Summary
Havsnejonöga förlorar gallblåsa och gallgångar under metamorfos, en process som liknar mänsklig gallgångsatresi. En ny fixering och förtydligande metod (CLARITY) modifierades för att visualisera hela gallan trädet med hjälp av laserskanning konfokalmikroskopi. Denna metod ger ett kraftfullt verktyg för att studera gallan degeneration.
Abstract
Gallgångsatresi är en ovanlig sjukdom i barndomen, med en beräknad 1 i 15.000 frekvens i sydöstra USA, men vanligare i östasiatiska länder, med en rapporterad frekvens av 1 i 5000 i Taiwan. Även om mycket är känt om hanteringen av gallgångsatresi, är dess patogenes fortfarande svårfångad. Den havsnejonöga (Petromyzon marinus) ger en unik möjlighet att undersöka mekanismen och utvecklingen av galla degeneration. Havsnejonöga utvecklas genom tre olika livsstadier: larver, parasitiska, och vuxna. Under övergången från larver till parasit juvenil, havsnejonöga genomgår metamorfos med dramatiska omorganisation och ombyggnad i yttre morfologi och inre organ. I levern är hela gallsystemet förlorad, inklusive gallblåsan och den biliära trädet. En nyutvecklad metod som kallas "CLARITY" har ändrats för att klargöra hela levern och korsningen med tarmen i metamorfa havsnejonöga. Denprocess galla degeneration visualiserades och urskiljas under havsnejonöga metamorfos genom laserskanning konfokalmikroskopi. Denna metod ger ett kraftfullt verktyg för att studera gallgångsatresi i en unik djurmodell.
Introduction
Havsnejonöga utvecklas genom tre olika levnadsstadier 1,2. Larv havsnejonöga (L) tillbringar mest tid i hålor som bentiska filtrerare. Efter att ha gått igenom sju metamorfa stadier av dramatiska förändringar i yttre morfologi och omorganisation i inre organ 3, de resulterande ungdomar (JV) anger en parasit stadium där de livnär sig på blod och vävnadsvätska från värdfisk, öka kroppsmassan mer än 100 gånger . Efter 1,0-1,5 år livnär sig på värdfisk i havet eller stora sjöar, vuxna upphöra utfodring under den tidiga våren och vandrar in i floder för att leka och sedan dö 1,2.
Under metamorfos, förlorar havsnejonöga levern gallblåsan och hela gallan trädet, en evolutionär mutantfenotypen som efterliknar människo spädbarn sjukdomen gallgångsatresi. Infant gallgångsatresi är en sällsynt pediatrisk leversjukdom med allvarliga medicinska komplikationer 4,5,6,7, 8,9,10, men patogenesen och etiologi av gallgångsatresi är till stor del okänt 4. Patienter med gallgångsatresi dör inom två år efter födseln, om inte kirurgiskt ingrepp (Kasai förfarande) utförs 5. Därefter dessa patienter kräver omfattande klinisk ledning och ofta levertransplantation 6. Många teorier om gallgångsatresi etiopatogenesen har föreslagits, såsom virusinfektion, medfödd missbildning, autoimmun sjukdom, och toxiska insult. Emellertid förblir inconclusive 7,8,9,10 bidraget från varje till utvecklingen av biliär atresi.
Till skillnad från barn som lider patologisk gallgångsatresi, genomgår havsnejonöga utvecklingsmässigt programmerad gallgångsatresi utan omfattande necroinflammation, fibros eller cirros 10. Djuren kan drabbas av övergående kolestas under denna process 10, men anpassa sig till denna utvecklings tillståndvia de novo-syntes och utsöndring av gallsalter i tarmen efter utvecklings gallgångsatresi, förutom kända mekanismer såsom minskning av gallsalt syntesen i levern 11. Denna utvecklingsprocess i havsnejonöga ger den enda kända möjlighet att undersöka utvecklingen av gallgångsatresi.
En nyutvecklad metod som kallas "CLARITY" möjliggör högupplöst avbildning i komplexa däggdjurs nervsystem genom att förvandla intakt vävnad i ett optiskt transparent nanoporösa hydrogel 12. Använda havsnejonöga lever och en modifierad CLARITY-protokoll, kan intakt-vävnad avbildning av galla degeneration dokumenteras genom lever metamorfos.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. Lösning Beredning
- Gör en L 10x 0,1 M fosfatbuffert-saltlösning (PBS, pH 7,4): Väg upp 26,2 g natriumfosfat (enbasisk), 115 g natriumfosfat (dibasiskt), och 87,66 g NaCl. Lös i ca 800 ml destillerat H 2 O, justera pH och ta upp volymen till 1 liter med destillerat H2O
- Gör 1 L 0,1 M fosfatbuffertsaltlösning (pH 7,4): Ta 100 ml 10x PBS, och tillsätt 900 ml destillerat H2O
- Gör 1 L 0,1 M fosfatbuffert saltlösning (pH 7,4) med 0,1% Triton X-100: Tag 100 ml 10x PBS, tillsätt 1 ml Triton X-100, och ta upp volymen till 1 liter med destillerat H2O
- Gör en L 10x 0,1 M fosfatbuffert (PB, pH 7,4): Väg upp 26,2 g natriumfosfat (monobasiskt), och 115 g natriumfosfat (dibasisk). Lös i ca 800 ml destillerat H 2 O, justera pH och ta upp volymen till 1 liter med destillerat H2O
- Gör 1 L 0,1 M fosfatbuffert (pH 7,4): Ta 100 ml 10x PB,och tillsätt 900 ml destillerat H2O
- Gör 1 L 0,1 M fosfatbuffert (pH 7,4) med 0,1% Triton X-100: Ta 100 ml 10x PB, tillsätt 1 ml Triton X-100, och ta upp volymen till 1 liter med destillerat H2O
- Gör 400 ml hydrogel monomer-lösning (4% akrylamid, 0,25% bis-akrylamid, 4% paraformaldehyd, 0,0075% ammoniumpersulfat, 0,0005% saponin i 0,1 M PBS): Väg upp 0,3 g ammoniumpersulfat och 0,2 g saponin. Addera 210 ml destillerat H2O, 40 ml 40% akrylamid, 10 ml 2% bis-akrylamid, 40 ml 10x PBS (pH 7,4), 100 ml 16% paraformaldehyd, och blanda väl.
- Gör 4 L clearing-lösning (4% SDS i 0,2 M borsyra): Väg upp 49,464 g borsyra och 160 g SDS. Lös upp i ca 3,5 L destillerat H2O, justera pH till 8,5 med NaOH, och föra upp volymen till 4 L.
- Gör 1 L 80% glycerollösning: Mät 800 ml glycerol, tillsätt 200 ml destillerat H 2 O, och blanda väl.
2. Vävnadsberedning
- Förbered hydrogel monomerlösning och delmängd 10 ml till varje 15 ml centrifugrör.
- Dissekera hela vävnaden och fixera i hydrogelen under 2 dagar vid 4 ° C. Kontrollera att hydrogelen lösningen är åtminstone 10 gånger volymen av vävnaden.
- Bring hydrogelen fixerad vävnad (i 15 ml centrifugrör) till en huv.
- Polymerisera hydrogelen fixerad vävnad genom att tillsätta 5 pl TEMED, blanda väl och låt stå i dragskåp vid rumstemperatur under 2-3 timmar.
- Ta bort överflödiga gelen ordentligt. OBS: Extra gel hindrar clearingprocessen och penetration kroppen under färgning.
- Inkubera fast vävnad i 10 ml clearing lösning i en inkubator skakare inställd på 70 rpm och 50 ° C under flera dagar tills vävnaden blir transparent. Ändra rensa lösning åtminstone en gång per dag och ta bort överskott gelen från vävnaden vid byte av clearinglösning.
- Skölj vävnaden i 10 ml 0,1 M fosfatbuffert med 0,1% Triton X-100 vid 70 rpm och 37 ° C över natten. Upprepa detta steg tre gånger och ta bort överflödig gel från vävnaden vid byte av buffertlösningen.
- Inkubera klar vävnad i den primära antikropplösningen i PB med 0,1% Triton X-100 vid 70 varv per minut och 37 ° C under 2 dagar. OBS: Se till tillräckligt primär antikropp lösning för att dränka hela vävnaden.
- Skölj vävnaden i 10 ml PB med 0,1% Triton X-100 vid 70 varv per minut och 37 ° C över natten. Upprepa detta steg tre gånger och ta bort överflödig gel från vävnaden vid byte av buffertlösningen.
- Utför följande steg i ett mörkt rum eller vid dåliga ljusförhållanden. Täck proverna med folie för att förhindra fotoblekning.
- Inkubera klar vävnaden med den fluorescerande sekundär antikropp lösning i PB med 0,1% Triton X-100 och blockeringsserum vid 70 rpm och 37 ° C under en dag.
- Skölj vävnaden i 10 ml PB med 0,1% Triton X-100 vid 70 varv per minut och 37 ° C över natten. Upprepa steg 3 gånger och avlägsna överskotts gel from vävnaden vid byte av buffertlösningen.
- Skölj vävnaden i 10 ml PBS vid 70 rpm och 37 ° C över natten. Upprepa detta steg tre gånger och ta bort överflödig gel från vävnaden vid byte av buffertlösningen.
- Inkubera klar vävnad i 80% glycerol vid 70 rpm och 37 ° C över natten.
- Förvara fluorescent färgade vävnaden vid 4 ° C före konfokalmikroskopi.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Flera utvecklings viktiga händelser inträffar i lever och galla under havsnejonöga metamorfos. Gallgången och gallblåsan genomgå apoptos och degenererade (figur 1). Kombinera den modifierade förtydligande metod och färgning med levercellmarkör cytokeratin 19 (CK19, närvarande i båda cholangiocytes och hepatocyter före och efter metamorfos 13) och anti-apoptotiska markör Bcl2 använder konfokalmikroskopi ades hela gallsystemet fångas längs Z-axeln ( Figur 2) och 3-dimensionella struktur byggdes (Figur 3). Laserskanning konfokalmikroskopi användes för att utföra optisk sektion genom den intakta levern eftersom det mesta av gallsystemet är inbäddad inuti levern utom korsningen där gallgången kommer in i tarmen. Den degenerativa processen sker i metamorfa stegen 2-4, med början från perifera små galla ductules mot den centrala stora intrahepatic gallgången (figur 2), i överensstämmelse med tidigare studier 10.
Figur 1. Gallblåsan degeneration under havsnejonöga metamorfos. Havsnejonöga förlora gallblåsan (svarta pilar) under metamorfos. Proverna togs från djur med yttre morfologi mellan metamorfa stegen 2 och 3, dvs runt ögat utan (etapp 2) eller med (etapp 3) skarpa differentiering av iris och elev, framstående papilla-liknande projektioner på inner dorsala ytan av den orala huv (båda stegen), förtjockad läppar oral huva (etapp 2) som bildar en rektangulär entré i munhålan (etapp 3), eller "mopsliknande" nos (etapp 3) 3. Observera att gallblåsan ändrade också färg indikerar skillnader i galla produktion.I: tarmar. L:. Lever klicka gärna här för att se en större version av denna siffra.
Figur 2. Confocal bilder som visar gallträdet i havsnejonöga lever under metamorfos. Proverna togs från djur med yttre morfologi mellan metamorfa stegen 2 och 3. Topp paneler är hämtade från den främre och de undre panelerna från den bakre änden. Bilder av levercellsmarkör cytokeratin 19 (1:100 mus-anti-CK19, färgades med 2 mikrogram / ml Alexa Fluor 350-get-anti-mus-IgG, blå) och anti-apoptotiska markör Bcl2 (1:100 kanin-anti- Bcl2, färgades med 2 | ig / ml Alexa Fluor 488-åsna-anti-kanin-IgG; grön) är överlagrade för att generera de sammanslagna bilderna. Vita pilar indikerar biliary träd. Svarta pilar anger den mörka dendritisk tittar apoptotiska celler och omgivande canaliculi och ductules i levern. I: tarmar. L: lever. Skala bar:. 500 ^ Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Figur 3. 3D-bilder rekonstruerade från sammanslagna konfokala z-serien. 3D-bilder rekonstruerades från konfokala Z-serie av tre levrar mellan metamorfa stegen 2 och 3. Optiska avsnitt av sammanslagna bilder av levercellsmarkör cytokeratin 19 (1:100 mus- anti-CK19, färgades med 2 | ig / ml Alexa Fluor 350-get-anti-mus-IgG; blå) och anti-apoptotiska markör Bcl2 (1:100 kanin-anti-Bcl2, färgades med 2 | ig / ml Alexa Fluor 488-åsna -anti-kanin IgG; grön) rekonstrueras med tillverkarens programvara för att generera 3D-bilder. Sammanfattning paneler är tagna från den främre och de undre panelerna från den bakre änden. Vita pilar indikerar biliära trädet. Svarta pilar anger den mörka dendritisk tittar apoptotiska celler och omgivande canaliculi och ductules i levern. I: tarmar. L: lever. Skala bar:. 500 ^ Klicka här för att se en större version av denna siffra.
.. Figur 4 En konfokala optisk avsnitt visar gallgångarna med galla droppar i lumen sammanslagna bilden från 3 fluorescerande kanaler; blå: mus-anti-c-Myc (1:100) / 2 mikrogram / ml Alexa Fluor 350-get-anti-mus-IgG; grön: 2 mikrogram / ml Nissl grön; Röd: Kanin-anti-TGFβRII (1:100) / 2 mikrogram / ml Alexa Fluor 594-åsna-anti-kanin. Skala bar: 500 um. Bile dropparna anges med svarta pilar. De lever exemplar togs mellan metamorf etapp 2 och 3. Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Detta protokoll är modifierad från en ny metod kallad "skärpa" 12, som tvärbinder intakt vävnad med polyakrylamid för att bilda en nanoporös hydrogel, och därefter skalar bort plasmamembranet av vävnaden för att uppnå optisk transparens och makromolekylär permeabilitet. "CLARITY" låter intakta-vävnad avbildning av långväga projektion och lokala krets ledningar i nervsystemet. Denna nya metod kan användas för att visualisera hela gallvägar i havsnejonöga lever under metamorfos. Det är en utmaning inom biologi för att erhålla hög upplösning information och bibehålla det globala perspektivet från ett komplext system, såsom hela biliära systemet eller det centrala nervsystemet med användning av konventionell inbäddning och snittning metoder. Denna modifierade KLARHET metod tillåter en laserstråle för att tränga genom den intakta havsnejonöga larv lever upp till en tjocklek av 1 till 2 mm med användning av lågenergi-fluorescerande mål (4x) i en vanlig laserskanning confocal mikroskop. Djupare penetrering kan uppnås med användning av en mer avancerad multifoton konfokalmikroskop. Tredimensionella bilder kan rekonstrueras med hjälp av 3D-rekonstruktion programvara. Att uppnå jämförbara resultat med konventionella metoder skulle vara mödosamt, som innebär styckevis rekonstruktion av många delar, och skulle begränsas till små vävnadsvolymer. Denna nya metod ger värdefull information från hela strukturella analyser av intakta system 12, är mindre arbetskrävande, effektivare och reproducerbar.
En annan fördel med denna nya metod är att provet kan återanvändas flera gånger för färgning med olika antikroppar 12. Detta gör att jämförelser mellan olika molekylära markörer i samma prov mer tillförlitliga och reproducerbara. Den stabila ramar som genereras av hydrogel möjliggör effektiv borttagning av antikroppar utan fin struktur skador och bibehåller antigeniciteten för en long tid 12. Clearing lösningen denaturerar antikroppar och stör bindande, därför fungerar som en antikropp-stripplösningen 12. Flera omgångar av färgning har utförts på havsnejonöga leverprover i och strukturen och färgning förblev optimalt.
Det finns två stora ändringar i detta protokoll från den ursprungliga "CLARITY" protokoll 12. (1) friradikalalstrande reagenser (ammoniumpersulfat och TEMED) användes för att initiera och påskynda polymerisation av hydrogel istället för VA044. VA044 är ljuskänslig och inte tillgängliga i USA (2) Inga specialbyggda elektrofores kammare används. Av klarheten metod 12, på grund av storleken på de vävnader (mushjärna vs nejonöga lever) är elektrofore vävnad clearing krävs för att påskynda utvinningen av plasmamembranet. För att undvika att den initiala kostnaden för en specialbyggd elektrofores kammare, först använde vi existing agarosgelelektrofores anordningar i vårt laboratorium. Detta visade sig vara mycket ineffektivt. Emellertid är inkubation i clearing lösning med förhöjd temperatur (50 ° C), mycket effektiva i att göra klar plasmamembranet.
Även om författarna för "CLARITY" varnade för användningen av saponin i hydrogel, det förbättrar insynen i havsnejonöga vävnaden i vårt förfarande. En nackdel för konfokal avbildning är att havsnejonöga vävnad har starka auto-fluorescens. Valet av fluoroforer skall testas genom att jämföra bilderna före och efter immunfluorescensfärgning.
Under havsnejonöga metamorfos börjar regression av gallblåsan epitel mellan metamorfa stegen 2 och 3. Genom metamorf etapp 4, försvinner gallblåsan helt från havsnejonöga lever 14. Gallgången degeneration är mest DRAmatic mellan metamorfa stegen 3 och 4 15. Denna modifierade metod är ett kraftfullt verktyg för att studera de cellulära och molekylära mekanismer av degeneration av hela gallsystemet, vilket kan ge insikter om människans gallgångsatresi.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Författarna har ingenting att lämna ut.
Acknowledgments
Författarna erkänner bidrag Hammond Bay biologiska station, Great Lakes Science Center, US Geological Survey. Vi tackar också Dr Melinda Frame vid Centrum för avancerad mikroskopi vid Michigan State University för sin tekniska support i laserskanning konfokalmikroskopi. Denna studie har finansierats med bidrag från de stora sjöarna fiskerikommissionen till YWCD och WML.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 40% acrylamide | Bio-Rad | 161-0140 | |
| 2% bis-acrylamide | Bio-Rad | 161-0142 | |
| TEMED | Bio-Rad | 161-0800 | |
| ammonium persulfate | Sigma | A3678-25G | |
| boric acid | Sigma | B7901-1KG | |
| saponin | Sigma | 47036 | |
| sodium dodecyl sulfate | Sigma | L337-500G | |
| sodium phosphate (monobasic) | Sigma | 04269-1KG | |
| sodium phosphate (dibasic) | Sigma | S5136-1KG | |
| Triton X-100 | Sigma | X100-500ML | |
| glycerol | Sigma | G9012-500ML | |
| 16% paraformaldehyde | Electron Microscopy Sciences | 15710-S | |
| NaOH pellets | EMD | SX0590-3 | |
| 15 ml centrifuge tubes | Any brand | ||
| dissecting tools | Any brand |
References
- Applegate, V. C. Natural history of the sea lamprey (Petromyzon marinus) in Michigan. US Fish and Wildlife Service Special Science Report on Fishery Service. (55), (1950).
- Hardisty, M. W., Potter, I. C. The general biology of adult lampreys. The biology of lampreys. Hardisty, M. W., Potter, I. C. 1, New York Academic Press. 127-206 (1971).
- Youson, J. H., Potter, I. C. A description of the stages in the metamorphosis of the anadromous sea lamprey, Petromyzon marinus L. Can. J. Zool. 57, 1808-1817 (1979).
- Boomer, L. A., et al. Cholangiocyte apoptosis is an early event during induced metamorphosis in the sea lamprey, Petromyzon marinus L. J. Pediatr. Surg. 45, 114-120 (2010).
- Kasai, M., Suzuki, H., Ohashi, E., Ohi, R., Chiba, T., Okamoto, A. Technique and results of operative management of biliary atresia. World J. Surg. 2, 571-580 (1978).
- Suzuki, T., Hashimoto, T., Kondo, S., Sato, Y., Hussein, M. H. Evaluating patients’ outcome post-Kasai operation: a 19-year experience with modification of the hepatic portoenterostomy and applying a novel steroid therapy regimen. Pediatr. Surg. Int. 26, 825-830 (2010).
- Hartley, J. L., Davenport, M., Kelly, D. A. Biliary atresia. Lancet. 374, 1704-1713 (2009).
- Morecki, R., Glaser, J. H., Cho, S., Balistreri, W. F., Horwitz, M. S. Biliary atresia and reovirus type 3 infection. New Engl. J. Med. 307, 481-484 (1982).
- Shimadera, S., Iwai, N., Deguchi, E., Kimura, O., Fumino, S., Yokoyama, T. The inv mouse as an experimental model of biliary atresia. J. Pediatr. Surg. 42, 1555-1560 (2007).
- Sidon, E. W., Youson, J. H. Morphological changes in the liver of the sea lamprey, Petromyzon marinus L., during metamorphosis: I. Atresia of the bile ducts. J. Morphol. 177, 109-124 (1983).
- Yeh, C. -Y., Chung-Davidson, Y. -W., Wang, H., Li, K., Li, W. Intestinal synthesis and secretion of bile salts as an adaptation to developmental biliary atresia in the sea lamprey. Proc. Nat. Acad. Sci. U.S.A. 109, 11419-11424 (2012).
- Chung, K., et al. Structural and molecular interrogation of intact biological systems. Nature. 497, 332-337 (2013).
- Alarcón, V. B., Filosa, M. F., Youson, J. H. Cytokeratins in the liver of the sea lamprey (Petromyzon marinus) before and after metamorphosis. Cell Tissue Res. 287, 365-374 (1997).
- Youson, J. H., Ogilvie, D. R. Ultrastructural features of degeneration of the gallbladder during lamprey biliary atresia. Tissue and Cell. 22, 477-492 (1990).
- Morii, M., et al. Onset of apoptosis in the cystic duct during metamorphosis of a Japanese lamprey, Lethenteron reissneri. Anat. Rec. 293, 1155-1166 (2010).
