Summary
Mar lampreia perder a vesícula e canais biliares durante a metamorfose, um processo semelhante à atresia biliar humano. Um novo método de fixação e esclarecimento (clareza) foi modificado para visualizar toda a árvore biliar através de microscopia confocal de varredura a laser. Este método fornece uma ferramenta poderosa para o estudo degeneração biliar.
Abstract
A atresia biliar é uma doença rara da infância, com uma estimativa de 1 em 15.000 freqüência no sudeste dos Estados Unidos, mas é mais comum em países do leste asiático, com uma freqüência relatada de 1 em 5000 em Taiwan. Embora muito se sabe sobre a gestão da atresia biliar, sua patogênese ainda é indescritível. A lampreia mar (Petromyzon marinus) oferece uma oportunidade única para examinar o mecanismo e progressão da degeneração biliar. Mar lampreia desenvolver através de três fases da vida distintas: larval, parasitárias e adultos. Durante a transição de larva para juvenil parasitária, lampreia de mar sofrem metamorfose com reorganização dramática e remodelação na morfologia externa e órgãos internos. No fígado, a totalidade do sistema biliar é perdida, incluindo a vesícula biliar e das vias biliares. Um método recém-desenvolvido chamado "clareza" foi modificado para esclarecer todo o fígado e na junção com o intestino em lampreia mar metamórfica. Oprocesso de degeneração das vias biliares foi visualizado e discernir durante lampreia metamorfose mar por meio de microscopia confocal de varredura a laser. Este método fornece uma ferramenta poderosa para o estudo de atresia biliar em um modelo animal único.
Introduction
Lampreia Mar desenvolver-se através de três fases distintas de vida 1,2. Lampreia mar larval (L) passam a maior parte do tempo em tocas como filtradores bentónicos. Depois de passar por sete estágios metamórficos de mudanças dramáticas na morfologia externa e reorganização em órgãos internos 3, os juvenis resultantes (JV) entrar numa fase parasitária durante o qual eles se alimentam de sangue e fluidos de tecido de peixe hospedeiro, aumentando a massa corporal mais de 100 vezes . Depois de 1,0 a 1,5 anos se alimentando no peixe hospedeiro no mar ou grandes lagos, os adultos deixam alimentação durante o início da primavera e migram para os rios para desovar e morrer 1,2.
Durante a metamorfose, o fígado lampreia mar perde a vesícula biliar e toda a árvore biliar, um fenótipo mutante evolutivo que imita a doença bebê humano atresia biliar. Atresia biliar infantil é uma doença hepática pediátrica rara, com graves complicações médicas 4,5,6,7, 8,9,10, no entanto, a patogênese e etiologia da atresia de vias biliares são em grande parte desconhecida 4. Os pacientes com atresia biliar morrer dentro de dois anos após o nascimento, a menos que a intervenção cirúrgica (cirurgia de Kasai) é realizada 5. Posteriormente, estes pacientes necessitam de extensa gestão clínica e muitas vezes o transplante de fígado 6. Muitas teorias de etiopatogenia atresia biliar têm sido propostas, como infecção viral, malformação congênita, doença auto-imune, e insulto tóxico. No entanto, a contribuição de cada um para o desenvolvimento de atresia biliar permanece inconclusiva 7,8,9,10.
Ao contrário de crianças que sofrem atresia biliar patológico, lampreia de mar sofrem programada pelo desenvolvimento atresia biliar sem necroinflammation extensa, fibrose ou cirrose 10. Os animais podem sofrer colestase transitória durante este processo de 10, mas se adaptar a esta condição de desenvolvimentoVia de síntese de novo e secreção de sais biliares no intestino, após a atresia biliar de desenvolvimento, para além de mecanismos conhecidos, tais como a redução da síntese de sais biliares no fígado 11. Este processo de maturação na lampreia mar oferece a oportunidade única conhecida para analisar a progressão da atresia biliar.
Um método recém-desenvolvido chamado "clareza" permite imagens de alta resolução no sistema nervoso de mamíferos complexos, transformando tecido intacto em um hidrogel nanoporous opticamente transparente 12. Usando lampreia fígado mar e um protocolo CLAREZA modificado, de imagem de tecido intacto de degeneração biliar pode ser documentada em toda metamorfose fígado.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. Solução Preparação
- Adicione 1 L de 10x de 0,1 M de solução salina de tampão fosfato (PBS, pH 7,4): Pesar 26,2 g de fosfato de sódio (monobásico), fosfato de sódio a 115 g (dibásico), e 87,66 g de NaCl. Dissolver em cerca de 800 ml de H2O destilada, ajustar o pH, e trazer o volume até 1 litro com H2O destilada
- Adicione uma solução salina L 0,1 M de tampão fosfato (pH 7,4): Tome 100 ml 10x PBS, e adicionar 900 mL de H2O destilada
- Adicione 1 L de 0,1 M de tampão fosfato salino (pH 7,4) com 0,1% de Triton X-100: Tome 100 ml 10x PBS, adicionar 1 ml de Triton X-100, e trazer o volume até 1 litro com H2O destilada
- Adicione 1 L de tampão de fosfato 0,1 M de 10x (PB, pH 7,4): Pesar 26,2 g de fosfato de sódio (monobásico) e fosfato de sódio a 115 g (dibásico). Dissolver em cerca de 800 ml de H2O destilada, ajustar o pH, e trazer o volume até 1 litro com H2O destilada
- Faça 1 L de 0,1 M de tampão fosfato (pH 7,4): Tomar 100 ml 10x PB,e adicionar 900 mL de água destilada H 2 O.
- Adicione 1 L de 0,1 M de tampão fosfato (pH 7,4) com 0,1% de Triton X-100: Tome 10x 100 ml de PB, adicionar 1 ml de Triton X-100, e trazer o volume até 1 litro com H2O destilada
- Adicione 400 ml de solução de monómeros de hidrogel (4% de acrilamida, 0,25% de bis-acrilamida, paraformaldeído a 4%, 0,0075% de persulfato de amónio, 0,0005% de saponina em PBS a 0,1 M): Pesar 0,3 g de persulfato de amónio e 0,2 g de saponina. Adicionar 210 ml de H2O destilada, 40 ml de 40% de acrilamida, 10 ml de 2% de bis-acrilamida, 40 ml de 10x de PBS (pH 7,4), 100 ml de 16% de paraformaldeído, e misturar bem.
- Faça solução compensação 4 L (4% SDS em ácido bórico 0,2 M): Pesar 49,464 g de ácido bórico e 160 g SDS. Dissolve-se em cerca de 3,5 L de H2O destilada, ajustar o pH para 8,5 com NaOH, e perfazer o volume até 4 L.
- Faça 1 L solução de glicerol 80%: Medir 800 ml de glicerol, adicionar 200 ml de H 2 O destilada, e misture bem.
2. Preparação de Tecidos
- Preparar a solução de monómeros de hidrogel e uma alíquota de 10 ml a cada tubo de centrífuga de 15 ml.
- Dissecar todo o tecido e fixar no hidrogel durante 2 dias a 4 ° C. Certifique-se de que a solução de hidrogel é, pelo menos, 10 vezes o volume do tecido.
- Traga o tecido fixado hidrogel (no tubo de centrífuga de 15 ml) para um extractor de fumo.
- Polimerizar o tecido fixado hidrogel por adição de 5 ul de TEMED, misturar bem, e deixar assentar, na hotte, à temperatura ambiente durante 2-3 horas.
- Remover o excesso de gel completamente. Nota: gel extra irá dificultar o processo de compensação ea penetração de anticorpos durante a coloração.
- Incubar o tecido fixado em 10 ml de solução de compensação num agitador de incubador ajustado a 70 rpm e 50 ° C durante vários dias até que o tecido torna-se transparente. Alterar solução limpar pelo menos uma vez por dia e remover o excesso de gel a partir do tecido quando se muda a solução de compensação.
- Lavar o tecido em 10 ml de 0,1 M PB, com 0,1% de Triton X-100 a 70 rpm e 37 ° C durante a noite. Repetir esta etapa 3 vezes e remover o excesso de gel a partir do tecido quando se muda a solução tampão.
- Incubar o tecido clarificado na solução de anticorpo primário em PB com 0,1% de Triton X-100 a 70 rpm e 37 ° C durante 2 dias. Nota: Certifique-suficiente solução de anticorpo primário para submergir todo o tecido.
- Lavar o tecido em 10 ml de PB com 0,1% de Triton X-100 a 70 rpm e 37 ° C durante a noite. Repetir esta etapa 3 vezes e remover o excesso de gel a partir do tecido quando se muda a solução tampão.
- Execute as seguintes etapas em um quarto escuro ou sob luz fraca. Cubra as amostras com papel alumínio para evitar o branqueamento foto.
- Incubar o tecido clarificado com a solução de anticorpo secundário fluorescente nas PB com 0,1% de Triton X-100 e soro de bloqueio, a 70 rpm e 37 ° C durante 1 dia.
- Lavar o tecido em 10 ml de PB com 0,1% de Triton X-100 a 70 rpm e 37 ° C durante a noite. Repita este passo 3 vezes e remover o excesso de gel from o tecido quando se muda a solução tampão.
- Lavar o tecido em 10 ml de PBS, a 70 rpm e 37 ° C durante a noite. Repetir esta etapa 3 vezes e remover o excesso de gel a partir do tecido quando se muda a solução tampão.
- Incubar o tecido clarificada em 80% de glicerol, a 70 rpm e 37 ° C durante a noite.
- Armazenar o tecido manchado fluorescente, a 4 ° C antes de microscopia confocal.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Vários eventos importantes do desenvolvimento ocorrem no sistema hepatobiliar durante lampreia metamorfose mar. O ducto biliar e da vesícula biliar em apoptose e degenerado (Figura 1). Combinando o método de clarificação modificado e coloração com marcador de células de fígado de citoqueratina 19 (CK19, presente em ambas as cholangiocytes e hepatócitos, antes e após a metamorfose 13) e Bcl2 marcador anti-apoptótica utilizando microscopia confocal, todo o sistema biliar foi capturado ao longo do eixo Z ( Figura 2) e a estrutura 3-dimensional foi reconstruído (Figura 3). Microscopia confocal de varredura a laser foi utilizado para realizar secção óptica através do fígado intacto já que a maioria do sistema biliar é incorporado no interior do fígado, exceto o cruzamento onde o ducto biliar entra no intestino. O processo degenerativo ocorre em fases metamórficas 2-4, a partir de pequenos dúctulos biliares periféricas em direção ao grande centro intrahepATIC ducto biliar comum (Figura 2), de acordo com estudos anteriores 10.
Gall degeneração Figura 1. Bexiga durante a lampreia metamorfose mar lampreia do mar. Perder a vesícula biliar (setas pretas) durante a metamorfose. As amostras foram retiradas de animais com morfologia externa entre as fases metamórficas 2 e 3, ou seja, olho redondo, sem (fase 2) ou com (fase 3) diferenciação nítida de íris ea pupila, as projeções da papila-como proeminentes na superfície dorsal interna da fase oral capô (ambas as fases), lábios de capuz por via oral (fase 2), formando uma entrada retangular na cavidade oral (fase 3), ou focinho "pug-like" (fase 3) 3 engrossar. Note-se que a vesícula biliar também mudou de cor, indicando diferenças na produção de bile.I: intestino. L:. Fígado Por favor, clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 2. Imagens confocal mostrando a árvore biliar no fígado lampreia mar durante a metamorfose. As amostras foram tomadas a partir de animais com morfologia externa entre as fases metamórfica 2 e 3. Top painéis são tomadas a partir da anterior, e os painéis inferiores da extremidade posterior. Imagens de fígado marcador de células citoqueratina 19 (1:100 rato-anti-CK19; coradas com 2 ug / ml de Alexa Fluor 350 anticorpo de cabra anti-IgG de ratinho; azul) e marcador de anti-apoptótica Bcl2 (1:100 de coelho-anti- Bcl2; corados com 2 mg / ml de IgG Alexa Fluor 488-burro-anti-coelho; verde) são sobrepostos para gerar as imagens mescladas. As setas brancas indicam a bárvore iliary. Setas pretas indicam o dendrítica escuro olhando células em apoptose e em torno canalículos e dúctulos no fígado. I: intestino. L: fígado. Barra de escala:. 500 mm Por favor, clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 3. Imagens 3D reconstruídas a partir de fusão confocal z-series. Imagens 3D foram reconstruídos a partir do z-series confocal de três fígados entre os estágios metamórficos 2 e 3. Seções ópticas de imagens fundidas de fígado marcador de células citoqueratina 19 (1:100 do mouse anti-CK19; coradas com 2 ug / ml de Alexa Fluor 350 anticorpo de cabra anti-IgG de ratinho; azul) e marcador de anti-apoptótica Bcl2 (1:100 de coelho-anti-Bcl2; coradas com 2 ug / ml de Alexa Fluor 488-burro -anti-IgG de coelho; verde) são reconstruídos com o software do fabricante para gerar as imagens em 3D. Painéis de topo são tomadas a partir da anterior, e os painéis inferiores da extremidade posterior. As setas brancas indicam a árvore biliar. Setas pretas indicam o dendrítica escuro olhando células em apoptose e em torno canalículos e dúctulos no fígado. I: intestino. L: fígado. Barra de escala:. 500 mm Por favor, clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
.. Figura 4 A secção óptica confocal mostrando ductos biliares com gotas biliares no lúmen imagem mesclada de 3 canais fluorescentes; azul: rato-anti-c-Myc (1:100) / 2 ug / ml de Alexa Fluor 350 anticorpo de cabra anti-IgG de ratinho; verde: 2 mg / ml verde Nissl; Vermelho: De coelho anti-TGFβRII (1:100) / 2 ug / ml de Alexa Fluor 594-burro anti-coelho. Barra de escala: 500 mm. Gotículas biliares são indicadas por setas negras. A amostra de fígado foi tomada entre fase metamórfica 2 e 3. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Este protocolo modificado a partir de um novo método denominado "clareza" 12, que reticula tecido intacto com poliacrilamida para formar um hidrogel nanoporoso, e depois tira da membrana plasmática de tecidos para alcançar a transparência óptica e a permeabilidade de macromoléculas. "Clareza" permite imagens de tecidos intactos de projeção de longo alcance e fiação do circuito local no sistema nervoso. Este novo método pode ser usado para visualizar todo o sistema biliar no fígado lampreia mar durante a metamorfose. É um desafio em biologia para obter informações de alta resolução e manter a perspectiva global de um sistema complexo, como todo o sistema biliar ou do sistema nervoso central através de incorporação convencional e seccionamento métodos. Este método CLAREZA modificado permite que um feixe de laser para penetrar através da lampreia mar fígado larval intacto até uma espessura de 1 a 2 mm com objetivo fluorescente de baixa potência (4x) em um confoca varredura a laser normall microscópio. Penetração mais profunda pode ser conseguida utilizando um multi-fotão microscópio confocal mais avançada. Imagens tridimensionais pode ser reconstruído usando software de reconstrução 3D. Alcançar resultados comparáveis usando métodos convencionais seria trabalhoso, que envolve a reconstrução gradual de muitas seções, e seria limitada a pequenos volumes de tecido. Este novo método fornece informações valiosas a partir de análises estruturais inteiras de sistemas intactos 12, é menos trabalhoso, mais eficiente e reprodutível.
Outra vantagem deste novo método é que o modelo pode ser reutilizado várias vezes para coloração com diferentes anticorpos 12. Isso faz com que a comparação entre os diferentes marcadores moleculares no mesmo espécime mais confiável e reprodutível. O quadro estável gerada por hidrogel permite a remoção eficaz de anticorpos sem danos de estrutura fina e mantém a antigenicidade de uma long tempo 12. A solução de limpeza desnatura anticorpos e rompe de ligação, portanto, na qualidade de uma solução de extracção de anticorpos 12. Vários ciclos de coloração foram realizados nas amostras de fígado lampreia mar e a estrutura e coloração permaneceu óptima.
Existem duas grandes modificações neste protocolo a partir do original "clareza" protocolo 12. (1) os reagentes de geração de radicais livres (de persulfato de amónio e TEMED) foram utilizadas para iniciar e acelerar a polimerização do hidrogel, em vez de VA044. VA044 é fotossensível e não está disponível em os EUA (2) Não câmara de eletroforese custom-built é usado. No método Clareza 12, devido ao tamanho dos tecidos do cérebro do rato (vs lampreia fígado), o tecido de compensação por electroforese é necessária para acelerar a extracção da membrana do plasma. Para evitar o custo inicial para uma câmara de eletroforese custom-built, usamos primeiro exipicar dispositivos de eletroforese em gel de agarose em nosso laboratório. Isto provou ser muito ineficiente. No entanto, a incubação na solução de compensação com temperatura elevada (50 ° C) é muito eficaz na eliminação da membrana plasmática.
Embora os autores de "clareza" advertiu contra o uso de saponina no hidrogel, melhora a transparência do tecido lampreia do mar em nosso procedimento. Uma desvantagem para imagem confocal é que o tecido lampreia do mar tem uma forte auto-fluorescência. A escolha dos fluoróforos deve ser avaliada pela comparação das imagens antes e após a coloração imunofluorescente.
Durante lampreia metamorfose mar, a regressão do epitélio da vesícula biliar começa entre as fases metamórficas 2 e 3. Ao fase metamórfica 4, a vesícula biliar desaparece totalmente a partir de lampreia mar fígado 14. Degeneração do ducto biliar é mais dramatic entre as fases metamórficas 3 e 4 15. Este método modificado é uma ferramenta poderosa para estudar os mecanismos celulares e moleculares da degeneração de todo o sistema biliar, o que pode fornecer insights para atresia biliar humano.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Os autores não têm nada a revelar.
Acknowledgments
Os autores reconhecem a contribuição da Estação Biológica Hammond Bay, Great Lakes Science Center, EUA Geological Survey. Agradecemos também a Dr. Melinda quadro do Centro de Microscopia Avançada na Universidade Estadual de Michigan pelo apoio técnico em microscopia confocal de varredura a laser. Este estudo é suportado por concessões do Great Lakes Comissão das Pescas para YWCD e WML.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 40% acrylamide | Bio-Rad | 161-0140 | |
| 2% bis-acrylamide | Bio-Rad | 161-0142 | |
| TEMED | Bio-Rad | 161-0800 | |
| ammonium persulfate | Sigma | A3678-25G | |
| boric acid | Sigma | B7901-1KG | |
| saponin | Sigma | 47036 | |
| sodium dodecyl sulfate | Sigma | L337-500G | |
| sodium phosphate (monobasic) | Sigma | 04269-1KG | |
| sodium phosphate (dibasic) | Sigma | S5136-1KG | |
| Triton X-100 | Sigma | X100-500ML | |
| glycerol | Sigma | G9012-500ML | |
| 16% paraformaldehyde | Electron Microscopy Sciences | 15710-S | |
| NaOH pellets | EMD | SX0590-3 | |
| 15 ml centrifuge tubes | Any brand | ||
| dissecting tools | Any brand |
References
- Applegate, V. C. Natural history of the sea lamprey (Petromyzon marinus) in Michigan. US Fish and Wildlife Service Special Science Report on Fishery Service. (55), (1950).
- Hardisty, M. W., Potter, I. C. The general biology of adult lampreys. The biology of lampreys. Hardisty, M. W., Potter, I. C. 1, New York Academic Press. 127-206 (1971).
- Youson, J. H., Potter, I. C. A description of the stages in the metamorphosis of the anadromous sea lamprey, Petromyzon marinus L. Can. J. Zool. 57, 1808-1817 (1979).
- Boomer, L. A., et al. Cholangiocyte apoptosis is an early event during induced metamorphosis in the sea lamprey, Petromyzon marinus L. J. Pediatr. Surg. 45, 114-120 (2010).
- Kasai, M., Suzuki, H., Ohashi, E., Ohi, R., Chiba, T., Okamoto, A. Technique and results of operative management of biliary atresia. World J. Surg. 2, 571-580 (1978).
- Suzuki, T., Hashimoto, T., Kondo, S., Sato, Y., Hussein, M. H. Evaluating patients’ outcome post-Kasai operation: a 19-year experience with modification of the hepatic portoenterostomy and applying a novel steroid therapy regimen. Pediatr. Surg. Int. 26, 825-830 (2010).
- Hartley, J. L., Davenport, M., Kelly, D. A. Biliary atresia. Lancet. 374, 1704-1713 (2009).
- Morecki, R., Glaser, J. H., Cho, S., Balistreri, W. F., Horwitz, M. S. Biliary atresia and reovirus type 3 infection. New Engl. J. Med. 307, 481-484 (1982).
- Shimadera, S., Iwai, N., Deguchi, E., Kimura, O., Fumino, S., Yokoyama, T. The inv mouse as an experimental model of biliary atresia. J. Pediatr. Surg. 42, 1555-1560 (2007).
- Sidon, E. W., Youson, J. H. Morphological changes in the liver of the sea lamprey, Petromyzon marinus L., during metamorphosis: I. Atresia of the bile ducts. J. Morphol. 177, 109-124 (1983).
- Yeh, C. -Y., Chung-Davidson, Y. -W., Wang, H., Li, K., Li, W. Intestinal synthesis and secretion of bile salts as an adaptation to developmental biliary atresia in the sea lamprey. Proc. Nat. Acad. Sci. U.S.A. 109, 11419-11424 (2012).
- Chung, K., et al. Structural and molecular interrogation of intact biological systems. Nature. 497, 332-337 (2013).
- Alarcón, V. B., Filosa, M. F., Youson, J. H. Cytokeratins in the liver of the sea lamprey (Petromyzon marinus) before and after metamorphosis. Cell Tissue Res. 287, 365-374 (1997).
- Youson, J. H., Ogilvie, D. R. Ultrastructural features of degeneration of the gallbladder during lamprey biliary atresia. Tissue and Cell. 22, 477-492 (1990).
- Morii, M., et al. Onset of apoptosis in the cystic duct during metamorphosis of a Japanese lamprey, Lethenteron reissneri. Anat. Rec. 293, 1155-1166 (2010).
