीर पित्त पेड़ से संकेत मिलता है. काला तीर अंधेरे वृक्ष के समान apoptotic कोशिकाओं देख रहे हैं और जिगर में canaliculi और ductules आसपास के संकेत मिलता है. मैं: आंत. एल: जिगर. स्केल बार:. 500 माइक्रोन इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें.
.. 3 फ्लोरोसेंट चैनलों से चित्रा 4 लुमेन में पित्त की बूंदों के साथ पित्त नलिकाओं दिखा एक confocal ऑप्टिकल खंड मर्ज किए गए छवि; ब्लू: माउस विरोधी सी Myc (1:100) / 2 ग्राम / एमएल एलेक्सा Fluor 350 बकरी विरोधी माउस आईजीजी; ग्रीन: 2 ग्राम / एमएल Nissl हरी; लाल: खरगोश विरोधी TGFβRII (1:100) / 2 ग्राम / एमएल एलेक्सा Fluor 594-गधा विरोधी खरगोश. स्केल पट्टी: 500 माइक्रोन. पित्त बूंदों काला तीर द्वारा संकेत कर रहे हैं. जिगर नमूना रूपांतरित चरण 2 और 3 के बीच ले जाया गया. इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
इस प्रोटोकॉल एक nanoporous हाइड्रोजेल के लिए फार्म polyacrylamide साथ बरकरार ऊतक crosslinks, और फिर ऑप्टिकल पारदर्शिता और macromolecular पारगम्यता प्राप्त करने के लिए ऊतक के प्लाज्मा झिल्ली दूर स्ट्रिप्स जो "" स्पष्टता 12 नामक एक नई विधि से संशोधित किया गया है. "" स्पष्टता के लंबी दूरी के प्रक्षेपण और तंत्रिका तंत्र में स्थानीय सर्किट तारों की बरकरार ऊतक इमेजिंग की अनुमति देता है. इस नई विधि कायापलट दौरान समुद्र एक प्रकार की मछली जिगर में पूरे पित्त प्रणाली कल्पना करने के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है. यह उच्च संकल्प जानकारी प्राप्त करने और इस तरह पूरे पित्त प्रणाली या पारंपरिक एम्बेडिंग का प्रयोग और तरीकों सेक्शनिंग केंद्रीय तंत्रिका तंत्र के रूप में एक जटिल प्रणाली से वैश्विक परिप्रेक्ष्य बनाए रखने के लिए जीव विज्ञान में एक चुनौती है. इस संशोधित स्पष्टता विधि एक लेजर बीम एक नियमित लेजर स्कैनिंग confoca में कम बिजली फ्लोरोसेंट उद्देश्य (4x) का उपयोग 1-2 मिमी की मोटाई पर निर्भर बरकरार समुद्र एक प्रकार की मछली लार्वा जिगर के माध्यम से प्रवेश करने की अनुमति देता हैएल माइक्रोस्कोप. गहरी पैठ एक और अधिक उन्नत बहु - फोटोन confocal खुर्दबीन का उपयोग कर प्राप्त किया जा सकता है. तीन आयामी चित्र 3 डी पुनर्निर्माण सॉफ्टवेयर का उपयोग कर खंगाला जा सकता है. पारंपरिक तरीकों का उपयोग कर तुलनीय परिणाम प्राप्त करने, श्रमसाध्य हो कई वर्गों के टुकड़ों पुनर्निर्माण शामिल है, और छोटे ऊतक संस्करणों को सीमित किया जाएगा होगा. इस नई विधि बरकरार सिस्टम 12 के पूरे संरचनात्मक विश्लेषण से बहुमूल्य जानकारी प्रदान करता है, कम श्रम प्रधान, अधिक कुशल और प्रतिलिपि प्रस्तुत करने योग्य.
इस नई विधि का एक और लाभ यह नमूना अलग एंटीबॉडी 12 के साथ धुंधला करने के लिए कई बार reused किया जा सकता है. यह एक ही नमूना में विभिन्न आणविक मार्कर के बीच तुलना में अधिक विश्वसनीय और प्रतिलिपि प्रस्तुत करने योग्य बनाता है. हाइड्रोजेल द्वारा उत्पन्न स्थिर ढांचा ठीक संरचना क्षति के बिना एंटीबॉडी के प्रभावी हटाने की अनुमति देता है और एक लो के लिए प्रतिजनकता रखता हैएनजी समय 12. समाशोधन समाधान इसलिए एक एंटीबॉडी अलग करना समाधान 12 के रूप में अभिनय, बाध्यकारी एंटीबॉडी और बाधित denatures. धुंधला के कई दौर समुद्र एक प्रकार की मछली जिगर के नमूनों में प्रदर्शन किया गया है और संरचना और धुंधला इष्टतम बने रहे.
मूल "स्पष्टता" प्रोटोकॉल 12 से इस प्रोटोकॉल में दो प्रमुख संशोधन कर रहे हैं. (1) मुफ्त कट्टरपंथी पैदा अभिकर्मकों (अमोनियम persulfate और TEMED) के बजाय VA044 के हाइड्रोजेल के polymerization आरंभ और तेजी लाने के लिए इस्तेमाल किया गया. VA044 सहज और उपलब्ध नहीं अमेरिका में (2) कोई कस्टम निर्मित वैद्युतकणसंचलन चैम्बर प्रयोग किया जाता है. ऊतकों (एक प्रकार की मछली जिगर बनाम माउस मस्तिष्क) के आकार की वजह से स्पष्टता विधि 12 में, electrophoretic ऊतक समाशोधन प्लाज्मा झिल्ली की निकासी में तेजी लाने के लिए आवश्यक है. एक कस्टम निर्मित वैद्युतकणसंचलन चैम्बर के लिए प्रारंभिक लागत से बचने के लिए, हम पहले exi इस्तेमाल कियाहमारी प्रयोगशाला में agarose जेल वैद्युतकणसंचलन उपकरणों डंक. यह बहुत अक्षम साबित हुई. हालांकि, उठाया तापमान (50 डिग्री सेल्सियस) के साथ समाशोधन समाधान में ऊष्मायन प्लाज्मा झिल्ली की मंजूरी देने में बहुत प्रभावी है.
"" स्पष्टता के लिए लेखकों हाइड्रोजेल में सैपोनिन के इस्तेमाल के खिलाफ आगाह किया है, यह हमारी प्रक्रिया में समुद्र एक प्रकार की मछली के ऊतकों में पारदर्शिता में सुधार. Confocal इमेजिंग के लिए एक दोष यह समुद्र एक प्रकार की मछली ऊतक मजबूत ऑटो प्रतिदीप्ति है कि है. fluorophores के चुनाव immunofluorescent धुंधला पहले और बाद में छवियों की तुलना द्वारा परीक्षण किया जाना चाहिए.
समुद्र एक प्रकार की मछली कायापलट के दौरान, पित्ताशय उपकला के प्रतिगमन रूपांतरित चरणों 2 और 3 के बीच शुरू होता है. रूपांतरित चरण 4 से, पित्ताशय समुद्र एक प्रकार की मछली जिगर 14 से पूरी तरह गायब हो जाता है. पित्त नली अध: पतन सबसे नाटकीय हैराजनयिक रूपांतरित चरणों 3 और 4 के बीच 15. इस संशोधित पद्धति मानव पित्त अविवरता के लिए अंतर्दृष्टि प्रदान कर सकता है जो पूरे पित्त प्रणाली के अध: पतन के सेलुलर और आणविक तंत्र का अध्ययन करने के लिए एक शक्तिशाली उपकरण है.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
लेखकों का खुलासा करने के लिए कुछ भी नहीं है.
Acknowledgments
लेखकों हैमंड बे जैविक स्टेशन, ग्रेट झील विज्ञान केंद्र, अमेरिकी भूवैज्ञानिक सर्वेक्षण के योगदान को स्वीकार करते हैं. हम भी लेजर स्कैनिंग confocal माइक्रोस्कोपी में उसे तकनीकी समर्थन के लिए मिशिगन स्टेट यूनिवर्सिटी में विकसित माइक्रोस्कोपी के लिए केंद्र में डॉ. मेलिंडा फ़्रेम धन्यवाद. इस अध्ययन YWCD और WML को ग्रेट झील मत्स्य आयोग से अनुदान द्वारा समर्थित है.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 40% acrylamide | Bio-Rad | 161-0140 | |
| 2% bis-acrylamide | Bio-Rad | 161-0142 | |
| TEMED | Bio-Rad | 161-0800 | |
| ammonium persulfate | Sigma | A3678-25G | |
| boric acid | Sigma | B7901-1KG | |
| saponin | Sigma | 47036 | |
| sodium dodecyl sulfate | Sigma | L337-500G | |
| sodium phosphate (monobasic) | Sigma | 04269-1KG | |
| sodium phosphate (dibasic) | Sigma | S5136-1KG | |
| Triton X-100 | Sigma | X100-500ML | |
| glycerol | Sigma | G9012-500ML | |
| 16% paraformaldehyde | Electron Microscopy Sciences | 15710-S | |
| NaOH pellets | EMD | SX0590-3 | |
| 15 ml centrifuge tubes | Any brand | ||
| dissecting tools | Any brand |
References
- Applegate, V. C. Natural history of the sea lamprey (Petromyzon marinus) in Michigan. US Fish and Wildlife Service Special Science Report on Fishery Service. (55), (1950).
- Hardisty, M. W., Potter, I. C. The general biology of adult lampreys. The biology of lampreys. Hardisty, M. W., Potter, I. C. 1, New York Academic Press. 127-206 (1971).
- Youson, J. H., Potter, I. C. A description of the stages in the metamorphosis of the anadromous sea lamprey, Petromyzon marinus L. Can. J. Zool. 57, 1808-1817 (1979).
- Boomer, L. A., et al. Cholangiocyte apoptosis is an early event during induced metamorphosis in the sea lamprey, Petromyzon marinus L. J. Pediatr. Surg. 45, 114-120 (2010).
- Kasai, M., Suzuki, H., Ohashi, E., Ohi, R., Chiba, T., Okamoto, A. Technique and results of operative management of biliary atresia. World J. Surg. 2, 571-580 (1978).
- Suzuki, T., Hashimoto, T., Kondo, S., Sato, Y., Hussein, M. H. Evaluating patients’ outcome post-Kasai operation: a 19-year experience with modification of the hepatic portoenterostomy and applying a novel steroid therapy regimen. Pediatr. Surg. Int. 26, 825-830 (2010).
- Hartley, J. L., Davenport, M., Kelly, D. A. Biliary atresia. Lancet. 374, 1704-1713 (2009).
- Morecki, R., Glaser, J. H., Cho, S., Balistreri, W. F., Horwitz, M. S. Biliary atresia and reovirus type 3 infection. New Engl. J. Med. 307, 481-484 (1982).
- Shimadera, S., Iwai, N., Deguchi, E., Kimura, O., Fumino, S., Yokoyama, T. The inv mouse as an experimental model of biliary atresia. J. Pediatr. Surg. 42, 1555-1560 (2007).
- Sidon, E. W., Youson, J. H. Morphological changes in the liver of the sea lamprey, Petromyzon marinus L., during metamorphosis: I. Atresia of the bile ducts. J. Morphol. 177, 109-124 (1983).
- Yeh, C. -Y., Chung-Davidson, Y. -W., Wang, H., Li, K., Li, W. Intestinal synthesis and secretion of bile salts as an adaptation to developmental biliary atresia in the sea lamprey. Proc. Nat. Acad. Sci. U.S.A. 109, 11419-11424 (2012).
- Chung, K., et al. Structural and molecular interrogation of intact biological systems. Nature. 497, 332-337 (2013).
- Alarcón, V. B., Filosa, M. F., Youson, J. H. Cytokeratins in the liver of the sea lamprey (Petromyzon marinus) before and after metamorphosis. Cell Tissue Res. 287, 365-374 (1997).
- Youson, J. H., Ogilvie, D. R. Ultrastructural features of degeneration of the gallbladder during lamprey biliary atresia. Tissue and Cell. 22, 477-492 (1990).
- Morii, M., et al. Onset of apoptosis in the cystic duct during metamorphosis of a Japanese lamprey, Lethenteron reissneri. Anat. Rec. 293, 1155-1166 (2010).
