Summary
Море минога потерять желчный пузырь и желчные протоки во время метаморфоза, процесс, аналогичный атрезия желчных путей человека. Новый фиксация и метод разъяснения (ясность) был изменен, чтобы визуализировать весь желчевыводящих путей с помощью лазерной сканирующей конфокальной микроскопии. Этот метод представляет собой мощный инструмент для изучения желчных вырождение.
Abstract
Атрезия желчевыводящих путей является редким заболеванием младенчества, по оценкам, 1 в 15 000 частоты в юго-восточной США, но чаще встречается у стран Восточной Азии, с отчетным частотой 1 на 5000 в Тайване. Хотя многое известно об управлении атрезия желчных путей, его патогенез до сих пор не удается. Море минога (Petromyzon Маринус) предоставляет уникальную возможность изучить механизм и прогрессирование желчных дегенерации. Море минога развивать через три различных стадиях жизни: личинок, паразитарных и взрослых. Во время перехода от личинок паразитических несовершеннолетнего, море минога претерпевают метаморфоз с драматическим реорганизации и реконструкции в внешней морфологии и внутренних органов. В печени, весь билиарной системы теряется, в том числе желчного пузыря и желчных протоков. Недавно разработанный метод называется "Clarity" был изменен, чтобы уточнить всю печень и слияния с кишечника в метаморфических моря миноги.Процесс желчных дегенерации визуализировали и различить во моря миноги метаморфозы с помощью лазерной сканирующей конфокальной микроскопии. Этот метод представляет собой мощный инструмент для изучения атрезия желчных путей в уникальном животной модели.
Introduction
Море минога развивать через три различных этапам жизни 1,2. Личинок морского минога (L) проводят больше всего времени в норах, как донных фильтраторов. Пройдя через семь метаморфических этапов драматических изменений во внешней морфологии и реорганизации в внутренних органов 3, в результате несовершеннолетние (СП) введите паразитический этап, в течение которого они питаются кровью и тканевой жидкости из рыбы-хозяина, увеличивая массы тела более чем в 100 раз . После 1,0 до 1,5 лет, питающихся рыбы-хозяина в океане или крупных озер, взрослые перестают кормление во время ранней весной и мигрируют в реки на нерест, а потом умирают 1,2.
Во время метаморфоза, море минога печени теряет желчный пузырь и весь желчных дерево, эволюционный мутантный фенотип, который имитирует человеческие болезни младенец атрезия желчных путей. Младенческая атрезия желчных путей является редким детской болезнью печени с тяжелыми осложнениями 4,5,6,7, 8,9,10, однако патогенез и этиология атрезия желчных путей в значительной степени неизвестны 4. Пациенты с атрезия желчных путей умирают в течение двух лет после рождения, если хирургическое вмешательство (процедура Касаи) не выполняется 5. Впоследствии, эти пациенты требуют обширного клинического ведения и часто трансплантации печени 6. Многие теории атрезия желчных путей этиопатогенезе были предложены, например, вирусной инфекции, врожденных пороков развития, аутоиммунного заболевания, и токсичных оскорбление. Тем не менее, вклад каждого в развитие атрезия желчных путей остаются неубедительными 7,8,9,10.
В отличие от детей, которые страдают патологической атрезия желчных путей, море минога подвергаются умственно запрограммирован атрезия желчных путей без обширного некротического воспаления, фиброза или цирроза 10. Животные могут страдать переходных холестаз во время этого процесса 10, но адаптироваться к этому условию развитияDe Novo через синтез и секрецию солей желчных кислот в кишечнике после развития желчных атрезии, в дополнение к известных механизмов, таких как снижение синтеза желчных солей в печени 11. Это развития процесса в морской миноги предоставляет единственный известный возможность изучить прогрессирование атрезия желчных путей.
Недавно разработанный метод называется "Clarity" позволяет с высоким разрешением изображения в сложных млекопитающих нервной системы путем трансформации неповрежденной ткани в оптически прозрачной нанопористой гидрогеля 12. Использование море печень миноги и модифицированный протокол ясности нетронутыми тканей визуализации желчевыводящих дегенерации может быть документированы в течение метаморфоза печени.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. Подготовка решения
- Сделать 1 л 10x 0,1 М фосфатный буфер солевой раствор (PBS, рН 7,4): Взвешивают 26,2 г фосфата натрия (одноосновного), 115 г фосфата натрия (двухосновный) и 87,66 г NaCl. Растворите в около 800 мл дистиллированной H 2 O, отрегулировать рН и довести объем до 1 л дистиллированной H 2 O.
- Сделать 1 л 0,1 М фосфатного буфера растворе (рН 7,4): Возьмите 100 мл 10x PBS и добавьте 900 мл дистиллированной H 2 O.
- Сделать 1 л 0,1 М фосфатного буфера растворе (рН 7,4) с 0,1% Тритон Х-100: Возьмите 100 мл 10x PBS, добавить 1 мл Тритон Х-100, и довести объем до 1 л дистиллированной H 2 O.
- Сделать 1 L 10x 0,1 М фосфатного буфера (PB, рН 7,4): Взвесить 26,2 фосфат г натрия (одноосновный) и 115 фосфат г натрия (двухосновный). Растворите в около 800 мл дистиллированной H 2 O, отрегулировать рН и довести объем до 1 л дистиллированной H 2 O.
- Сделать 1 L 0,1 М фосфатный буфер (рН 7,4): Возьмите 100 мл 10x PB,и добавить 900 мл дистиллированной H 2 O.
- Сделать 1 L 0,1 М фосфатный буфер (рН 7,4) с 0,1% Triton X-100: Возьмите 100 мл 10x PB, добавить 1 мл Тритон Х-100, и довести объем до 1 л дистиллированной H 2 O.
- Сделать 400 мл гидрогель мономерного раствора (4% акриламида, 0,25% бис-акриламида, 4% параформальдегид, 0,0075% персульфат аммония, 0,0005% сапонина в 0,1 М PBS): Взвешивают 0,3 г персульфата аммония и 0,2 г сапонин. Добавить 210 мл дистиллированной H 2 O, 40 мл 40% акриламида, 10 мл 2% бис-акриламида, 40 мл 10x PBS (рН 7,4), 100 мл 16% параформальдегид, и хорошо перемешать.
- Сделать 4 L клиринговой решение (4% SDS в 0,2 М борной кислоты): Взвесить 49,464 г борной кислоты и 160 г SDS. Растворите в 3,5 л дистиллированной H 2 O, отрегулировать рН до 8,5 с помощью NaOH, и довести объем до 4 L.
- Сделать 1 л 80%-ного раствора глицерина: Измерьте 800 мл глицерина, добавить 200 мл дистиллированной H 2 O, и хорошо перемешать.
2. Подготовка ткани
- Подготовка гидрогеля раствор мономера и аликвоты 10 мл к каждому 15 мл центрифужную пробирку.
- Проанализируйте всю ткань и закрепить в гидрогеля в течение 2 дней при 4 ° С. Убедитесь, что гидрогель решение, по крайней мере в 10 раз объем ткани.
- Принесите гидрогеля фиксированную ткани (в 15 мл трубки центрифуги), чтобы вытяжной шкаф.
- Полимеризации гидрогеля фиксированную ткань, добавив 5 мкл TEMED, хорошо перемешать, и пусть сидят в вытяжной шкаф при комнатной температуре в течение 2-3 часов.
- Снимите лишний гель тщательно. Примечание: Очень гель будет препятствовать процесса клиринга и проникновение антител во время окрашивания.
- Инкубируйте фиксированную ткани в 10 мл очистке раствора в инкубаторе шейкере при 70 оборотах в минуту и 50 ° С в течение нескольких дней, пока ткань не станет прозрачным. Изменение координационного решение, по крайней мере один раз в день и удалить избыток гель из ткани при изменении клиринговой решение.
- Промыть ткань в 10 мл 0,1 М PB с 0,1% Triton X-100 в 70 гм. и 37 ° С в течение ночи. Повторите этот шаг 3 раза и удалить избыток гель из ткани при изменении буферный раствор.
- Инкубируйте осветленной ткани в первичном раствора антител в ПК с 0,1% Triton X-100 при 70 оборотах в минуту и 37 ° С в течение 2 дней. Примечание: Оставьте достаточно решение первичного антитела, чтобы погрузить весь ткани.
- Промыть ткань в 10 мл PB с 0,1% Triton X-100 при 70 оборотах в минуту и температуре 37 ° С в течение ночи. Повторите этот шаг 3 раза и удалить избыток гель из ткани при изменении буферный раствор.
- Выполните следующие действия в темной комнате или при слабом освещении. Обложка образцов с фольгой, чтобы предотвратить просмотром отбеливание.
- Инкубируйте осветленной ткани с флуоресцентным вторичного раствора антител в ПК с 0,1% тритона Х-100 и блокирующего сыворотки при 70 оборотах в минуту и 37 ° С в течение 1 дня.
- Промыть ткань в 10 мл PB с 0,1% Triton X-100 при 70 оборотах в минуту и температуре 37 ° С в течение ночи. Повторите этот шаг 3 раза и удалить избыток геля еПЗУ ткани при изменении буферный раствор.
- Промыть ткань в 10 мл PBS при 70 оборотах в минуту и температуре 37 ° С в течение ночи. Повторите этот шаг 3 раза и удалить избыток гель из ткани при изменении буферный раствор.
- Инкубируйте осветленной ткани в 80% глицерине при 70 оборотах в минуту и температуре 37 ° С в течение ночи.
- Хранить флуоресцентный окрашенных тканей при 4 ° С до конфокальной микроскопии.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Несколько важных событий развития происходят в гепатобилиарной системы во время морской миноги метаморфозы. Желчных протоков и желчного пузыря подвергаются апоптозу и вырождаются (рис. 1). Объединение модифицированный метод осветления и окрашивания с печени клеточных маркеров цитокератина 19 (CK19, присутствующих в обеих холангиоцитах и гепатоцитов до и после метаморфозы 13) и антиапоптотического маркера Bcl2 помощью конфокальной микроскопии, весь желчной системы был захвачен по Z-оси ( Рисунок 2) и 3-мерная структура была реконструирована (рис. 3). Лазерной сканирующей конфокальной микроскопии для выполнения оптический разрез интактной печени, так как большинство билиарной системы встроен в печени за исключением стыке, где желчный проток поступает в кишечник. Дегенеративный процесс происходит в метаморфических этапов 2-4, начиная с периферийных малых протоков желчных к центральной большой intrahepATIC общий желчный проток (рис. 2), в соответствии с более ранних исследованиях 10.
Дегенерация пузыря Рисунок 1. Галль во моря миноги метаморфозы. Море минога потерять желчный пузырь (черные стрелки) во время метаморфоза. Образцы были взяты из животных с внешней морфологии между метаморфических этапов 2 и 3; т.е. круглый глаз без (2 этап) или с (этап 3) резкая дифференциация радужной оболочки и зрачка, видных сосочков выростов на внутренней спинной поверхности полости рта капот (обе ступени), утолщенные губы устной капотом (2 этап), образующие прямоугольную вход в полости рта (этап 3), или "мопс как" морда (этап 3) 3. Обратите внимание, что желчный пузырь также изменил цвет, указывающий различия в желчи.Я: кишечник. L:. Печени Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть увеличенную версию этой фигуры.
Рисунок 2. Конфокальные изображения, показывающие желчных протоков в море миноги печени во время метаморфоза. Образцы были взяты из животных с внешней морфологии между метаморфических этапов 2 и 3. Лучшие панели взяты из передней, а нижние панели из заднего конца. Изображения печени клеточных маркеров цитокератина 19 (1:100 мышиного антитела CK19; окрашивали 2 мкг / мл Alexa Fluor 350-коза-анти-мышь IgG, синий) и антиапоптотического маркер Bcl2 (1:100 кролик-анти- Bcl2; окрашивали 2 мкг / мл Alexa Fluor 488-осла против кроличьего IgG, зеленый) накладываются генерировать объединенные изображения. Белые стрелки указывают бiliary дерево. Черные стрелки указывают темную дендритную глядя апоптоза клеток и окружающей канальцы и протоков в печени. Я: кишечник. L: печени. Шкала бар:. 500 мкм Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть увеличенную версию этой фигуры.
Рисунок 3. 3D изображения реконструированных из объединенной конфокальной Z-серии. 3D изображения были реконструированы с конфокальной Z-серии из трех печени между метаморфических этапов 2 и 3. Оптические разделы объединенных изображений печени клеточных маркеров цитокератина 19 (1:100 мыши анти-CK19; окрашивали 2 мкг / мл Alexa Fluor 350-козьим-анти-мыши IgG, синий) и антиапоптотического маркер Bcl2 (1:100 кролик-анти-Bcl2; окрашивали 2 мкг / мл Alexa Fluor 488-осел -анти-кролика IgG; зеленый) реконструируются с программным обеспечением производителя, чтобы генерировать 3D-изображений. Главные панели взяты из передней, а нижние панели из заднего конца. Белые стрелки указывают желчных протоков. Черные стрелки указывают темную дендритную глядя апоптоза клеток и окружающей канальцы и протоков в печени. Я: кишечник. L: печени. Шкала бар:. 500 мкм Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть увеличенную версию этой фигуры.
.. Рисунок 4 конфокальной оптической сечение, показывающее желчные протоки с желчными капель в просвете объединенного изображения от 3 флуоресцентных каналов; синий: мышь-анти-с-Myc (1:100) / 2 мкг / мл Alexa Fluor 350-козел-анти-мышь IgG; зеленый: 2 мкг / мл Нисслю зеленый; Красный: Кролик-анти-TGFβRII (1:100) / 2 мкг / мл Alexa Fluor 594-осла анти-кролик. Шкала бар: 500 мкм. Капли желчи, обозначены черными стрелками. Образец печени было принято между метаморфических стадии 2 и 3. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть увеличенную версию этой фигуры.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Этот протокол изменение от нового метода, называемого "ясности" 12, который сшивает интактной ткани с полиакриламида с образованием гидрогеля нанопористого, а затем убирает плазматическую мембрану ткани для достижения оптической прозрачности и макромолекул проницаемость. "Ясность" позволяет нетронутыми тканей визуализации проекции на большие расстояния и местного проводки цепи в нервной системе. Этот новый метод может быть использован для визуализации всей желчной системы в море миноги печени во время метаморфоза. Это вызов в биологии для получения информации с высоким разрешением и поддерживать глобальную перспективу от сложной системы, такие как всей желчной системы или центральной нервной системы с использованием обычного вложение и секционирования методы. Этот модифицированный метод позволяет ЯСНОСТЬ лазерный луч, чтобы проникнуть через неповрежденную морской миноги личиночной печени до толщины от 1 до 2 мм с помощью малой мощности люминесцентной цели (4x) в обычной лазерной сканирующей confocaл микроскоп. Более глубокое проникновение может быть достигнуто с помощью более совершенной многофотонной конфокальной микроскопии. Трехмерные изображения могут быть восстановлены с использованием 3D программного обеспечения восстановления. Достижение сопоставимые результаты с использованием традиционных методов будет трудоемким, с участием частям реконструкцию многих участках, и будет ограничено объемов малых ткани. Этот новый метод позволяет получить ценную информацию из цельных структурного анализа интактных систем 12, является менее трудоемким, более эффективным и воспроизводимым.
Еще одним преимуществом этого нового метода является то, что образец может быть повторно использован многократно для окрашивания различных антител 12. Это делает сравнение между различными молекулярными маркерами в том же образце более надежным и воспроизводимым. Стабильная база порожденная гидрогеля позволяет эффективное удаление антител без тонкой повреждения структуры и поддерживает антигенность для лонг время 12. Решение очистка денатурирует антител и нарушает обязательные, поэтому выступает в качестве раствора антител зачистки 12. Несколько раундов окрашивания были выполнены в образцах печени море миноги и структура и окрашивание оставался оптимальным.
Есть два основных изменения в этом протоколе от оригинальной "Clarity" протокола 12. (1), генерирующего свободные радикалы реагенты (персульфат аммония и TEMED) были использованы для инициирования и ускорения полимеризации гидрогеля вместо VA044. VA044 является светочувствительным и не доступны в США (2) Нет на заказ камера для электрофореза не используется. В методе ЯСНОСТИ 12, в связи с размером тканях (мозга мыши против миноги печени), очистка электрофоретическая ткани требуется ускорить добычу плазменной мембране. Чтобы избежать первоначальную стоимость для заказного камеру электрофореза, мы впервые использовали EXiжала Электрофорез в агарозном геле устройства в нашей лаборатории. Это оказалось очень неэффективно. Однако инкубационный в клиринговый раствора с повышенной температуре (50 ° C) является очень эффективным в расчистке плазматическую мембрану.
Хотя авторы для "Clarity" предостерег против использования сапонина в гидрогеля, это улучшает прозрачность в море миноги ткани в нашей процедуры. Один недостаток для конфокальной микроскопии является морским минога ткань имеет сильное авто-флуоресценции. Выбор флуорофоров должна быть проверена путем сравнения изображения до и после иммунофлуоресцентного окрашивания.
Во время морской миноги метаморфозы, регрессия эпителия желчного пузыря начинается между метаморфических этапов 2 и 3. Метаморфическими 4-й стадии, желчный пузырь исчезает полностью из морской миноги печени 14. Желчных протоков дегенерация является самым драхор между метаморфических этапов 3 и 4 15. Этот модифицированный метод является мощным инструментом для изучения клеточных и молекулярных механизмов дегенерации всей желчной системы, которые могут дать представление для атрезия желчных путей человека.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Авторы не имеют ничего раскрывать.
Acknowledgments
Авторы признают вклад Хаммонд Bay биологической станции, Научный центр Great Lakes, Геологическая служба США. Мы также благодарим д-р Мелинда кадр в Центре перспективных микроскопии Мичиганского университета за ее техническую поддержку в лазерной сканирующей конфокальной микроскопии. Это исследование поддержано грантами от Великих озер комиссии по рыболовству в YWCD и WML.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 40% acrylamide | Bio-Rad | 161-0140 | |
| 2% bis-acrylamide | Bio-Rad | 161-0142 | |
| TEMED | Bio-Rad | 161-0800 | |
| ammonium persulfate | Sigma | A3678-25G | |
| boric acid | Sigma | B7901-1KG | |
| saponin | Sigma | 47036 | |
| sodium dodecyl sulfate | Sigma | L337-500G | |
| sodium phosphate (monobasic) | Sigma | 04269-1KG | |
| sodium phosphate (dibasic) | Sigma | S5136-1KG | |
| Triton X-100 | Sigma | X100-500ML | |
| glycerol | Sigma | G9012-500ML | |
| 16% paraformaldehyde | Electron Microscopy Sciences | 15710-S | |
| NaOH pellets | EMD | SX0590-3 | |
| 15 ml centrifuge tubes | Any brand | ||
| dissecting tools | Any brand |
References
- Applegate, V. C. Natural history of the sea lamprey (Petromyzon marinus) in Michigan. US Fish and Wildlife Service Special Science Report on Fishery Service. (55), (1950).
- Hardisty, M. W., Potter, I. C. The general biology of adult lampreys. The biology of lampreys. Hardisty, M. W., Potter, I. C. 1, New York Academic Press. 127-206 (1971).
- Youson, J. H., Potter, I. C. A description of the stages in the metamorphosis of the anadromous sea lamprey, Petromyzon marinus L. Can. J. Zool. 57, 1808-1817 (1979).
- Boomer, L. A., et al. Cholangiocyte apoptosis is an early event during induced metamorphosis in the sea lamprey, Petromyzon marinus L. J. Pediatr. Surg. 45, 114-120 (2010).
- Kasai, M., Suzuki, H., Ohashi, E., Ohi, R., Chiba, T., Okamoto, A. Technique and results of operative management of biliary atresia. World J. Surg. 2, 571-580 (1978).
- Suzuki, T., Hashimoto, T., Kondo, S., Sato, Y., Hussein, M. H. Evaluating patients’ outcome post-Kasai operation: a 19-year experience with modification of the hepatic portoenterostomy and applying a novel steroid therapy regimen. Pediatr. Surg. Int. 26, 825-830 (2010).
- Hartley, J. L., Davenport, M., Kelly, D. A. Biliary atresia. Lancet. 374, 1704-1713 (2009).
- Morecki, R., Glaser, J. H., Cho, S., Balistreri, W. F., Horwitz, M. S. Biliary atresia and reovirus type 3 infection. New Engl. J. Med. 307, 481-484 (1982).
- Shimadera, S., Iwai, N., Deguchi, E., Kimura, O., Fumino, S., Yokoyama, T. The inv mouse as an experimental model of biliary atresia. J. Pediatr. Surg. 42, 1555-1560 (2007).
- Sidon, E. W., Youson, J. H. Morphological changes in the liver of the sea lamprey, Petromyzon marinus L., during metamorphosis: I. Atresia of the bile ducts. J. Morphol. 177, 109-124 (1983).
- Yeh, C. -Y., Chung-Davidson, Y. -W., Wang, H., Li, K., Li, W. Intestinal synthesis and secretion of bile salts as an adaptation to developmental biliary atresia in the sea lamprey. Proc. Nat. Acad. Sci. U.S.A. 109, 11419-11424 (2012).
- Chung, K., et al. Structural and molecular interrogation of intact biological systems. Nature. 497, 332-337 (2013).
- Alarcón, V. B., Filosa, M. F., Youson, J. H. Cytokeratins in the liver of the sea lamprey (Petromyzon marinus) before and after metamorphosis. Cell Tissue Res. 287, 365-374 (1997).
- Youson, J. H., Ogilvie, D. R. Ultrastructural features of degeneration of the gallbladder during lamprey biliary atresia. Tissue and Cell. 22, 477-492 (1990).
- Morii, M., et al. Onset of apoptosis in the cystic duct during metamorphosis of a Japanese lamprey, Lethenteron reissneri. Anat. Rec. 293, 1155-1166 (2010).
