Étude de l'ADN Looping par une seule molécule FRET
Summary
Cette étude présente une procédure expérimentale détaillée pour mesurer la dynamique de boucle d'ADN double-brin en utilisant une seule molécule Fluorescence Resonance Energy Transfer (FRET). Le protocole décrit également comment extraire la densité de probabilité boucle appelée facteur de J.
Abstract
La flexion de l'ADN double brin (ADNdb) est associée à de nombreux processus biologiques importants tels que la reconnaissance protéine-ADN et ADN emballage dans des nucléosomes. Thermodynamique de l'ADN double brin de flexion a été étudiée par une méthode dite de cyclisation qui repose sur l'ADN ligase pour joindre de manière covalente des extrémités cohésives courtes d'un ADN double brin. Cependant, l'efficacité de la ligature peut être affectée par de nombreux facteurs qui ne sont pas liés à ADN double brin boucle comme la structure de l'ADN entourant les extrémités collantes jointes, et ligase peut également affecter le taux de boucle apparente à travers des mécanismes tels que la liaison non spécifique. Ici, nous montrons comment mesurer dsADN cinétique de boucle sans ligase en détectant transitoire formation de boucle d'ADN par FRET (Fluorescence Resonance Energy Transfer). les molécules d'ADNdb sont construites en utilisant un protocole simple basé sur la PCR avec une paire de FRET et une séquence de liaison à la biotine. La densité de probabilité de boucle connue comme le facteur J est extrait à partir de la vitesse en boucle et le taux d'hybridation entre deux déconnexionextrémités cohésives TED. En testant deux dsDNAs avec des courbures différentes intrinsèques, on montre que le facteur de J est sensible à la forme intrinsèque de l'ADN double brin.
Introduction
Comprendre les propriétés mécaniques des ADN double brin est d'une importance fondamentale dans les sciences fondamentales et les applications d'ingénierie. La structure de l'ADN bicaténaire est plus compliqué que d'une échelle hélicoïdale droite parce angles roulis, d'inclinaison et de torsion entre les paires de base successives peuvent varier en fonction de la séquence. Fluctuations thermiques peuvent provoquer des ADN double brin à subir divers modes de fluctuations conformationnelles telles que la flexion, de torsion et d'étirement. Transitions comme la fonte et de déformation peuvent également se produire dans des conditions extrêmes.
Parmi ces propositions, ADNds flexion a l'impact le plus notable biologique 1. ADNdb flexion est associée à la répression ou l'activation de gènes en amenant deux sites distants proches les uns des autres. Il joue également un rôle important dans l'emballage de l'ADN à l'intérieur du noyau de la cellule ou une capside virale. Déformation en flexion de l'ADN bicaténaire peut être visualisée expérimentalement par microscopie à haute résolution (AFM 2 et 3 TEM), et la ThermodynAmics et cinétique peuvent être étudiés par des analyses en boucle, qui relient des sites chimiquement juxtaposés de l'ADN double brin.
Un tel dosage est une ligase dépendante cyclisation 4. Dans ce dosage, les molécules ADN double brin avec des extrémités collantes "cohésives" () sont circularisées ou dimérisés par l'ADN ligase. En comparant les taux de cercle et la formation de dimère, on peut obtenir une concentration molaire efficace d'une extrémité de l'ADN dans le voisinage de l'autre extrémité, qui est connu comme le facteur de J. Ce facteur de J est dimensionnellement équivalente à la densité de probabilité de trouver une extrémité de l'ADN à une courte distance de l'autre extrémité, et reflète ainsi la flexibilité de l'ADN. Mesurer le facteur de J en fonction de la longueur de l'ADN révèle de nombreuses caractéristiques de la mécanique d'ADN dont la longueur de persistance 4,5.
La chaîne de ver (WLC) modèle a été largement considéré comme le modèle de polymère canonique pour la mécanique ADN double brin sur la base de son succès dans explicationining les courbes force-extension obtenus dans l'ADN tirant expériences 6 et prédire correctement les facteurs de J dsDNAs plus de 200 pb 7. Cependant, en utilisant l'essai de cyclisation de molécules d'ADNdb aussi courtes que 100 bp, et Cloutier Widom mesuré les facteurs J pour être de plusieurs ordres de grandeur plus élevés que la prédiction du modèle WLC 8. Un an plus tard, Du et al. produite facteurs J en accord avec le modèle WLC en utilisant le test de cyclisation avec des concentrations plus faibles de ligase et attribué le résultat anormal dans le groupe Widom à des concentrations élevées ligase utilisé 9. Cette controverse illustre l'influence inévitable de l'ADN ligase sur la cinétique de cyclisation en utilisant le test classique 9. En outre, l'ADN ligase peut également affecter la structure de l'ADN et de la rigidité à travers non spécifique 10,11 liaison.
Pour éliminer les problèmes techniques de tests de bouclage protéine dépendante, nous avons récemment démontré une prottest de bouclage ein, à base de Fluorescence Resonance Energy Transfer (FRET) 12. Dans ce procédé, des conformations en boucle sont détectées par FRET entre le donneur et l'accepteur attaché à proximité des extrémités cohésives d'une molécule d'ADN. Un total de microscope de fluorescence par réflexion interne du type à objectif (TIRFM) est utilisé pour enregistrer des trajectoires en boucle réversible et débouclage événements à partir de molécules d'ADN simple surface immobilisé pendant une période de temps prolongée. Cette méthode comporte l'assemblage de molécules d'ADN à base de PCR pour générer des molécules d'ADN libre mésappariement, ce qui est une amélioration cruciale sur une méthode similaire par Vafabakhsh Ha et 13. L'aspect unique molécule de ce protocole permet la mesure des distributions en plus de Ensemble moyennes tandis que l'aspect FRET permet de mesurer la dynamique de l'ADN de boucle à plusieurs reprises de la même molécule, même dans des conditions qui peuvent nuire à l'activité de ligase.
La configuration de TIRFM est illustré à la figure 1. Une coutumeStade-éprouvette conçu est placé sur un corps de microscope Olympus IX61. 532 nm et 640 nm lasers sont introduits à partir du côté et sont réfléchies par les miroirs elliptiques minuscules 14 dans l'objectif d'atteindre une grande NA angle d'incidence critique à l'interface lamelle couvre-objet dans l'eau. Nous notons que plus répandue TIR par-objectif en utilisant des miroirs dichroïques ou configurations de TIR sur la base de prisme peut également être utilisé pour cette application de FRET. L'image de fluorescence formée par le microscope est divisée en images de donneur et d'accepteur par un miroir dichroïque. Ils sont ensuite convertis à la sur les deux moitiés d'un EMCCD. Filtres d'émission passe-longue supplémentaires sont utilisés pour réduire le signal de fond.
Contrôle de la température est essentielle pour acquérir des données cinétiques reproductibles. Pour le contrôle de la température, l'objectif est séparée de la pièce de nez du corps de microscope pour minimiser le transfert de chaleur, et de l'eau à partir d'une température contrôlée refroidisseur / réchauffeur est mis en circulation par l'intermédiaire d'un collier en laiton qui s'adapte étroitement deautour du métal intérieur sous la veste objectif. Cette configuration est en mesure de réaliser robuste contrôle de la température à la surface de la lamelle couvre entre 15 et 50 ° C (Figure 2). Dans ce travail, la température de l'échantillon a été maintenue à 24 ° C.
Le protocole ci-dessous présente la procédure étape par étape pour la construction d'ADN, de l'estimation de la forme de l'ADN, molécule expérience unique, et la détermination du facteur J.
Protocol
Representative Results
Discussion
Un test simple molécule unique basé sur le FRET a été utilisé pour étudier la cinétique de bouclage des ADN de différentes formes intrinsèques. ADN courbes peuvent être préparés par la répétition d'une séquence 10-mère en phase avec la période d'hélice de 10,5 pb, et leurs courbures peuvent être estimées en utilisant PAGE. Ces dsDNAs sont conçus avec des extrémités cohésives pour permettre la stabilisation de la boucle transitoire. Nous avons extrait le taux de bouclage de l'augmentat…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Nous remercions James Waters, Gable Wadsworth et Bo Broadwater pour la lecture critique du manuscrit. Nous remercions également quatre évaluateurs anonymes pour leurs commentaires utiles. Nous reconnaissons l'appui financier du Georgia Institute of Technology, le prix du Burroughs Wellcome Fund carrière à l'interface scientifique, et la subvention du réseau de recherche de l'étudiant de la NSF Physique des systèmes vivants.
Materials
| Small DNA FRAG Extract Kit-100PR | VWR | 97060-558 | |
| Acrylamide 40% solution 500 mL | VWR | 97064-522 | |
| Bis-acrylamide 2% (w/v) solution 500 mL | VWR | 97063-948 | |
| GeneRuler 100 bp DNA Ladder, 100-1000 bp | Fermentas | SM0241 | |
| Mini Vertical PAGE System | VWR | 89032-300 | |
| Syringe filter 0.2um CS50 | VWR | A2666 | |
| Trolox | Sigma-Aldrich | 238813-1G | triplet state quencher |
| Protocatechuic acid (PCA) | Sigma-Aldrich | 08992-50MG | oxygen scavenging system |
| Protocatechuate 3,4-Dioxygenase (PCD) | Sigma-Aldrich | P8279-25UN | oxygen scavenging system |
| mPEG-silane, MW 2000 1g | Laysan Bio | MPEG-SIL-2000-1g | |
| Biotin-PEG-Silane, MW 3400 | Laysan Bio | Biotin-PEG-SIL-3400-1g | |
| Avidin, NeutrAvidin Biotin-binding Protein | Invitrogen | A2666 | |
| Phusion Hot Start High-Fidelity DNA Polymerase | New England Biolabs | F-540L | |
| Gel/PCR DNA Fragments Extraction Kit | IBI Scientific | IB47020 | |
| Premium plain glass microscope slides | Fisher Scientific | 12-544-1 | |
| VWR micro cover glass, rectangular, no. 1 | VWR | 48404-456 | |
| Fisher Scientific Isotemp 1006s Recirculating Chiller/Heater | Fisher Scientific | temperature control | |
| Objective Cooling Collar | Bioptechs | 150303 | temperature control |
| KMI53 Biological Micrometer Measuring Stage | Semprex | KMI53 | |
| High Performance DPSS Laser 532nm 50mW | Edmund optics | NT66-968 | Cy3 excitation |
| CUBE Fiber Pigtailed 640 nm, 30mW, Fiber, FC/APC Connector | Coherent | 1139604 | Cy5 excitation |
| 650 nm BrightLine Dichroic Beamsplitter | Semrock | FF650-Di01-25×36 | splitting dichroic |
| LaserMUX Beam Combiner, reflects 514.5, 532, & 543.5 nm lasers, 25 mm | Semrock | LM01-552-25 | combining dichroic |
| Brightline Fluorescence Filter 593/40 | Semrock | FF01-593/40-25 | Cy3 emission filter |
| 635 nm EdgeBasic LWP longpass Filter, 25 mm | Semrock | BLP01-635R-25 | Cy5 emission filter |
| EMCCD iXon+ | Andor Technology | DU-897E-CS0-#BV | |
| IX51 inverted microscope frame | Olympus | ||
| Objective UApo N 100x/1.49 Oil TIRF | Olympus | ||
| Immersion oil type-F for fluorescence microscopy | Olympus | IMMOIL-F30CC | |
| 2mm Diameter 45° Rod Lens Aluminum Coated | Edmund optics | 54-092 | miniature mirror |
| 1/4" Travel Single-Axis Translation Stage | Thorlabs | MS-1 | translation of miniature mirror |
| Ø1" Achromatic Doublet, ARC: 400-700 nm, f=200 mm | Thorlabs | AC254-200-A | focusing lens |
| Adjustable Mechanical Slit | Thorlabs | VA100 | |
| Dielectric Mirror | Thorlabs | BB1-E02 | |
| Ø1" Achromatic Doublet, f = 100 mm | Thorlabs | AC254-100-A | relay lens |
| Lens Mount for Ø1" Optics | Thorlabs | LMR1 | |
| Dichroic Filter Mount | Thorlabs | FFM1 | |
| Fixed Cage Cube Platform | Thorlabs | B3C | |
| Kinematic Mount for Ø1" Optics | Thorlabs | KM100 | |
| N-BK7 Plano-Convex Lens, Ø1", f = 40 mm | Thorlabs | LA1422-A | collimating lens |
| N-BK7 Plano-Convex Lense, Ø6.0 mm, f = 15 mm | Thorlabs | LA1222-A | telescope lens |
| N-BK7 Plano-Convex Lense, Ø6.0 mm, f = 150 mm | Thorlabs | LA1433-A | telescope lens |
References
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