In Vivo 4-Dimensional sporing af hæmatopoietisk stamcelletransplantation og stamcelle i Voksen Mouse calvarie knoglemarv

Summary

Karakteren af ​​samspillet mellem hæmatopoietiske stamceller og stamceller (HSPCs) og knoglemarv nicher er dårligt forstået. Tilpassede hardware ændringer og en multi-trins erhvervelse protokol tillader brugen af to-foton og konfokal mikroskopi til billede ex vivo mærkede HSPCs homed indenfor knoglemarv områder, tracking samspil og bevægelse.

Abstract

Gennem en hårfin balance mellem ubevægelighed og spredning, selvstændig fornyelse og produktion af differentieret afkom, bloddannende stamceller (HSC'er) opretholde omsætningen for alle modne blodcellelinjer. Samordningen af komplekse signaler, der fører til konkrete HSC skæbner er afhængig af samspillet mellem HSC'er og den indviklede knoglemarvens mikromiljø, som stadig er dårligt forstået ^[1-2].

Vi beskriver, hvordan ved at kombinere en nyudviklet prøveholder stabil dyr positionering med multi-trins konfokal og to-foton in vivo imaging teknikker, er det muligt at opnå høj opløsning 3D-stakke, der indeholder HSPCs og de ​​omgivende nicher og overvåge dem over tid gennem multi-point time-lapse billeddannelse. High definition billedbehandling giver afsløre ex vivo mærket hæmatopoietiske stamceller og stamceller (HSPCs) bosiddende i knoglemarven. Desuden multi-point time-lapse 3D billeddannelse, obtained med hurtigere indstillinger erhvervelse, giver præcise oplysninger om HSPC bevægelse og de gensidige interaktioner mellem HSPCs og stroma celler.

Sporing af HSPCs i forhold til GFP positive osteoblastiske celler er vist som et eksempel på anvendelse af denne metode. Denne teknik kan anvendes til at spore enhver passende mærket hæmatopoietisk eller stromal celle af interesse i mus calvarium knoglemarv plads.

Introduction

Trods stamcellepopulationer nicher har været anerkendt i årtier ³ og godt karakteriseret i mange væv som f.eks lugtekolben, muskelfiber, hårsækken bule eller CNS-subventrikulære zone ^4-7, samspillet mellem hæmatopoietiske stamceller (HSC'er) og knoglemarvens mikromiljø ( BM), er stadig dårligt forstået på grund af vanskeligheden ved direkte at observere enkelte celler gennem knoglen samt ekstremt flydende karakter af vævet selv. Det er blevet vist, gennem en række af funktionelle undersøgelser baseret på ablation eller overudtrykker specifikke gener i enten HSC'er eller stromale celler i mikromiljøet selv, at et indviklet netværk af forskellige celletyper og regulatoriske signaler er ansvarlig for at regulere den fine balance mellem ubevægelighed , spredning, ekspansion og differentiering af HSC'er ^1-2. Krydstale mellem HSC'er og deres nicher kan forstås i dybden kun gennem direkte observation. Dette er achievable takket være udviklingen af ​​avancerede billeddiagnostiske protokoller, der kombinerer den tilgængelige teknologi ikke kun i form af mikroskopi, men også præparatholderen løsninger og erhvervelse software.

Enkelt celle opløsning levende billeddannelse af transplanterede hæmatopoietiske stamceller og stamceller (HSPCs) i BM rum af musen calvaria knogler viste, at transplantere HSPCs lokaliseres i nærheden af SDF-1 og VCAM-1-positive skibe ^8-9 og at mere umodne celler findes inden for 15 - 20 mikron fra GFP-positive osteoblastiske celler (Col2.3-GFP transgene mus linje, hvor osteoblast-begrænset kollagen 1α promotor driver GFP-ekspression), medens deres afkom er mere distale ^10. Lignende observationer blev opnået fra dissekerede og brækkede lårbenet ben ¹¹ og fra tyndet tibeal knogler ^12. Scanning af calvariale knoglemarv stadig den mindst invasive metode til at opnå direkte visualisering af HSPCs inden thEIR indfødte mikromiljø.

Med alle levende eksemplar billeddannelse der er en iboende behov for at holde prøven så stille som muligt for at undgå unødvendige artefakter på grund af prøven bevægelse. Vejrtrækning forårsager oscillerende bevægelser af musen hoved, som skal undgås, når billeddannelse calvariale knoglemarv. Konventionelle stereotaktiske holdere, der anvendes for eksempel til hjernescanning og elektrofysiologi, er ikke egnede til calvarium billeddannelse, fordi de forhindrer de frontale knogler. Startende fra en mus holder bruges til at minimere lidelse under levende billedbehandling og elektrofysiologiske studier ¹³ blev en 2-komponent indehaver udviklet med et lille stykke fast til hovedet af musen for at skabe en scanningsvindue forbundet til en større arm sikrer stabil hold med en tung bundplade, som sikrer fast i mikroskop scenen. Sikring af hoveddelen til kraniet af musen tillader fri vejrtrækning samtidig immobilisering hovedet på plads og tilstrækkeligt at fjerne movements grund vejrtrækning. En "lock-and-tasten" mekanisme, som forbinder hoved-stykket på holdelegemet tillader størrelsen af ​​vinduet skal minimeres samt øget nøjagtighed positionering, således at forenkle operationen, og pasformen af ​​bundpladen i scenen giver mulighed for nøjagtig justering på mikroskopet. Til præcist at overvåge motile celler blev en multi-point tid bortfalder protokol designet til at tillade sporing af celler over tid med 5 min intervaller mellem tidspunkter. Her gjorde mærkede HSC'er injiceres i col2.3GFP osteoblasitc reporter mus ^10,14 og filmede cirka 20 timer senere. Musen holder, der blev udformet og de billeddiagnostiske indstillinger, der kræves for at udføre hurtig multi-point time-lapse billeder af de samme områder over en periode på flere timer, er beskrevet i detaljer.

Protocol

Alle procedurer, der involverer brug af dyr gennemføres i overensstemmelse med den lokale lovgivning. Vores arbejde er godkendt af det britiske indenrigsministerium samt Imperial College etisk panel. De tilladte procedurer er beskrevet i dokumentationen projektet licens og følge retningslinjerne, som sikrer dyrenes velfærd på alle tidspunkter. Sørg for at overholde lovgivningen om dyreforsøg i det land, hvor arbejdet udføres.

1. Mærkning og Injektion af HSPCs:

1. Harvest celler som beskrevet af Lo Celso ^14-15.
2. Forbered cellerne i en koncentration på 10 ⁶ celler / ml i PBS. BEMÆRK: Brug et hæmocytometer eller oplysningerne fra cellesorteringsapparatet at tælle celler; antallet af celler, der skal mærkes og injiceres varierer afhængigt af celletype (pletten for eksempel 10.000 - 20.000 HSC'er, 100.000 - 300.000 HPCs); hvis der arbejdes med mindre end 10 ⁵ celler, resuspender i 100 pi PBS; Det er vigtigt, at de celler i PBS uden serum, serum hæmmer farvning.
3. Tilføj gjorde cellesuspensionen til en endelig koncentration på 5 uM og vortexes suspensionen straks at sikre farvestoffet ikke præcipiterer ud af opløsning og ikke til at mærke cellerne.
4. Inkuber i 10 minutter ved 37 ° C, derefter vaskes ved centrifugering ved 500 xg i 5 minutter, dekantering af væske og resuspendering af pelleten i et passende volumen til intravenøs injektion (~ 100-150 ul)
5. Cellerne i 200 pi PBS og samle ind i en insulinsprøjte. BEMÆRK: en insulinsprøjte anbefales over en konventionel sprøjte, fordi det har ingen nål døde rum, og derfor gør det muligt at administrere hele cellen suspensionen til musen.
6. Indsprøjtes celler i et letalt bestrålede mus via haleveneinjektion. BEMÆRK: Bestråling har kendt, betydelig indflydelse på knoglemarvens mikromiljø (både hæmatopoietiske og stromale komponenter), der udvikler sig over timig. Det er derfor meget vigtigt at opretholde konsekvent timing for bestråling, celleinjektion (4 til 24 timer fra bestråling for bedste indpodning) og billeddannelse. Her bestråling udføres 6 timer før injektion og billeddannelse udføres 20 timer efter injektion.
   1. Anbring musen i et varmt kammer (37 ° C), indtil halevenen vises vasodilated.
   2. Bevæg musen i harpiksstopperen og skub forsigtigt kanylen i halevenen.
   3. Indsprøjtes cellerne ind i venen - ingen modstand til injektion bør stødt.
   4. Lad muse O / N for at tillade cellerne at migrere til knoglemarv rum.

2. Forberedelse af musen for Imaging

1. Autoklave et par fine pincet og et par fine saks samt en medaljon før brug og opbevares i et sterilt miljø.
2. Fyldes op bedøvelsesmiddel så frisk som muligt, (0,38 ml Ketamin + 0,25 ml Medetomidin + 4,47 ml vand). BEMÆRK: OThendes godkendte bedøvelsesmidler, herunder isofluran og andre injicerbare, vil være for effektiv. Den beskrevne cocktail skal indgives intraperitonealt ved 0,1 ml pr 10 g legemsvægt, med top-ups 30 - 50 ul indgivet hver 45 min til 1 time.
3. Tænd for to-foton laser, hvis det kræves så starte mikroskop og software, kalibrering det tidspunkt, hvor du bliver bedt om. Tænd lasere og give dem mulighed for at varme op og stabilisere mens de forbereder musen til billeddannelse.
4. Bedøver musen det klargjorte anæstesiblandinger (trin 2.2) for den valgte bedøvelsesmiddel via intraperitoneal injektion. Overvåg indtræden af ​​dyb anæstesi via pedal refleks nu og med jævne mellemrum hele protokollen. BEMÆRK: skal overvåges musen omhyggeligt hele proceduren, og hvis anæstesi synes at lysne (typisk efter 45-60 min) og derefter administrere en top-up dosis (som beskrevet i 2.2). Forvent en vis variation mellem mus i forskellige aldre og køn. Det er betydtigt at diskutere anæstesi protokol med din lokale dyrlæge for at sikre passende forholdsregler er taget for at sikre musens velfærd.
5. Aftør toppen af ​​hovedbunden med 70% ethanol på et væv, hvilket sikrer at der ikke kommer ethanol i øjnene af musen.
6. Brug af steril pincet og saks, forsigtigt fjerne den centrale del af hovedbunden for at blotlægge hovedskallen område, der skal afbildes: lave et lille snit på bagsiden af ​​hovedet mellem ørerne ved at løfte huden op med pincet. Mens du holder huden op, skub saksen under huden og forsigtigt skære langs ydersiden af ​​det ønskede billedområde.
7. Tør blotlagt knogle med steril vatpind fugtet med sterilt PBS til at holde den fugtig.
8. Fastgør metal hovedstykke til kraniet af musen klar til billeddannelse.
   1. Bland en passende mængde af dentalcement i en vejer båd, indtil det bliver en pasta og hurtigt anvende til den nederste overflade af hovedstykket, som vil vedhæfte til sKull.
   2. Før cement sæt, placere medaljon på kraniet af musen, og sørg for ikke at få nogen dental cement på det billeddannende område, så vent til det at indstille.
   3. Påfør en lille mængde Intrasite Hydrogel som holder kraniet fugtig.
9. Fastgør medaljon til indehaveren og fikseres med skruen, der sikrer, at rillerne passer i holderen hak.
10. Fjern hydrogel fra kraniet med sterile vatpinde og rene med sterilt PBS før overførsel til mikroskopet.
11. Sæt holderen ind mikroskopbordet placere varmemåtten under musen, skal du indsætte rektal termometer sonde og sikre alt på plads på scenen med tape.
12. Placer en lille dråbe af oftalmologiske salve på øjnene af musen til at sikre, at de ikke tørrer ud, mens under bedøvelse. BEMÆRK: musen må ikke efterlades uden opsyn på noget tidspunkt under den billeddannende proces, mens under anæstesi.

In Vivo Imaging: Høj opløsning stakke og Time-lapse Acquisition

1. Fokus på kraniet via øjet stykker.
   1. Fyld scanningsvindue med renset, sterilt vand og bruge en vand dyppe linse, sænke den, så den rører ved vanddråben.
   2. Fokus på toppen af ​​kraniet ved mikroskop okularer, ved hjælp af en ekstern lampe som lyskilde.
   3. Placer billeddannende område på den centrale sutur og bevæge sig mod bagsiden af ​​hovedet for at finde den koronale sutur som udgangsposition.
2. Indstil mikroskopet til at tillade effektiv excitation og påvisning af de relevante fluorforer angivet i excitation og emission bord. BEMÆRK: mens et Leica SP5 opretstående konfokal med en konventionel galvanometer scanning hoved kører LAS-AF softwareplatform bruges her, kan processen nemt gentages i andre mikroskop / softwareplatforme. Linsen bruges her er Leica HCX IRAPO L 25x W / 0,95 NA BUT tilsvarende objektiver fra andre producenter er tilgængelige med passende forstørrelse og høj NA
   1. Placer software i en tilstand til at tage både XY billeder samt en 3D Z-stak og sæt billedbehandling hastighed til 400 Hz og opløsning til 512 x 512 pixel. BEMÆRK: setup og hardware her resultere i et synsfelt på 620 um, og det kan variere på andre platforme.
   2. Indstil software, så flere kanaler / spor er i stand til at blive fanget, samt sikre, at indsamlingen metode er indstillet til at ændre indstillinger mellem stakke hvis det er muligt eller mellem rammer i det mindste. Opsætning 3 uafhængige capture indstillinger slukke for laserbelysning ved afslutningen af ​​købet af hver stak. BEMÆRK: Der vil blive krævet tre kanaler til denne procedure for at reducere krydstale mellem kanalerne.
   3. Opsæt indstillingerne for første sekventiel scanning for to foton SHG knogle-signal (840 nm excitation, 400-440 nm emission); åbne lukkeren til MP laser og sikre MP-forstærkning og offset er korrekt setup, laser magt er 12,5 - 25% og laseren er tændt. Vælg en passende PMT som den eneste detektor og ændre farven til hvid. Bemærk: NDD detektorer med passende filtre bør anvendes til knoglen detektion, når den foreligger for at opnå en lysere, dybere signal.
   4. Gentag kanal setup procedure anvendt til GFP kanal for en kombineret autofluorescens (543 nm excitation, 560 - 600 nm emission) og gjorde (633 nm excitation, 650-720 nm emission) under anden indstillinger scanne, udnytte to passende PMT'er. Skift kanal farve til grøn for autofluorescens og rød for den gjorde. Bemærk: ved hjælp af grøn som auto-fluorescens kanal letter påvisning af DID positive celler, når de to kanaler er overlejret - autofluorescerende celler vises som gul / orange grund af at være i begge kanaler, mens gjorde cellerne vises kun som rød, da de kun vises i Gjorde kanal. Auto-fluorescens kanalanvendes kun til denne sammenligning, og ikke anvendes i de endelige analyse, men hvis brugeren ønsker det, kan dette ændres til en anden farve for at vise formål at undgå forveksling med GFP kanal.
   5. Endelig opsætning den tredje og sidste scanning for GFP (488 nm excitation, 500-530 nm emission); Sørg for, at lukkeren er åben, hvis det kræves, og derefter indstille laseren magt 488 nm laser linje til omkring 15% eller et passende niveau for laser, der bruges, skal du vælge en passende PMT som eneste aktive detektor og ændre sin pseudofarve til grøn.
   6. Aktiver en 'live' billedbehandlingstype at begynde en forhåndsvisning scanning af den valgte kanal og justere detektor Gain og Offset til optimal eksponering. Gentag dette for hver scanning i den sekventielle vindue.
   7. Gem indstillingerne for disse multi-kanal scanninger til nem genbrug. BEMÆRK: Dette giver brugeren mulighed for at genindlæse indstillingerne i efterfølgende sessioner.
3. Aktiver multi-position fange, benævnt »Markere ennd Find 'i demonstreret software og nulstille koordinatpunkter.
4. Scan knogleskanningsfund område, startende fra krydsfeltet mellem det centrale og koronale sutur, scan dybden af ​​knoglemarven område ved hjælp af både autofluorescens (pseudo farvet grøn) og gjorde (pseudo-farvet rød) med en sammensat visning. BEMÆRK: autofluorescerende celler vil være til stede i begge kanaler og vises som orange / gul i det sammensatte billede hvorimod VIDStE mærkede celler vil blive vist som-only røde celler i det sammensatte billede.
5. Når der registreres en celle, skal du markere dette som et nyt koordinatsystem position (x, y og z) i feltet 'Mark og find' værktøjet ved at klikke på "Tilføj ikon ny position på venstre side af" Mark og find "vinduet .
6. Når den aktuelle synsfelt er blevet undersøgt, flytte scenen afstand af én synsfelt enten venstre / højre / op / ned. Gentag denne proces for hver synsfeltet gradvist arbejder rundt i hele scanningsvindue område til venstre for the centrale sutur, bevæger sig mod næsen af ​​musen. Når den centrale sutur tvedeling er i sigte, skal du flytte til højre side af suturen og gentag proceduren scanne den venstre side i den modsatte retning (dvs. mod koronale sutur). Markere koordinaterne for eventuelle nye celler af interesse ved hjælp af »Mark og find 'værktøj.
7. Når scanning af scanningsvindue er færdig, skal du bruge 'Mark og find "værktøj til at gennemgå de punkter (vælg det ønskede punkt og gennemgå hvert punkt individuelt). Indstil toppen og bunden af ​​en Z-stack omkring hver celle for hver position, (mange software-platforme vil give dig mulighed for at udføre selvstændige z-stakke for hver position, hvilket reducerer opfange tom plads). For hvert punkt, fokus op og ned og sæt top og bund Z positionerne til 3D z-stak opsamling og opdatere individuelt punkt i »Mark og find". Indstil Z-Stack intervallet til 5 um og gennemsnit for hver sekventiel scanning kanal til en passende kvalitet: Linie or Ramme gennemsnit. BEMÆRK: Forøgelse af antallet af scanninger til gennemsnittet øger længden af ​​erhvervelse tid.
8. Erhverve en høj kvalitet henvisning stak for hvert punkt af interesse ved at starte hele den scanning procedure (ofte omtalt som 'Start' snarere end "Capture"). Bemærk: Denne scanning kan fungere som en reference for fremtidige højhastighedstog billeddannelse.
9. Når du er færdig med høj kvalitet scanning, aktivere en time-lapse indstilling for opsamling.
10. I time-lapse-indstillinger, indstille tidsintervallet til 5 min og den samlede køretid til den ønskede længde (fx 5 timer). 'Anvend' disse indstillinger til den samlede scanning. BEMÆRK: For at reducere denne scanning tid, at en 5 min tid bortfalder interval, kan man nødt til at reducere antallet af scanninger anvendes til gennemsnitsberegning begrænse opløsningen til 512 x 512 pixel, konvertere scanning til tovejs (med nødvendige korrektion fase at tilpasse begge scan retninger), og / eller øge scanningshastighed til 600 Hz eller mere (mere end 600Hz vil forårsage zoomning af den billeddannende område for påvist software platform). Det er også vigtigt at bemærke, at mens en sekventiel billedbehandlingstype blev anvendt til at erhverve en høj kvalitet billedstak første omgang, er samtidige erhvervelse bruges til at øge hastigheden i den time-lapse imaging - dette kan resultere i nogle mindre cross-talk, som lægger ekstra vægt på den indledende indfangning af de præcist adskilte referencepriser stakke.
11. Begynd imaging (som før ved at klikke på knappen 'Start' i demonstreret softwaren). BEMÆRK: Sørg for at opretholde et passende niveau af anæstesi ved at administrere yderligere mindre doser når det er nødvendigt, være omhyggelig med ikke at overdosere musen, regelmæssigt top op vand for at sikre målsætningen ikke tørrer ud og overvåge vitale tegn og varme-pad temperatur hele vejen igennem.
12. Når du er færdig, skal du hæve objektivet ud af holderen og derefter fjerne holderen fra mikroskopbordet sikre ledningerne fra rektal sonde og hspise måtten ikke beskadiges.
13. Skru medaljon fra indehaveren af ​​scenen og forsigtigt fjerne musen. Frasortering musen ved at bruge halsdislokation og fjern metal head-brik ved at snappe det fra kraniet. Gem data til disk og overføre til serveren til senere analyse. BEMÆRK: topstykke er ideelt renses ved at dyppe i acetone i et par timer og endelig gnide rester af cement fra.

Representative Results

Den skræddersyede, høj præcision mus holder herunder en calvarium scanningsvindue tillader langvarig billeddannelse af FACS oprensede, mærkede HSPCs sprøjtes ind i dødeligt bestrålede recipientmus (figur 1A). Typisk efter injektion på mellem 15-20000 mærkede celler, 8 til 15 celler er sædvanligvis genkendeligt i knoglemarven billeddannende område af kraniet den følgende dag. Her er det vist, hvordan man erhverve en enkelt celle opløsning 3D stakke af HSPC-holdige knoglemarv områder på cirka 90-120 um tykkelse, (figur 1B), efterfulgt af 4D time-lapse film af HSPCs identificeret (figur 1C og film).

Suboptimale resultater opnås, hvis dental cement ikke er optimalt forberedt, for eksempel vand kan lække fra ikke lukkede områder, og selv om det kan fyldes op fra toppen af ​​holderen, enhver periode, hvor linsen er ikke dyppet i vand fører til sort f Rames. Vis lønglidning i billederne er uundgåelig på grund af termisk udvidelse af materialerne i musen holder, men det kan blive forstærket ved suboptimal cement vedhæftning, hvilket fører til en gradvis løsrivelse af musen, og ved forstyrrelser af imaging sat op, der fører til pludselige spring af fokus under tidsforskudt billeddannelse. Drift under multi-point time-lapse imaging kan også være forårsaget af unøjagtigheder i bevægelserne fase, hvor genoptagelse tidligere afbildede positioner. Drift og stutter artefakter i time-lapse film kan korrigeres for ved hjælp af billede registreringsafgifter algoritmer.

Indstillinger emission Tabel 1. Excitation og.

13px; "> 488 nm

Farve Kanal	Excitation	Emission
GFP	500-530 nm
Autofluorescens	543 nm	560-610 nm
DID	633 nm	640-700 nm
SHG	840 nm (MP)	400-450 nm

Figur 1. In vivo-4D billeddannelse af HSPCs i muse calvarium. (A) Oversigt over forsøget (B - C).. Eksempler på opnåede resultater (B) 2D skiver fra en 3D-stak (samlet dybde er 114 um) indeholdende signal fra kollagen knogle (hvid) gjorde mærkede celler (rød) , autofluorescerende cells (gul) og osteoblastceller (grøn). Skalapanelerne.: 100 um (C) 2D skiver fra en 4D tidsforkortet film viser en VIDStE mærket HSC (rød) migrerer i nærheden af osteoblastceller (grøn). Den stiplede linie fremhæver forskydning af cellen. Skalapanelerne: 50 pm (B) og 100 um (C). BEMÆRK:. Filmen fås fra time-lapse erhvervelsen i (C) vises under videoen artiklen Klik her for at se en større version af dette tal.

Discussion

Hvad blev gennemført?

Protokollen anvender time-lapse multi-dimensional imaging at overvåge migrationen af FACS renset, ex vivo mærket, transplanterede HSPCs i mus calvariale knoglemarv. Identifikation af enkelte transplanterede celler er blevet opnået, og disse er blevet overvåget over længere perioder (timer) med stor nøjagtighed. Vejrtrækning inducerede bevægelse artefakter er blevet minimeret, og cellerne er gentagne gange blevet reimaged over en længere tidsforløb.

Hvad er fremtidige retninger?

Udvikling af teknik kan gøre fremskridt hen imod genopretning eksperimenter for at give mulighed for imaging på flere dage, i løbet af en uge eller mere og brug af gasleverancer anæstetika såsom isofluran at forkorte og forenkle inddrivelsen processen til musen (Bemærk: genfindingsforsøg kræver nøje sterile kirurgi forhold og administration af passende analgetika). Development af en større farve-palet af in vivo farvestoffer samt en effektiv genetisk mærkning af hæmatopoietiske celler vil også lette multi-mærkning af eksperimenter, give mere indsigt i celle-celle interaktioner inden knoglemarven og give mulighed for mere komplekse eksperimenter i fremtiden. Derudover vil samtidig mærkning af multiple knoglemarv strukturer og stroma komponenter giver et mere fuldstændigt billede af de begivenheder, der finder sted i HSPC nicher. Billede stabilitet af time-lapse film kunne forbedres preacquisition ved at stabilisere mikroskopet yderligere samt minimere temperaturgradienter i stikprøven og postacquisition ved hjælp af billedet registreringsafgifter algoritmer.

Begrænsninger:

Den beskrevne teknik viser nogle begrænsninger. Overlevelse af mus efter administration af injicerbare anæstetika er uforudsigelig, og det er meget nemt at opleve komplikationer afhængig af individuel respons påbedøvelsesmiddel. Generelt, jo længere en billeddannende session, jo sværere er til musen at komme fra anæstesi, og det er derfor vigtigt nøje at planlægge, hvis musen er, der skal inddrives, ideelt at begrænse varigheden af ​​tid bortfalder billeddannelse. Anvendelsen af ​​injicerbare anæstetika begrænser den tid hver billeddannelse session kan vare. Selv om det er muligt at forlænge anæstesi ved fornyet indgivelse en mindre dosis af bedøvelsesmiddel, er det vanskeligt at udføre denne nøjagtigt og overdosering musen er en af de hyppigste årsager til for tidlig afslutning af in vivo-billeddannelse. Gas anæstesi er mindre giftigt og giver mulighed for en længere indledende billedbehandling session dog hurtig genopretning af musen efter> 2 timer lang administration af isofluran er sjældent vellykket. En anden begrænsning af teknikken er begrænset opløsning af de billeder, der kan opnås i multi-point time-lapse billeddannelse, på grund af nødvendigheden hurtigt at erhverve billeder. Dette, kombineret med fokal afdrift eller felt springer (diskussed ovenfor), kan gøre sporing af celler vanskelig.

Sammenligning med alternative metoder:

HSPCs er normalt mærket med lipofile farvestof gjorde, men folder og DII farvestoffer er tilsvarende alternativer og andre celletyper farvestoffer kan bruges, så længe tilstrækkeligt lys, som revideret i ^[16]. Selvom med VIDStE har vist ex vivo mærkning af celler til ikke at påvirke den langsigtede funktion af HSC'er, har den begrænsning, at gjorde (eller andre kemiske farvestof) fortyndes ved celledeling. Da HSC'er prolifererer i løbet af de første dage efter transplantation, signal-støj-forholdet for disse celler hurtigt forringes. Endogen mærkning af celler ved hjælp af genetisk manipulation og ekspression af fluorescerende proteiner er et levedygtigt alternativ fremgangsmåde, så længe de fluorescerende proteiner udtrykkes i tilstrækkeligt høje niveauer til at frembringe signalet kan påvises gennem kraniet. Der er en række alternative techniques rådighed til at udføre billeddannelse af HSPCs i knoglemarven rum, hver med deres egne fordele og begrænsninger. Indsættelse af fiberoptiske baserede afbildningsindretninger tilladt for billeddannelse af knoglemarven rekonstituering i lange knogler ^[8], mens konfokal billeddannelse efter kirurgisk eksponering af skinneben og udtynding af knogle emalje med en kirurgisk boremaskine ^[12] udarbejdet detaljerede billeder af HSPCs bopæl i de perifere områder af lange knogler. Disse metoder er imidlertid langt mere invasiv end den er beskrevet her, og det derfor ikke muligt at gentage billedoptagelse fokus på samme knoglemarv område inden for den samme mus. Desuden er det muligt, at disse teknikker kan påvirke cellerne observeret givet den uundgåelige reaktion omfattende skader på det omgivende væv. HSPCs er blevet afbildet i korte perioder gennem dækglas placeret over fjernet, brækkede lårben ^[11], men virkningen af denne barske forberedelse af væv på HSPCs er ikke cleaR og teknikken blev brugt entydigt at opnå en enkelt tidspunkt observationer. Faste ben er opdelt i serielle sektioner, farves, og de ​​opnåede billeder rekonstrueret i en 3D-model, der giver en fremragende 3D ​​opløsning, især når der anvendes vaskulære afstøbninger ^[17], og for nylig Laser Scanning Cytometry (LASC) er blevet anvendt til at opnå kvantitativ foranstaltninger omkring HSPCs in situ, fremhævet af immunfarvning ^[18], men er ude af stand til at give nogen tidsmæssig oplysninger om celler adfærd. De er beskrevet i denne nye teknik teknikker giver en kombination af god opløsning i 3D, tilstrækkelig tidsmæssig prøvetagning til overvågning celler i 4D, og ​​de er relativt ikke-invasiv, derfor tilbyder en ideel metode til at opnå en langsigtet overvågning af HSPCs interagere med knoglemarvens mikromiljø.

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
Ketamine (Narketan 100 mg/ml)	Vetoquinol	407575 0107 C	Other anesthetics may be used in place of this.
Medetomidine (Domitor 1 mg/ml)	Elanco	134800-2	Other analgesics may be used in place of this.
Vibrant DiD cell labeling solution	Roche Products Ltd.	V22887	Other colors are available and may be used if required.
Lacrilube ophtalmic ointment	Allergan	n/a	avaliable by prescription by the local vet
Kemdent "Diamond Carve" glass ionomer cement	Associated Dental Products Ltd. via Kemdent	SUN527	We use shade A3, but any shade of cement can be used.
PBS	multiple equivalent
Insulin syringes	Terumo Medical Corporation	SS10M3109	1 ml, 31 G
Mouse restrainer	Harvard Apparatus	340031	Cone type (small)
Autoclaved forceps and scissors	Agar Scientific	AGT577 AGT5034	Iris scissors - 90 mm; Dumont HP tweezers (0.06 mm tip)
Weigh boat and cement stirrer	VWR	611-1996/231-0370	5 ml weigh-boat (black)/ Wooden tongue depressor
Leica SP5 upright confocal microscope with motorized stage and two-photon laser	Leica Microsystems		Call for quote
25x water dipping objective lens (N.A. = 0.95)	Leica Microsystems	11506323	HCX IRAPO L lens
Custom designed mouse holder	Imperial College Engineering Workshop		See Figure 1 for details
Heating pad with rectal thermometer probe	BASi Instrumentation	FHC-40902/ FHC-40908/ FHC-4090502	Heat mat/ Control box/ Thermometer probe