In Vivo 4-Dimensional Spårning av Hematopoietic Stem och stamceller i vuxen mus calvarial Benmärg

Summary

Karaktären hos de interaktioner mellan hematopoietiska stamceller och progenitorceller (HSPCs) och benmärgs nischer är dåligt förstådd. Anpassade konstruktion och en flerstegsförvärvsprotokoll tillåta användning av två-foton och konfokalmikroskopi till bilden ex vivo märkta HSPCs homing inom benmärgsområden, spårning interaktioner och rörelse.

Abstract

Genom en känslig balans mellan stillhet och spridning, självförnyelse och produktion av differentierade avkomma, hematopoetiska stamceller (HSCs) upprätthålla omsättningen för alla mogna blodkroppslinjer. Samordningen av de komplexa signaler som leder till specifika HSC öden bygger på samspelet mellan HSCs och intrikata benmärgsmikromiljö, som fortfarande är dåligt känd ^[1-2].

Vi beskriver hur genom att kombinera en nyutvecklad provhållare för stabil djur positionering med flera steg konfokala och två-photon in vivo avbildningstekniker, är det möjligt att få högupplösta 3D-staplar som innehåller HSPCs och deras omgivande nischer och följa dem över tid genom flera punkter time-lapse avbildning. Högupplöst imaging tillåter upptäcka ex vivo märkta hematopoetiska stamceller och progenitorceller (HSPCs) bosatta i benmärgen. Dessutom flera punkter time-lapse 3D-röntgen, obtained med snabbare förvärvsinställningar, ger korrekt information om HSPC rörelse och de ömsesidiga samspelet mellan HSPCs och stromaceller.

Spårning av HSPCs i förhållande till GFP positiva osteoblastiska celler visas som ett exempel på tillämpningen av denna metod. Denna teknik kan användas för att spåra eventuella lämpligt märkt hematopoetisk eller stromal cell av intresse i musen calvarium benmärgsutrymme.

Introduction

Trots stamcells nischer har erkänt sedan årtionden ³ och väl kännetecknas i många vävnader såsom luktbulben, muskelfibrer, hårsäcken bula eller CNS subventrikulära zon ^4-7, samspelet mellan hematopoetiska stamceller (HSCs) och benmärgsmikromiljö ( BM) är fortfarande dåligt kända på grund av svårigheten att direkt observera enskilda celler genom benet samt extremt fluid naturen av vävnaden själv. Det har visat sig, genom ett antal funktionella studier baserade på ablation eller överuttrycker specifika gener i antingen HSCs eller stromaceller i mikromiljön i sig, att ett intrikat nätverk av olika celltyper och regulatoriska signaler ansvarar för att reglera den känsliga balansen mellan inaktivitet , spridning, expansion och differentiering av HSCs ^1-2. Den överhörning mellan HSCs och deras nischer kan förstås på djupet bara genom direkt observation. Detta är achievable tack vare utvecklingen av avancerade bildprotokoll, som kombinerar tillgängliga teknik som inte bara i termer av mikroskopi, men också av provhållare lösningar och förvärvsprogram.

Single cellupplösning levande avbildning av transplanterade hematopoetiska stamceller och progenitorceller (HSPCs) i BM utrymme musen calvaria benen visade att engrafting HSPCs lokaliseras i närheten av SDF-1 och VCAM-1-positiva kärl ^8-9 och att mer omogna celler finns inom 15 - 20 mikrometer från GFP-positiva osteoblastceller (Col2.3-GFP transgen mus linje, där osteoblaster begränsade kollagen 1α promotor driver GFP uttryck) medan deras avkomma är mer distalt ^10. Liknande observationer erhölls från dissekerade och brutna lårben ben ¹¹ och från förtunnade tibeal ben ^12. Imaging av calvarial benmärg fortfarande den minst invasiva metod för att uppnå direkt visualisering av HSPCs inom thEIR infödda mikromiljö.

Med varje levande exemplar imaging det finns en inneboende behov av att hålla provet så stilla som möjligt för att undvika onödiga artefakter på grund av provrörelse. Andningen orsakar oscillerande rörelser hos mus huvud, som måste undvikas vid bildåtergivning calvarial benmärg. Konventionella stereotaktiska hållare, som används till exempel för hjärnavbildning och elektrofysiologi, är inte lämpliga för calvarium avbildning, eftersom de hindrar den pannben. Med utgångspunkt från en mus hållare används för att minimera lidande under levande avbildning och elektrofysiologiska studier ^13, var en 2-komponent hållare fram, med en liten bit fastsatt på huvudet av musen för att skapa en bildfönster som är ansluten till en större arm garanterar stadiga grepp med en tung bottenplatta som säkrar ordentligt i mikroskop scenen. Fästa huvudstycket till skallen av musen tillåter fri andning samtidigt immobilisera huvudet på plats och tillräckligt eliminera movements grund av andning. En "lock-and-key 'mekanism som förbinder huvud-piece till hållarkroppen tillåter storleken på fönstret skall minimeras samt ökad noggrannhet positionering, därför att förenkla operationen, och passningen av basplattan in i scenen möjliggör exakt inriktning på mikroskopet. Att exakt följa rörliga celler, var en multi-point time lapse protokoll för att möjliggöra spårning av celler över tiden med fem minuters intervall mellan tidpunkter. Här gjorde märkta HSCs injiceras i col2.3GFP osteoblasitc reporter möss ^10,14 och avbildas ca 20 timmar senare. Musen hållare som utformades och bildinställningar som krävs för att utföra snabba flerpunkts time-lapse avbildning av samma områden under en period av flera hr beskrivs i detalj.

Protocol

Alla förfaranden som omfattar användning av djur transporteras enligt den lokala lagstiftningen. Vårt arbete är godkänd av brittiska inrikesministeriet samt Imperial College etikprövningspanel. De tillåtna förfaranden beskrivs i dokumentationen av projektet licens och följer riktlinjer som säkerställer djurens välbefinnande hela tiden. Se till att följa lagstiftningen om djurförsök i det land där arbetet utförs.

1 Märkning och Injektion av HSPCs:

1. Harvest celler såsom beskrivs av Lo Celso ^14-15.
2. Förbered cellerna vid en koncentration av 10 ⁶ celler / ml i PBS. OBS: Använd en hemocytometer eller den information som cellsorterare för att räkna cellerna; antalet celler som skall märkas och injiceras varierar beroende på celltypen (fläck exempelvis 10.000 - 20.000 HSCs, 100,000 - 300,000 HPCS); Om man arbetar med mindre än 10 ^5-celler, återsuspendera i 100 pl av PBS; det är viktigt att ha celler i PBS utan serum, såsom serum hämmar färgning.
3. Lägg DiD till cellsuspensionen till en slutlig koncentration av 5 pM och vortexblanda suspensionen omedelbart för att säkerställa att färgämnet inte fälls ut ur lösning och misslyckas med att märka cellerna.
4. Inkubera under 10 minuter vid 37 ° C, tvätta sedan genom centrifugering vid 500 xg under 5 minuter, dekantering av vätskan och återsuspendering av pelleten i en lämplig volym för IV-injektion (~ 100-150 | il)
5. Resuspendera cellerna i 200 ^ il PBS och samla in en insulinspruta. OBS: en insulinspruta rekommenderas under en vanlig spruta eftersom den inte har någon nål dött utrymme och därmed gör det möjligt att administrera hela cellsuspensionen till musen.
6. Injicera celler i ett letalt bestrålad mus via svansvenen injektion. OBS: Bestrålning har känt stor inverkan på benmärgsmikromiljö (både hematopoetiska och stromala komponenter), som utvecklas över timig. Därför är det mycket viktigt att upprätthålla konsekvent timing för bestrålning, cellinjektion (4-24 tim från strålning för bästa inympning) och bildbehandling. Här bestrålning utförs 6 timmar före injektion och bildbehandling utförs 20 timmar efter injektionen.
   1. Placera musen i en varm kammare (37 ° C) tills svansvenen visas vasodilated.
   2. Flytta musen till som hindrar och skjut försiktigt in nålen i svansvenen.
   3. Spruta cellerna i venen - inget motstånd mot injektion ska påträffas.
   4. Låt musen O / N så att cellerna att migrera till benmärgs utrymmen.

2 Förbereda musen för Imaging

1. Autoklav ett par fina pincett och ett par fina saxar samt en headpiece före användning och förvara i en steril miljö.
2. Make up bedövningsmedel så färska som möjligt, (0,38 ml Ketamin + 0,25 ml Medetomidin + 4,47 ml vatten). OBS: othennes godkända anestetika, inklusive isofluran och andra injicerbara, kommer att vara för effektivt. Den cocktail beskrivits skall administreras intraperitonealt vid 0,1 ml per 10 g kroppsvikt, med topp-ups av 30-50 ^ il administrerades var 45 min till 1 tim.
3. Slå på två-foton laser vid behov starta mikroskop och programvara, kalibrering av scenen vid uppmaning. Slå på lasrarna och tillåta dem att värma upp och stabilisera samtidigt förbereda musen för avbildning.
4. Bedöva musen med hjälp av förberedda anestesiblandningar (steg 2.2) för den valda bedövningsmedel via intraperitoneal injektion. Övervaka uppkomsten av djup anestesi via pedal reflex nu och med jämna mellanrum under protokollet. OBS: musen ska övervakas noggrant under hela förfarandet och om anestesi verkar ljusare (vanligen efter 45-60 min) därefter administrera en top-up dos (enligt beskrivningen i 2.2). Räkna med viss variation mellan möss av olika åldrar och kön. Det är viktigt att diskutera anestesiprotokoll med din lokala veterinär för att säkerställa tillräckliga försiktighetsåtgärder vidtas för att se till musens välfärden.
5. Tvätta toppen av hårbotten med 70% etanol på en vävnad, vilket säkerställer att inte få någon etanol i ögonen på musen.
6. Med hjälp av steril pincett och sax, försiktigt bort den centrala delen av hårbotten för att exponera calvarium område som ska avbildas: gör ett litet snitt på baksidan av huvudet mellan öronen genom att lyfta huden med pincett. Håll huden upp, skjut saxen under huden och försiktigt skära längs utsidan av det önskade bildområdet.
7. Torka av exponerade benet med steril bomullspinne fuktad med steril PBS för att hålla den fuktig.
8. Montera metallhuvudstycket till skallen av musen redo för avbildning.
   1. Blanda en tillräcklig mängd av dentalcement i en väga båt tills det blir en pasta och snabbt tillämpas på bottenytan av headpiece som kommer att lägga till skull.
   2. Innan cement-apparater, placera headpiece på skallen av musen, och se till att inte få någon tandcement på bildområdet, sedan vänta på den för att ställa.
   3. Applicera en liten mängd av Intrasite Hydrogel som håller skallen fuktig.
9. Fäst huvudstycket till hållaren och säkra på plats med skruven, se till att spåren passar inom innehavaren skårorna.
10. Avlägsna hydrogel från skallen med sterila bomullspinnar och ren med steril PBS innan du överför till mikroskopet.
11. Sätt i hållaren i mikroskop scenen, placera värmematta under musen, sätt i rektala termometern sond och säkra allt på plats på scenen med tejp.
12. Placera en liten droppe oftalmologiska salva på ögonen på musen för att säkerställa att de inte torkar ut medan under narkos. OBSERVERA: musen får inte lämnas utan uppsikt under avbildningsprocessen medan under anestesi.

In Vivo Imaging: Högupplösta Stacks och Time-lapse Förvärv

1. Fokus på skallen via okular.
   1. Fyll bildfönstret med renat, sterilt vatten och med hjälp av en vattendopplins, sänk den så att den vidrör vattendroppe.
   2. Fokus på toppen av skallen med användning av mikroskopets okular, med en extern lampa som ljuskällan.
   3. Placera avbildningsområdet på den centrala suturen och röra sig mot den bakre delen av huvudet för att hitta den koronala sutur som en startposition.
2. Ställ mikroskopet för att möjliggöra en effektiv excitation och detektion av relevanta fluoroforer anges i excitation och emissionsbord. OBS: medan en Leica SP5 upprätt konfokal med en konventionell galvanometer skanningshuvud kör LAS-AF mjukvaruplattform används här, kan förfarandet lätt upprepas i andra mikroskop / mjukvaruplattformar. Linsen som används här är Leica HCX IRAPO L 25x W / 0,95 NA BUT likvärdiga objektiv från andra tillverkare finns med lämplig förstoring och hög NA
   1. Placera mjukvaran i ett läge för att fånga både XY bilder samt en 3D-Z-stack och ange utskriftshastighet på 400 Hz och upplösningen till 512 x 512 pixlar. OBS: setup och hårdvara här resulterar i ett synfält på 620 nm och detta kan skilja sig på andra plattformar.
   2. Ställ in programmet så att flera kanaler / spår kan fångas, samt se till att insamlingsmetod är inställd på att ändra inställningar mellan buntar om möjligt eller mellan ramar åtminstone. Ställ in 3 oberoende importkonfigurationer, stänga av laserbelysning i slutet av förvärvet av varje stapel. OBS: tre kanaler kommer att krävas för detta förfarande för att minska överhörning mellan kanaler.
   3. Ställ in inställningarna för första sekventiell skanning för de två fotoner SHG ben signal (840 nm excitation, 400-440 nm emission); öppna slutaren för MP laser och se MP förstärkning och offset är rätt inställning, är lasereffekt 12,5-25% och lasern är påslagen. Välj en lämplig PMT som den enda detektorn och ändra färg till vitt. Obs: NDD detektorer med lämpliga filter bör användas för att upptäcka ben när det är tillgängligt för att uppnå en ljusare, djupare signal.
   4. Upprepa kanalinställningsprocedur som används för GFP-kanal för en kombinerad autofluorescens (543 nm excitation, 560 - 600 nm emission) och gjorde (633 nm excitation, 650-720 nm emission) under den andra inställningarna skanna, utnyttja två lämpliga PMTs. Ändra kanalen färg till grönt för autofluorescens och rött för DiD. Notera: att använda grön som autofluorescenskanal möjliggör enklare upptäcka gjorde positiva celler när de två kanalerna överlagras - autofluorescerande celler visas som gul / orange på grund av att både kanaler samtidigt DiD celler verkar bara som rött, eftersom de verkar bara i DiD kanal. Auto-fluorescens kanalanvänds endast för denna jämförelse och används inte i någon slutändan, men om användaren önskar, kan den ha ändrats till en annan färg till för att undvika förväxling med GFP-kanalen.
   5. Slutligen installations den tredje och sista skanning för GFP (488 nm excitation, 500-530 nm emission); se till att slutaren är öppen om det behövs och sedan ställa in lasereffekten på 488 nm laserlinjen till ca 15% eller en lämplig nivå för lasern som används, välj en lämplig PMT som enda verksamma detektorn och ändra dess pseudo till grönt.
   6. Aktivera en "Live" bildläge för att inleda en förhandsskanning för vald kanal och justera detektor Gain och Offset för optimal exponering. Upprepa detta för varje skanning i den sekventiella fönstret.
   7. Spara inställningarna för dessa flerkanalsökningar för enkel återanvändning. OBS: Detta tillåter användaren att ladda om inställningarna i efterföljande sessioner.
3. Aktivera fler-position, kallad "Markera ennd Hitta "i demonstrerade mjukvara och återställa koordinatpunkter.
4. Skanna benet bildområdet, från korsningen mellan centrala och kronsömmen, skanna djupet av benmärgs området med hjälp av både autofluorescens (pseudo färgad grön) och gjorde (pseudo-färgad röd) med en sammansatt vy. OBS: autofluorescerande celler kommer att finnas i båda kanalerna och verkar orange / gult i den sammansatta bilden medan DiD märkta celler visas som enbart röda celler i den sammansatta bilden.
5. När en cell upptäcks, markera detta som en ny koordinatposition (x, y och z) i "Mark och Sök" verktyget genom att klicka på "Lägg till ny position ikon på vänster sida av" Mark och finn "fönster .
6. När den aktuella synfältet har undersökts, flytta skede avstånd av en synfält antingen vänster / höger / ner / upp. Upprepa processen för varje synfält, gradvis arbeta runt hela bildfönstret området till vänster om the central sutur, går mot näsan på musen. När den centrala suturen bifurkation är i sikte, flytta till den högra sidan av suturen och upprepa proceduren skanna den vänstra sidan i motsatt riktning (dvs mot kronsömmen). Markera koordinaterna för eventuella nya celler av intresse med hjälp av "Mark och Sök" verktyg.
7. När scanning av bildfönstret är klar, använda "Mark och hitta" verktyg för att granska de punkter (välja önskad punkt och granska varje punkt för sig). Ställ in toppen och botten av en Z-stack runt varje cell för varje position, (många programvaruplattformar gör att du kan utföra oberoende z-stackar för varje position, vilket minskar fånga tomrum). För varje punkt, fokus upp och ner och sätta övre och nedre positionerna Z för 3D z-stack fånga och uppdatera den enskilda punkten i "Mark och Sök". Ställ Z-Stack intervallet till 5 pm och genomsnitt för varje sekventiell skanning kanal till en lämplig kvalitet: Linje or Frame genomsnittet. OBS: Öka antalet skanningar i genomsnitt ökar längden på anskaffningstiden.
8. Skaffa en högkvalitativ referens stacken för varje punkt i intresse genom att starta hela skanning (ofta kallad "Start" i stället för "Capture"). OBS: den här analysen kan fungera som en referens för framtida höghastighets avbildning.
9. När du är klar med det högkvalitativa skanning, aktivera en time-lapse inställning för fångst.
10. I tidsförlopp inställningar ställa in tidsintervallet till 5 minuter och total körtid till önskad längd (t ex 5 timmar). "Verkställ" inställningarna till den totala scan. OBS: För att minska denna skanning tid för att möjliggöra en 5 min time lapse intervallet, kan man behöva minska antalet skanningar som används för medelvärdes, begränsa upplösningen till 512 x 512 bildpunkter, konvertera skanning till dubbelriktade (med behov korrektionsfasen att anpassa både skannings riktningarna), och / eller öka sökningshastigheten till 600 Hz eller mer (mer än 600Hz orsakar zoomning av avbildningsområdet för visat mjukvaruplattform). Det är också viktigt att notera att medan en sekventiell bildläge användes för att få en hög bildkvalitet stack från början, är samtidigt förvärvar används för att öka hastigheten under den tidsförlopp imaging - detta kan medföra vissa smärre överhörning mellan kanalerna vilket ställer extra vikt vid den inledande tillfångatagande av de noggrant separerade referens stackar.
11. Påbörja avbildning (som tidigare genom att klicka på "Start"-knappen i demonstrerade programvara). OBS: se till att upprätthålla en lämplig nivå av anestesi genom administrering ytterligare, mindre doser när det behövs, är noga med att inte överdosera musen, regelbundet fylla på vatten för att säkerställa målet torkar inte ut och övervaka vitala tecken och värme-pad temperatur hela.
12. När du är klar, ta upp linsen från hållaren och ta bort hållaren från mikroskop scenen och se trådarna från rektalsonden och häta matta inte skadas.
13. Skruva av headpiece från scenen hållaren och ta försiktigt bort musen. Gallra musen med halsdislokation och ta bort metallhuvud-lappar genom att snäppa bort skallen. Spara data till disk och överföring till server för senare analys. OBS: huvudstycke är idealiskt rengöras genom doppning i aceton under några timmar och slutligen gnugga rest cement av.

Representative Results

Den specialtillverkade, hög precision mushållare inklusive ett calvarium imaging fönstret kan långvarig avbildning av FACS renade, märkta HSPCs injiceras i letalt bestrålade mottagarmöss (Figur 1A). Typiskt, efter injektion av mellan 15 till 20.000 märkta celler, 8-15 celler är vanligtvis igenkännbar i benmärgen avbildning område av skallen följande dag. Här visas hur att förvärva enstaka cell upplösning 3D högar av HSPC-innehållande benmärgsområden på cirka 90 till 120 ìm tjocklek, (Figur 1B), följt av 4D time-lapse filmer av HSPCs identifierats (Figur 1C och film).

Suboptimala resultat erhålles om den dentala cement inte är optimalt förberedd, exempelvis vatten kan läcka från icke förseglade områden, och även om det kan fyllas på från toppen av innehavaren, inte den tid då linsen är inte doppas i vatten leder till svarta f Rames. Vissa drift i bilderna är oundviklig på grund av termisk expansion av material musen hållaren, men det kan accentueras av suboptimal cement vidhäftning, vilket leder till progressiv avlossning av musen, och störningar i bild inrättats, vilket leder till plötsliga hopp i fokus under time-lapse avbildning. Drift under flera punkter time-lapse avbildning kan också orsakas av felaktigheter i scen rörelser när återbesök tidigare avbildade positioner. Drift och stamma artefakter i tidsförlopp filmer kan korrigeras för genom att använda bildregistreringsalgoritmer.

Tabell 1 Excite och inställningar utsläpp.

13px; "> 488 nm

Färg Kanal	Excitation	Emission
GFP	500-530 nm
Autofluorescens	543 nm	560-610 nm
DiD	633 nm	640-700 nm
SHG	840 nm (MP)	400-450 nm

Figur 1 In vivo 4D avbildning av HSPCs i mus calvarium. (A) Sammanfattning av experimentet (B - C).. Exempel på erhållna resultat (B) 2D skivor från en 3D stack (djup är 114 nm), som innehåller signalen från kollagen ben (vit), gjorde märkta celler (röd) , självfluorescerande cells (gul) och osteoblastceller (grön). Skala barer:. 100 ìm (C) 2D skivor från en 4D time-lapse-film som visar en DiD märkt HSC (röd) migrerar i närheten av osteoblastceller (grön). Den prickade linjen belyser förskjutningen av cellen. Skalstrecken: 50 ^ m (B) och 100 | im (C). OBS. Filmen erhålls från tidsförlopp förvärv i (C) visas under video artikeln Klicka här för att se en större version av denna siffra.

Discussion

Vad skedde?

Protokollet använder time-lapse flerdimensionell avbildning för att övervaka migrationen av FACS renat, ex vivo märkta, transplanterade HSPCs i mus calvarial benmärg. Identifiering av enskilda transplanterade cellerna har åstadkommits och dessa har övervakas under längre tidsperioder (timmar) med hög noggrannhet. Andnings inducerade rörelse artefakter har minimerats och celler har upprepade gånger återavbildas under en längre tidsförlopp.

Vilka framtida inriktningar?

Utvecklingen av tekniken skulle kunna gå mot återhämtning experiment för att möjliggöra avbildning på flera dagar, under loppet av en vecka eller mer och användning av gas anestetika såsom isofluran att förkorta och förenkla återhämtningsprocessen för musen (OBS: återvinning experiment kräver strikt sterila kirurgi villkor och administration av lämpliga analgetika). Deveckling av en större färgpalett av in vivo färgämnen samt effektiv genetisk märkning av hematopoetiska celler kommer också att underlätta flera märkningsexperiment, ge mer insikt i cell-cell interaktioner inom benmärgen och möjliggöra mer komplexa experiment i framtiden. Dessutom kommer samtidig märkning av flera benmärgsstrukturer och stroma komponenter ger en mer fullständig bild av de händelser som äger rum i HSPC nischer. Bild stabiliteten i time-lapse filmer kan förbättras preacquisition genom att stabilisera mikroskopet ytterligare samt minimera temperaturgradienter i urvalet och postacquisition med bildregistreringsalgoritmer.

Begränsningar:

Den teknik som beskrivs presenteras vissa begränsningar. Överlevnad av möss efter administrering av injicerbara anestetika är oförutsägbar och det är väldigt lätt att uppleva komplikationer beroende på individuellt svar påbedövningsmedel. I allmänhet är längre en avbildning session svårare för musen för att återhämta sig från anestesi och det är därför viktigt att noga planera om musen är som skall återvinnas, helst begränsa varaktigheten av tidsförlopp avbildning. Användning av injicerbara bedövningsmedel begränsar den tid varje bildsession kan pågå. Även om det är möjligt att förlänga anestesi genom readministering en mindre dos av narkosmedel, är det svårt att utföra detta noggrant och överdosering musen är en av de vanligaste orsakerna till förtida uppsägning av in vivo imaging. Gas anestesi är mindre giftiga och möjliggör en längre inledande bildsession, men snabb återhämtning av musen efter> 2 h lång administrering av isofluran är sällan framgångsrika. En annan begränsning av tekniken är den begränsade upplösningen av bilderna, som kan erhållas under flerpunktstidsförlopp avbildning, på grund av nödvändigheten att förvärva bilder snabbt. Detta, i kombination med fokal drift eller fält hoppar (skivaussed ovan), kan göra spårning av celler svårt.

Jämförelse med alternativa metoder:

HSPCs är vanligtvis märkt med det lipofila färgämnet gjorde, men DIR och DII färgämnen är likvärdiga alternativ och andra cell färgämnen kan användas så länge som tillräckligt ljust, som granskas i ^[16]. Även om ex vivo märkning av celler med DiD har visat sig inte påverka den långsiktiga funktion HSCs har den begränsningen att DiD (eller andra kemiska färgämne) späds vid celldelning. Sedan HSCs proliferera under de första dagarna efter transplantationen, signal-brusförhållandet för dessa celler försämras snabbt. Endogen märkning av celler med hjälp av genetisk manipulering och expression av fluorescerande proteiner är en genomförbar alternativ metod, så länge som de fluorescerande proteiner uttrycks vid tillräckligt höga nivåer för att generera signal detekterbar genom skallbenet. Det finns ett antal alternativ Techniques tillgängliga för att utföra avbildning av HSPCs i benmärgen utrymme, alla med sina egna fördelar och begränsningar. Insättning av fiberoptiska baserade bildenheter tillåts för avbildning av benmärg beredning i långa ben ^[8], medan konfokal avbildning efter kirurgisk exponering av skenbenet och gallring av ben emalj med en kirurgisk borr ^[12] produceras detaljerade bilder av HSPCs bosatta i de perifera områdena i långa ben. Dessa metoder dock är mycket mer invasiv än den som beskrivs här och är därför inte möjligt att upprepa avbildning sessioner med fokus på samma benmärgs område inom samma mus. Dessutom är det möjligt att dessa tekniker kan påverka celler som observerats med tanke på den oundvikliga svaret på omfattande skador på den omgivande vävnaden. HSPCs har avbildat under korta tidsperioder genom täckglas placeras över utskurna, brutna lårbenet ^[11], inte clea dock effekterna av denna hårda förberedelserna av vävnad på HSPCsr och den teknik som användes för unikt för att erhålla enstaka tidspunktobservationer. Fasta ben har uppställd i seriesnitt, färgade, och de erhållna bilderna rekonstrueras i en 3D-modell, som ger utmärkt 3D-upplösning, särskilt när kärl avgjutningar används ^[17], och nyligen laserscanning Cytometry (LaSC) har använts för att erhålla kvantitativa åtgärder om HSPCs in situ, markeras av immunfärgning ^[18], men kan inte ge någon tidsmässig information om celler beteende. De tekniker som beskrivs i den nya tekniken ger en kombination av god upplösning i 3D, tillräcklig tids provtagning för övervakning av celler i 4D och de är relativt icke-invasiv, därför erbjuder en idealisk metod för att uppnå långsiktig uppföljning av HSPCs interagera med benmärgen mikromiljö.

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
Ketamine (Narketan 100 mg/ml)	Vetoquinol	407575 0107 C	Other anesthetics may be used in place of this.
Medetomidine (Domitor 1 mg/ml)	Elanco	134800-2	Other analgesics may be used in place of this.
Vibrant DiD cell labeling solution	Roche Products Ltd.	V22887	Other colors are available and may be used if required.
Lacrilube ophtalmic ointment	Allergan	n/a	avaliable by prescription by the local vet
Kemdent "Diamond Carve" glass ionomer cement	Associated Dental Products Ltd. via Kemdent	SUN527	We use shade A3, but any shade of cement can be used.
PBS	multiple equivalent
Insulin syringes	Terumo Medical Corporation	SS10M3109	1 ml, 31 G
Mouse restrainer	Harvard Apparatus	340031	Cone type (small)
Autoclaved forceps and scissors	Agar Scientific	AGT577 AGT5034	Iris scissors - 90 mm; Dumont HP tweezers (0.06 mm tip)
Weigh boat and cement stirrer	VWR	611-1996/231-0370	5 ml weigh-boat (black)/ Wooden tongue depressor
Leica SP5 upright confocal microscope with motorized stage and two-photon laser	Leica Microsystems		Call for quote
25x water dipping objective lens (N.A. = 0.95)	Leica Microsystems	11506323	HCX IRAPO L lens
Custom designed mouse holder	Imperial College Engineering Workshop		See Figure 1 for details
Heating pad with rectal thermometer probe	BASi Instrumentation	FHC-40902/ FHC-40908/ FHC-4090502	Heat mat/ Control box/ Thermometer probe