Summary
Deniz taşemen Başkalaşım sırasında safra kesesi ve safra yolları, insan safra atrezi ile benzer bir süreç kaybedersiniz. Yeni bir tespit ve açıklama yöntemi (AÇIKLIK) lazer tarama konfokal mikroskopi kullanılarak tüm safra yolları görselleştirmek için güncellenmiştir. Bu yöntem safra dejenerasyonu incelemek için güçlü bir araç sağlar.
Abstract
Biliyer atrezi Tayvan 5,000 içinde 1 bildirilen frekans ile tahmini 1 15,000 güneydoğu ABD'de frekans, ancak Doğu Asya ülkelerinde daha yaygın olan, bebeklik nadir bir hastalıktır. Çok biliyer atrezi yönetimi hakkında bilinmesine rağmen, patogenezi hala zor olduğunu. Deniz taşemen (Petromyzon marinus) safra dejenerasyonun mekanizması ve ilerlemesini incelemek için eşsiz bir fırsat sunmaktadır. Larva, parazit ve yetişkin: Deniz taşemen üç farklı yaşam evrelerinde yoluyla gelişir. Larva parazitik koleje geçiş sırasında, deniz taşemen dış morfolojisi ve iç organlarda dramatik yeniden yapılanma ve yeniden birlikte metamorfoz tabi. Karaciğerde, tüm bilier sistem safra kesesi ve safra dahil, kaybolur. "AÇIKLIK" adı verilen yeni geliştirilmiş bir yöntem metamorfik deniz lamprey de bağırsak ile tüm karaciğer ve kavşak netleştirmek için güncellenmiştir.safra dejenerasyon süreci lazer tarama konfokal mikroskopi kullanılarak görüntülendi ve deniz taşemen metamorfoz sırasında ayırt edildi. Bu yöntem, eşsiz bir hayvan modelinde safra yolları atrezisi incelemek için güçlü bir araç sağlar.
Introduction
Deniz taşemen üç ayrı yaşam boyunca gelişir 1,2 aşamaları. Larva deniz taşemen (L) bentik filtre besleyiciler olarak yuvalarda çoğu zaman harcamak. Dış morfoloji ve iç organlarda 3 yeniden dramatik değişiklikler yedi metamorfik aşamaları geçtikten sonra, elde edilen yavrular (JV) kütle 100 defadan fazla vücut artırarak, konak balık kan ve doku sıvıları ile beslenirler sırasında bir parazit sahne girin . Okyanus veya büyük göllerde konak balık besleme, 1.0 ila 1.5 yıl sonra, yetişkin erken bahar aylarında beslenme durdurma ve yumurtlamak için akarsulara göç ve ardından 1,2 ölür.
Metamorfoz sırasında, deniz taşemen karaciğer safra kesesi ve safra yolları, tüm, insan bebekte hastalık safra yolları atrezisi taklit eden evrimsel bir mutant fenotip kaybeder. Bebek biliyer atrezi 4,5,6,7 ciddi tıbbi komplikasyonlar nadir bir pediatrik karaciğer hastalığıdır, 8,9,10, ancak safra atrezi patogenezi ve etyolojisi 4 büyük ölçüde bilinmemektedir. Cerrahi müdahale (Kasai prosedürü) 5 gerçekleştirilir sürece biliyer atrezi ile hastalar doğumdan sonra iki yıl içinde ölmektedir. Daha sonra, bu hastalar geniş klinik yönetimi ve genellikle karaciğer nakli 6. gerektirir. Biliyer atrezi etiyopatogenezinin Birçok teori gibi viral enfeksiyon, konjenital malformasyon, otoimmün hastalık, toksik ve hakaret olarak önerilmiştir. Ancak, safra atrezi gelişimine her katkısı 7,8,9,10 sonuçsuz kalır.
Patolojik safra yolları atrezisi acı bebeklerin aksine, deniz taşemen gelişimsel kapsamlı stres nekroinflamasyon, fibrozis veya siroz 10 olmadan safra yolları atrezisi programlanmış geçireceği. Hayvanlar, bu süreçte 10 sırasında geçici kolestazınız acı, ama bu gelişimsel duruma adapte olabilirile de novo sentezi ve bu 11 karaciğer safra tuzunun sentezi azaltma olarak bilinen mekanizmaları ek olarak gelişim safra atrezi, sonra bağırsak safra tuzlarının salgılanması. Deniz lamprey Bu gelişim süreci biliyer atrezi ilerlemesini incelemek için bilinen tek fırsat sağlar.
"AÇIKLIK" adı verilen yeni geliştirilmiş bir yöntem, bir optik şeffaf Nanogeçirgen hidrojel 12 içine bozulmamış dokusu dönüştürerek karmaşık memeli sinir sistemlerinde yüksek çözünürlüklü görüntüleme sağlar. Deniz taşemen karaciğer ve modifiye BERRAKLIK protokolünü kullanarak, safra dejenerasyon sağlam doku görüntüleme karaciğer metamorfoz boyunca belgelenmiştir olabilir.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1.. Çözüm Hazırlığı
- 1 L sağlayın 10x 0.1 M fosfat tampon tuzlu su (PBS, pH 7.4): 26.2 gr sodyum fosfat (monobazik), 115 g sodyum fosfat (dibazik), 87.66 g NaCI ve tartılır. Yaklaşık 800 ml distile H 2 O içinde çözülür, pH ayarlanması, ve distile H 2 O. ile 1 L'ye hacmi getirmek
- 1 L 0.1 M fosfat tampon tuzlu su (pH 7.4) Marka: 100 ml 10x PBS alın ve 900 ml damıtık H2O eklemek
- 100 ml 10x PBS al, 1 ml Triton X-100 ekleyin ve damıtık H2O ile 1 L'ye getir hacim: 1 L 0.1 M fosfat tampon tuzlu su (pH 7.4),% 0.1 Triton X-100 ile yapın
- 26.2 g sodyum fosfat (monobazik) ve 115 g sodyum fosfat (dibazik) tartılır: 1 L 10x 0.1 M fosfat tamponu (PB, pH 7.4) olun. Yaklaşık 800 ml distile H 2 O içinde çözülür, pH ayarlanması, ve distile H 2 O. ile 1 L'ye hacmi getirmek
- 1 L 0.1 M fosfat tamponu (pH 7.4) Marka: Al 100 ml 10x PB,ve H 2 O. damıtılmış 900 ml ekle
- % 0.1 Triton X-100 ile 1 L 0.1 M fosfat tamponu (pH 7.4) Marka: 100 ml 10x PB al, 1 ml Triton X-100 ekleyin ve damıtık H2O ile 1 L'ye kadar ses getirmek
- 400 ml hidrojel monomer çözeltisi (% 4 akrilamit,% 0.25 bis-akrilamid,% 4 paraformaldehit,% 0.0075 amonyum persülfat, 0.1 M PBS içinde% 0.0005 saponin) Marka: 0.3 g amonyum persülfat ve 0.2 g saponin tartılır. 210 ml damıtılmış 2 H ekleme O, 40 ml% 40 akrilamit,% 2 10 mi bis-akrilamid, 40 ml 10x PBS (pH 7.4), 100 ml% 16 paraformaldehit ve iyice karıştırın.
- (0.2 M borik asit,% 4 SDS) 4 L temizleme çözeltisi oluşturunuz: SDS g 49,464 g borik asit ve 160 tartılır. , Yaklaşık 3,5 L distile H 2 O eritin NaOH ile 8.5 pH ayarlamak ve 4 L. hacmi getirmek
- 1 L% 80 gliserol çözeltisi Marka:, 800 ml gliserol ölçmek 200 ml damıtık H2O ekleyin ve iyice karıştırın.
2.. Doku Hazırlanması
- Her bir 15 ml santrifüj tüpüne hidrojel monomer çözeltisi ve kısım 10 mi hazırlayın.
- Bütün doku inceleyin ve 4 ° C'de 2 gün için hidrojel saptamak Hidrojel çözelti en az 10x doku hacmi olduğundan emin olun.
- Bir çeker ocak için (15 ml santrifüj tüpüne) hidrojel sabit doku getirin.
- , TEMED 5 ul ekleyerek hidrojel sabit doku polimerize iyice karıştırın ve 2-3 saat boyunca oda sıcaklığında, çeker ocak içinde bekletin.
- İyice fazla jelin çıkarılması. Not: Ekstra jel boyama esnasında temizleme sürecini ve antikor sokulmasına engel olacaktır.
- Doku saydam hale gelinceye kadar, birkaç gün boyunca 70 rpm'de ve 50 ° C'de ayarlanmış bir kuluçka çalkalayıcı içinde çözelti temizleme 10 ml sabit doku inkübe edin. , En az günde bir kez temizleme çözeltisi değiştirmek ve temizleme solüsyonu değiştirirken dokudan fazla jelin çıkarılması.
- 70 r% 0.1 Triton X-100 ile 10 ml 0.1 M PB içerisinde dokuyu durulayınpm ve 37 ° C gecede. Bu adım 3 kez tekrarlayın ve tampon çözeltisi değiştirirken dokudan fazla jelin çıkarılması.
- 2 gün boyunca 70 rpm ve 37 ° C 'de% 0.1 Triton X-100 ile PB primer antikor çözeltisi içindeki açıklık dokuyu inkübe edin. Not: Bütün daldırın doku için yeterli birincil antikor çözüm olun.
- Gece boyunca 70 rpm ve 37 ° C 'de% 0.1 Triton X-100 ile 10 ml PB doku durulayın. Bu adım 3 kez tekrarlayın ve tampon çözeltisi değiştirirken dokudan fazla jelin çıkarılması.
- Karanlık bir odada ya da loş ışık altında, aşağıdaki adımları uygulayın. Fotoğraf beyazlatma önlemek için folyo ile örtün örnekleri.
- % 0.1 Triton X-100 ile PB floresan ikincil antikor çözeltisi ve 1 gün boyunca 70 rpm ve 37 ° C de bloke serumu ile berraklaştırılmış dokuyu inkübe edin.
- Gece boyunca 70 rpm ve 37 ° C 'de% 0.1 Triton X-100 ile 10 ml PB doku durulayın. Bu adımı 3 kez tekrarlayın ve aşırı jel f kaldırmakTampon çözeltisi değiştirirken doku rom.
- Gece boyunca 70 rpm ve 37 ° C de 10 ml PBS içinde doku durulayın. Bu adım 3 kez tekrarlayın ve tampon çözeltisi değiştirirken dokudan fazla jelin çıkarılması.
- 70 rpm ve 37 ° C sıcaklıkta gece boyunca% 80 gliserol içinde berraklaştırılmış doku inkübe edin.
- Önce konfokal mikroskopi için 4 ° C'de floresan lekeli doku saklayın.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Birçok önemli gelişme olayları deniz taşemen Başkalaşım sırasında Hepatobilier sistemde meydana. Safra kanalı ve safra kesesi apoptozu ve dejenere (Şekil 1) tabi. Ve konfokal mikroskopi kullanılarak anti-apoptotik işaretleyici BCL2 (cholangiocytes ve hepatositler önce ve başkalaşım 13 sonrasında mevcut CK19) karaciğer hücre işaretleyici sitokeratin 19, modifiye arıtma yöntemi ve boyama birleştiren, tüm safra sistemi Z-ekseni (boyunca yakalandı Şekil 2) ve 3-boyutlu yapısı (Şekil 3) yeniden inşa edildi. Lazer tarama konfokal mikroskopi safra yollarının çoğu safra bağırsağa girer kavşak dışında karaciğer içine gömülü olduğundan sağlam karaciğer yoluyla optik bölümünü gerçekleştirmek için kullanılmıştır. Dejeneratif bir süreç merkezi büyük intrahep doğru periferik küçük safra ductules başlayarak, metamorfik aşamalarında 2-4 oluşurönceki çalışmalarda 10 ile tutarlı problemlerle ortak safra kanalı (Şekil 2).
Deniz taşemen Başkalaşım sırasında Şekil 1.. Safra kesesi dejenerasyon. Sea taşemen Başkalaşım sırasında safra kesesi (siyah oklar) kaybedersiniz. Numuneler metamorfik aşamada 2 ve 3 arasında dış morfolojisi ile hayvanlardan alınmıştır; (evre 2) olmayan veya (evre 3) iris ve gözbebeği keskin farklılaşma, ağız iç dorsal yüzeyinde belirgin papilla gibi projeksiyonlar ile yuvarlak göz yani başlık (iki kademe), ağız boşluğuna dikdörtgen bir giriş (evre 3), ya da "boksör gibi" burun (evre 3) 3 oluşturan sözlü kaputu (evre 2) ve dudakları kalınlaşmış. Safra kesesi de safra üretiminde farklılıklar gösteren rengi değişti unutmayın.I: bağırsak. L:. Karaciğer bu rakamın daha büyük bir versiyonunu görmek için buraya tıklayınız.
Şekil 2.. Başkalaşım sırasında deniz taşemen karaciğerde safra ağacını gösteren Konfokal görüntüler. Numuneler Üst paneller ön alınır. Metamorfik safhalar 2 ve 3 arasında dış morfolojisi ile hayvanlardan alınan ve arka ucundan alt paneller yapılmıştır. Karaciğer hücre işaretleyici sitokeratin 19 görüntüleri (1:100, fare-anti-CK19, 2 ug ile boyandı / ml Alexa Fluor 350 keçi-anti-fare IgG, mavi) ve anti-apoptotik işaretleyici Bcl2 (1:100 tavşan-anti- Bcl2; / ml Alexa Fluor 488-eşek-anti-tavşan IgG 2 mikrogram ile boyanmış, yeşil) birleştirilmiş görüntüler oluşturmak için bindirilmiş. Beyaz oklar b göstermektediriliary ağacı. Siyah oklar karanlık dendritik hücreleri apoptotik görünümlü ve karaciğerde kanalikül ve ductules çevreleyen gösterir. I: bağırsak. L: Karaciğer. Ölçek çubuğu:. 500 mikron , bu rakamın daha büyük bir versiyonunu görmek için buraya tıklayınız.
Birleştirilmiş konfokal z serisinin yeniden Şekil 3.. 3D görüntüler. 3D görüntüler metamorfik safhalar 2 ve 3 arasında üç karaciğerinin konfokal z-serisi yeniden inşa edildi. Karaciğer hücre işaretleyici sitokeratin 19 birleştirilmiş görüntülerin optik bölümleri (1:100 fare- anti-CK19, 2 ug / ml Alexa Fluor 350 keçi-anti-fare IgG'si ile boyandı, mavi) ve anti-apoptotik işaretleyici Bcl2 (1:100 tavşan-anti-Bcl2, 2 ug / ml Alexa Fluor 488-eşek ile boyanmış -anti-tavşan IgG; yeşil) 3D görüntüler oluşturmak için üreticinin yazılımı ile yeniden inşa edilir. Üst panel alınan ön ve arka ucundan alt panelleri vardır. Beyaz oklar safra yolları gösterir. Siyah oklar karanlık dendritik hücreleri apoptotik görünümlü ve karaciğerde kanalikül ve ductules çevreleyen gösterir. I: bağırsak. L: Karaciğer. Ölçek çubuğu:. 500 mikron , bu rakamın daha büyük bir versiyonunu görmek için buraya tıklayınız.
.. 3 floresan kanalları Şekil 4 lümeninde safra damlacıkları ile safra kanalları gösteren bir konfokal optik bölüm Birleştirilmiş görüntü; mavi: fare anti-c-Myc (1:100) / 2 ug / ml Alexa Fluor 350 keçi-anti-fare IgG; yeşil: 2 mcg / ml Nissl yeşil; Kırmızı: Tavşan anti-TGFβRII (1:100) / 2 mcg / ml Alexa Fluor 594-eşek-anti-tavşan. Ölçek çubuğu: 500 mikron. Safra damlacıklar Siyah oklar ile belirtilmiştir. Karaciğer numune metamorfik evre 2 ve 3 arasında alındı. , bu rakamın daha büyük bir versiyonunu görmek için buraya tıklayınız.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Bu protokol, nano gözenekli bir hidrojel oluşturmak üzere, poliakrilamid ile bozulmamış doku çapraz bağlar ve daha sonra optik saydamlık ve makromoleküler geçirgenliği elde etmek için doku plazma zarı uzak şeritler "açıklık" 12 olarak adlandırılan yeni bir yöntem, modifiye edilir. "BERRAKLIK" uzun menzilli projeksiyon ve sinir sisteminde yerel devre kablolama sağlam doku görüntüleme sağlar. Bu yeni yöntem, başkalaşım sırasında deniz lamprey karaciğerde tüm safra kanallarının görselleştirmek için kullanılabilmektedir. Bu yüksek çözünürlüklü bilgi edinmek ve bu tüm safra sistemi veya geleneksel gömme kullanarak ve yöntemleri kesit merkezi sinir sistemi gibi karmaşık bir sistemden, küresel bir bakış açısı sağlamak için biyolojide bir sorundur. Bu modifiye AÇIKLIK yöntem, bir lazer ışını normal bir lazer tarama confoca düşük güç floresan objektif (4x) ile 1-2 mm kalınlığa kadar sağlam deniz lamprey larva karaciğer içinden nüfuz etmesine olanak tanırl mikroskop. Daha derin nüfuz daha gelişmiş bir çoklu foton konfokal mikroskop kullanılarak elde edilebilir. Üç boyutlu görüntüleri 3 boyutlu rekonstrüksiyon yazılımı kullanılarak yeniden inşa edilebilir. Geleneksel yöntemler kullanılarak karşılaştırılabilir sonuçlar elde, zahmetli olması birçok bölümden parça parça yeniden içeren ve küçük doku hacimleri sınırlı olurdu. Bu yeni yöntem, sağlam sistemleri 12 bütün yapısal analizler değerli bilgiler sağlar, daha az emek-yoğun, daha verimli ve tekrarlanabilir.
Bu yeni yöntemin diğer bir avantajı, numune farklı antikorlarla boyama ile 12 için birden çok kez tekrar edilebilir olmasıdır. Bu durum, aynı örnekte farklı moleküler işaretlerin arasındaki karşılaştırma daha güvenilir ve tekrarlanabilir hale getirir. Hidrojel tarafından oluşturulan istikrarlı bir çerçevede ince yapısının zarar vermeden antikorların etkili bir şekilde uzaklaştırılmasını sağlar ve bir lo için antijenliğini korurng süre 12. Temizleme çözeltisi bu nedenle, bir antikor-soyma çözeltisi 12 olarak hareket eden, bağlayıcı antikorlar ve denatüre bozar. Boyama birkaç tur deniz taşemen karaciğer örneklerinde yapılmıştır ve yapısı ve boyama optimum kalmıştır.
Orijinal "CLARITY" protokol 12 Bu protokolde iki önemli değişiklikler vardır. (1) kök üretici ayıraçları (amonyum persülfat ve TEMED) yerine VA044 olan hidrojel polimerizasyonunu başlatmak ve hızlandırmak için kullanıldı. VA044 ışığa ve mevcut değil ABD (2) Hayır özel inşa elektroforez odası kullanılır olmasıdır. Dokularda (karaciğer lamprey genel fare beyni) büyüklüğüne bağlı olarak CLARITY yöntemi 12, içinde, elektroforetik doku temizleme, plazma zarının çıkarma hızlandırmak için gereklidir. Ismarlama bir elektroforez odası için başlangıç maliyeti önlemek için, biz ilk exi kullanılırLaboratuvarımızda agaroz jel elektroforez cihazları acı. Bu çok verimsiz olduğunu kanıtladı. Bununla birlikte, yükseltilmiş bir sıcaklıkta (50 ° C) ile temizleme çözeltisi içinde inkübasyon plazma zarı açıklıkta çok etkilidir.
"Açıklık" için yazarlar hidrojel saponin kullanımına karşı uyarıda de, bizim prosedürde deniz lamprey dokuda şeffaflığını iyileştirir. Konfokal görüntüleme için tek dezavantajı deniz taşemen doku güçlü otomatik floresan olmasıdır. Florofor seçimi immünofloresan boyama öncesi ve sonrası görüntü karşılaştırılarak test edilmelidir.
Deniz taşemen metamorfoz sırasında, safra kesesi epitel regresyon metamorfik aşamaları 2 ve 3 arasında başlar. Metamorfik evre 4 olarak, safra kesesi, deniz taşemen karaciğer 14 tamamen kaybolur. Safra kanalı dejenerasyon en dra olduğunumatic metamorfik evre 3 ve 4 15 arasında. Bu modifiye yöntem, insan biliyer atrezi için anlayışlar sağlayabilir tüm safra sisteminin dejenerasyonu hücresel ve moleküler mekanizmaları incelemek için güçlü bir araçtır.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Yazarlar ifşa hiçbir şey yok.
Acknowledgments
Yazarlar Hammond Bay Biyolojik İstasyonu, Great Lakes Science Center, US Geological Survey katkısını kabul. Biz de lazer tarama konfokal mikroskopi onun teknik destek için Michigan State Üniversitesi İleri Mikroskopi Merkezi'nde Dr Melinda Frame teşekkür ederim. Bu çalışma YWCD ve WML Büyük Göller Balıkçılık Komisyonu hibe tarafından desteklenmektedir.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 40% acrylamide | Bio-Rad | 161-0140 | |
| 2% bis-acrylamide | Bio-Rad | 161-0142 | |
| TEMED | Bio-Rad | 161-0800 | |
| ammonium persulfate | Sigma | A3678-25G | |
| boric acid | Sigma | B7901-1KG | |
| saponin | Sigma | 47036 | |
| sodium dodecyl sulfate | Sigma | L337-500G | |
| sodium phosphate (monobasic) | Sigma | 04269-1KG | |
| sodium phosphate (dibasic) | Sigma | S5136-1KG | |
| Triton X-100 | Sigma | X100-500ML | |
| glycerol | Sigma | G9012-500ML | |
| 16% paraformaldehyde | Electron Microscopy Sciences | 15710-S | |
| NaOH pellets | EMD | SX0590-3 | |
| 15 ml centrifuge tubes | Any brand | ||
| dissecting tools | Any brand |
References
- Applegate, V. C. Natural history of the sea lamprey (Petromyzon marinus) in Michigan. US Fish and Wildlife Service Special Science Report on Fishery Service. (55), (1950).
- Hardisty, M. W., Potter, I. C. The general biology of adult lampreys. The biology of lampreys. Hardisty, M. W., Potter, I. C. 1, New York Academic Press. 127-206 (1971).
- Youson, J. H., Potter, I. C. A description of the stages in the metamorphosis of the anadromous sea lamprey, Petromyzon marinus L. Can. J. Zool. 57, 1808-1817 (1979).
- Boomer, L. A., et al. Cholangiocyte apoptosis is an early event during induced metamorphosis in the sea lamprey, Petromyzon marinus L. J. Pediatr. Surg. 45, 114-120 (2010).
- Kasai, M., Suzuki, H., Ohashi, E., Ohi, R., Chiba, T., Okamoto, A. Technique and results of operative management of biliary atresia. World J. Surg. 2, 571-580 (1978).
- Suzuki, T., Hashimoto, T., Kondo, S., Sato, Y., Hussein, M. H. Evaluating patients’ outcome post-Kasai operation: a 19-year experience with modification of the hepatic portoenterostomy and applying a novel steroid therapy regimen. Pediatr. Surg. Int. 26, 825-830 (2010).
- Hartley, J. L., Davenport, M., Kelly, D. A. Biliary atresia. Lancet. 374, 1704-1713 (2009).
- Morecki, R., Glaser, J. H., Cho, S., Balistreri, W. F., Horwitz, M. S. Biliary atresia and reovirus type 3 infection. New Engl. J. Med. 307, 481-484 (1982).
- Shimadera, S., Iwai, N., Deguchi, E., Kimura, O., Fumino, S., Yokoyama, T. The inv mouse as an experimental model of biliary atresia. J. Pediatr. Surg. 42, 1555-1560 (2007).
- Sidon, E. W., Youson, J. H. Morphological changes in the liver of the sea lamprey, Petromyzon marinus L., during metamorphosis: I. Atresia of the bile ducts. J. Morphol. 177, 109-124 (1983).
- Yeh, C. -Y., Chung-Davidson, Y. -W., Wang, H., Li, K., Li, W. Intestinal synthesis and secretion of bile salts as an adaptation to developmental biliary atresia in the sea lamprey. Proc. Nat. Acad. Sci. U.S.A. 109, 11419-11424 (2012).
- Chung, K., et al. Structural and molecular interrogation of intact biological systems. Nature. 497, 332-337 (2013).
- Alarcón, V. B., Filosa, M. F., Youson, J. H. Cytokeratins in the liver of the sea lamprey (Petromyzon marinus) before and after metamorphosis. Cell Tissue Res. 287, 365-374 (1997).
- Youson, J. H., Ogilvie, D. R. Ultrastructural features of degeneration of the gallbladder during lamprey biliary atresia. Tissue and Cell. 22, 477-492 (1990).
- Morii, M., et al. Onset of apoptosis in the cystic duct during metamorphosis of a Japanese lamprey, Lethenteron reissneri. Anat. Rec. 293, 1155-1166 (2010).
