Abstract
Äggstockscancer är den mest dödliga gynekologisk malignitet i USA. Även patienter som initialt svarar på dagens standardbehandling bestående av kirurgisk debulking och kombinationskemoterapi som består av platina och taxanföreningar, nästan 90% av patienterna återkommer inom några år. Hos dessa patienter utvecklingen av kemoterapiresistent sjukdom begränsar effekten över annonser för kemoterapeutiska medel och bidrar till den höga dödligheten alltså. Att upptäcka nya terapialternativ som kan rikta återkommande sjukdom, är lämpliga djurmodeller som nära efterliknar den kliniska profilen hos patienter med återkommande äggstockscancer krävs. Utmaningen i att övervaka intraperitonealt (ip) sjukdomen begränsar användningen av ip-modeller och därmed de flesta xenografter är etablerade subkutant. Vi har utvecklat en känslig optisk avbildning plattform som tillåter detektering och anatomiska lokaliseringen av ip tumörmassa. Plattformen inkluderar usig av optiska reportrar som sträcker sig från det synliga ljusområdet till nära infrarött, som i kombination med 2-dimensionell röntgen co-registrering kan ge anatomisk lokalisering av molekylära signaler. Detektering förbättras signifikant genom användning av ett rotationssystem som driver djuret till flera vinkellägen för 360 graders avbildning, vilket möjliggör identifiering av tumörer som inte är synliga i enda orientering. Denna plattform ger en unik modell för att icke-invasivt monitor tumörtillväxt och utvärdera effekten av nya terapier för förebyggande eller behandling av återkommande äggstockscancer.
Introduction
Djurmodeller är oumbärliga verktyg för biovetenskaplig forskning. I cancer i synnerhet, data som erhållits från djurstudier ge nödvändig information som krävs för att inleda testningen av nya diagnostiska eller terapeutiska tillämpningar hos människor 1-3. Djurmodeller för solida cancrar är klassiskt etablerade subkutant, eftersom det är ett enkelt sätt att mäta tumörbördan och utvärdera behandlingseffekt utan att behöva offra djuren. Indeed, intra-peritoneala (ip) modeller kräver att djur offras för att detektera och mäta eventuella förändringar i tumörtillväxt. Men för ip cancerformer äggstockscancer, ortotropiska modeller erbjuder fördelen att studera sjukdomen i sin rätta miljö 4-6. För att en sådan modell för att vara användbar vid utvärdering av antitumöraktivitet, icke-invasiva avbildningsmetoder behöver utvecklas som tillåter kvantifiering av ip tumörbörda i levande möss.
En stor utmaning ianvändning av ip djurmodeller är svårigheten att exakt kvantifiera tumörbörda genom fysisk undersökning. Exakt kvantifiering av ip tumörer kräver vanligtvis mössen som ska offras för dissekering. Detta tillvägagångssätt kräver användning av stora antal djur, som skulle offras vid olika tidpunkter. Utöver kostnaden införs hög data variabilitet till följd av inneboende variationer inom varje djur. Icke-invasiv in vivo optisk avbildning ger en mer passande metod för att övervaka ip tumörbördan i levande möss.
Flera icke-invasiva avbildningsmetoder används för närvarande i preklinisk forskning för övervakning av tumörtillväxt och terapisvar. Dessa innefattar datortomografi (CT), ultraljud (US), magnetresonansavbildning (MRI), positronemissionstomografi (PET), och optisk avbildning såsom fluorescens och bioluminescens 7-12. CT är en transmissionsavbildningsprocess kombinerar röntgen och computER-teknik. Den producerar ett tvärsnitt bild av detekterade strålar med hög energi fotonen, som passerar genom kroppen med olika hastighet. USA är en typ av reflektionsbild, som skickar högfrekventa ljud till kroppens skapa ljudvågor som reflekteras med olika hastighet beroende på vävnadsdensitet och känns igen av datorn för att producera en visuell bild. MRI och PET är avbildningsutsläpps modaliteter som använder magnetisk energi och kärnpartiklar, respektive för att producera en bild. MRI skapar ett starkt magnetfält som inducerar celler att producera egna radiofrekvenser som används för att skapa en bild, medan PET kräver en känslig kamera för att upptäcka radioaktivitet administreras märkt 2-fluorodeoxy-D-glukos 7,9,11. Slutligen är optisk avbildning baserad på detektering av det emitterade ljuset av bioluminiscerande eller fluorescerande reportrar eller prober 9,12.
I denna rapport beskriver vi användandet av fluorescens, som erbjudernågra fördelar jämfört med de andra typerna av avbildningsmetoder. Med fluorescens avbildning kan celler manipuleras genetiskt för att uttrycka fluorescerande proteiner kontinuerligt utan att erfordra tillsats av ett substrat eller ligerings-baserad prober, vilka är erforderliga för bioluminescens och magnetisk resonanstomografi, respektive. Fluorescens reportrar också typiskt uttryck för en ljusare signal vilket gör det möjligt att använda en mindre känslig detektionsmetod 8,12. Dessutom är det med fluorescens avbildning möjligt att detektera tumörer som är mindre än 1 cm, vilket inte kan uppnås med CT 7-9. Slutligen, i motsats till bioluminiscens, fluorescenssignal kräver inte en aerob miljö och som därför signalen inte är begränsad i hypoxiska miljöer, som vanligtvis förekommer i kärnorna i stora tumörer 13.
Men som all annan teknik, lysrörsbaserade avbildningsmetoder har sina nackdelar. Varav en är oförmåga machine genererade låg energi fotoner för att tränga in till ett tillräckligt djup. Således, för att minimera mängden diffunderade vävnads fotoner djuren ska avbildas i olika vinklar. Vi beskriver ett protokoll för att upprätta en ip äggstockscancer i nakna möss och ett tillvägagångssätt för ip tumörövervakning som ger hela djuret avbildning genom rotation. Rotator vinklar musen till specifika och repeterbara positioner minskande vävnaden störningar som ofta uppstår mellan ljuskällan och detektorn. Detta optimerar visualisering av mindre tumörer som annars kan missas.
Protocol
Yale University Institutional Animal Care och användning kommittén godkänna allt arbete in vivo beskrivs. Provsamling utfördes med patientens medgivande och godkänts av mänskliga Undersökningar kommittén Yale University School of Medicine.
1. Framställning av humana ovariala cancerceller
- Innan du förbereder cellerna se till att alla material som krävs för intrauterin injektion som beskrivs nedan är redo och lättillgänglig. Injicera cellsuspensionen så snart den är klar.
- Växa fluorescensmärkta cancerceller i odling. Vi använder en F2-generation av humant CD44 + / MyD88 + äggstockscancerceller, som vi tidigare visat att hysa stemness egenskaper såsom tumorigenicitet, chemoresistance och hög kapacitet för tumör reparation 14-19. Dessa celler genererades för att stabilt uttrycka mCherry fluorescens (F2-mCherry, Fig. 1) med användning av lentivirus produceras från polyetylenimin(PEI) protokoll 20,21.
- På injektionsdagen, skörda cellerna genom trypsinisering och tvätta en gång med fosfatbuffrad saltlösning (PBS).
- Bestäm cellräkning och suspendera cellerna vid 3 x 10 6 celler / 50 pl i lämplig tillväxtmedier. För äggstockscancerceller använder vi RPMI 160 med 10% FBS. Hålla cellerna i inkubatorn tills redo att injicera men håller inte längre än 15 min. Detta är tillräckligt för en mus injektion.
2. intrauterin Injektion av Human Ovarian cancerceller i atymiska nakna möss
Observera att följande procedur kräver hjälp från en annan person. Dessutom, eftersom detta är överlevnad kirurgi, använda sterila kirurgiska instrument. Denna överlevnad kirurgi förfarande bör ta cirka 10 till 15 min.
- Söva musen med 2% isofluran. 7- till 8 veckor gamla atymiska nakna möss användes typiskt.
- Verifiera att djuret är completely bedövades genom att klämma foten pad med fingrarna eller pincett. Djuret ska vara helt icke-mottagliga för smärtan före start av operation.
- Placera sövd mus ventrala sidan upp på en steril kompress med huvudet bort från utredaren.
- Applicera salva på ögonen med en bomullsspets applikator för att förhindra torrhet under narkos.
- Omedelbart sätta in huvudet i en noskon system anslutet till en isofluran förångare (Fig. 2A). Detta ger anestesi under hela det kirurgiska ingreppet.
- Desinficera den vänstra (eller högra) sidan av buken med hjälp av alkoholdynor (Fig. 2B) följt av jod sedan placera en steril kirurgisk duk över den kirurgiska platsen.
- Använda sterila kirurgiska saxar och tänger göra ett 1-2 cm snitt i huden på den nedre vänstra kvadranten av musen (fig. 2C).
- Lyft muskel och göra ett snitt för att nå bukhinnan. <li> Dissekera sneda ögonmuskeln för att exponera bukhålan.
- Lokalisera och identifiera den vänstra livmoderhornet (Fig. 2D).
- Använd steril hemostat, klämma både främre och bakre sidan av hornet (Fig. 2E). Placera den främre klämman precis nedanför äggledaren och den bakre klämman precis ovanför livmoderhalsen.
- Låt den andra personen injicera cellsuspension. Placera nålen innehållande celler, vid 45 ° vinkel som är vinkelrät mot hornet (fig. 2F). Mycket långsamt injicera 50 | il av cellsuspension in i lumen av livmoderhornet.
- Ta bort nålen och släpp den främre klämman.
- Frigöra den bakre klämman och ersätta livmoderhornet i bukhålan.
- Stäng bukhinnan med hjälp av en syntetisk absorberbar sutur och stänga huden med användning av ett vävnadsvidhäftningsmedel.
- Ta bort musen från noskonen och placera tillbaka i buren. Om det behövs, ändra sängkläder för att säkerställa en clean bur efter operationen. Se till att alla djur är vaken och aktiv innan du lämnar obevakad.
- Ge Ibuprofen vid 0.11 mg / ml dricksvatten för första 48 timmar efter operationen. Efteråt, ersätt med vanlig dricksvatten.
- Observera: att om atymiska nakna möss används och huden stängs med vävnadsadhesiv istället för suturer, är det inte nödvändigt att separera möss efter operation. SCID-möss är mer aggressiva och kan behöva separeras.
- Noga övervaka platsen för snittet för eventuell infektion på grund av öppet sår.
3. Detektion av Early Stage Intra-peritoneal äggstockscancer från Live In Vivo Imaging
Bestäm förekomst av intraperitoneal ip sjukdom med levande in vivo imaging. En Multimodal Animal Rotation System (MARS) används i detta protokoll.
- Gå till MARS fånga programvara inifrån MI programvaran. Denna modul gersamordnad kontroll av MARS fånga inställningar samtidigt utnyttja bildsystemets fånga och analysmöjligheter. Optimera individuella inställningar för fotografering för varje modalitet med en enda-view avbildning innan utveckla rotations protokollet i steg 3.4.
- Ingång förbestämd fånga värden. För fluorescens fånga, använder 10 sek exponering, 2 x 2 binning, f-stop 2.8, FOV 120 mm, ex: 550 nm, em: 600 nm filter fånga inställningen. För röntgen fånga, använd en 10 sek exponering, 2 x 2 binning, f-stop 2.8, FOV 120 mm, 35 kVp, 0,4 mm Al filter fånga inställningen.
- Spara parametrarna i steg 3.2 som individuella sessionsfiler.
- Skapa en rotationssekvens protokoll genom att välja Skapa / Redigera Protocols knappen från systemgränssnittet förvärva fönster.
- Välj den tidigare sparade fluorescens sessionsfil och spara som steg ett. Därefter väljer du motsvarande röntgen sessionsfil och spara som steg två.
- Med steg ett valt att använda Set RotationSerien från Före Bildinsamling popupmenyn för att ställa in önskad startvinkel, intervall, och ökningen för att säkerställa sömlös visualisering av funktioner. De specifika värden inkluderar en startvinkel -180 grader, ett område av 375 grader, och en ökning på 15 grader.
- Spara protokollet och klicka på knappen Klar för att initiera MARS och kartlägga stegmotorpositioner som motsvarar varje steg vinkeln.
- Utför den sista kalibreringen som beskrivs nedan för att rikta den ventrala, dorsala och laterala vyer för det specifika djuret placeras i djuret stöd med specifika grader av rotation som skall användas av den mjukvara protokoll.
- Bedöva musen med användning av en blandning av medicinsk luft och 2% isofluran vid en flödeshastighet av 2 l / min.
- Starta justeringen genom att klicka på knappen Förhandsgranska inifrån Acquire menyn för att öppna fliken Rotator. Använd det reflekterande ljuset modalitet snarare än multivåglängds eller X-ray metoder för att påskynda processen.
- Välj Load Mouse alternativet och gå igenom serien av positionerings menyer.
- Se till att tubed slutet av hopfällbara noskonen är i noskonen urtaget och placera musen i liggande orientering med huvudet i noskonen.
- Påbörja kalibrering vid 0 graders läge med den ventrala sidan av djuret vänd nedåt. Använd de två vreden på rotationssystemet att placera djuret så att den verkar centrerad i förhandsgranskningsfönstret.
- Upprepa processen som tillfrågas om -180, - 90, 90, och +180 grader positioner och klicka på Klart.
- Kör den sparade protokoll genom att klicka på protokollet knappen Kör från huvud förvärva fönstret. Under genomförandet av protokollet, observerar ett statusfönster som ger uppdateringar i realtid status för aktuell Capture, Exponeringstid och övergripande protokoll steg.
- Montera enskilda bilder till en film-format med hjälp avRotation programvara. Använd Bildskärmskontroll för att justera ljusstyrka / kontrast, öppenhet, och för att ställa in visningsfärgen för fluorescenssignalen.
- Exportera den sista bildsekvensen i * .avi filformat för presentation.
4. Administration av 1: a och 2: a rundan Cytostatika
- Efter ip tumördetektion från MARS, bestämma den initiala tumörbörda regionen av intresse (ROI) med standard tvådimensionell positionering. Detta sker på ett transparent djur bricka monterad i avbildningssystemet som beskrivs nedan i avsnitt 5. När första ROI bestäms, administrera 4 doser av 12 mg / kg Paclitaxel ip var tredje dag. Paclitaxel erhålls från Hospira Inc i en ready-to-go formulering med Cremaphor som fordon. Vi har tidigare visat att denna behandlingsregim har signifikant antitumöraktivitet mot xenograft-modellen jämfört med vehikelkontroll och inducerar fullständig utrotning av detekterbar tumor börda 20. Men på grund av sjukdomens art, ip tumörer återkommer ett par dagar efter behandlingen avslutas 20.
- Övervaka svar på behandling genom avbildning var 3 dagar med standard tvådimensionell positionering.
- Efter den fjärde dosen av Paclitaxel, klassificera mössen ha komplett respons (ROI mindre än 2.000), partiellt svar (upp till 35% minskning från utgångs ROI erhållits från steg 4.1, stabil sjukdom (upp till 50% ökning från den ursprungliga ROI ), eller progression med behandlingen (mer än 50% ökning från ursprungliga ROI) baserat på den fluorescenssignal observeras.
- För möss med komplett respons, övervakar återfall genom att avbilda var 3 dagar. När återfall observeras (ROI = initial ROI i steg 4.1), åter inleda den andra omgången av Paclitaxel enligt beskrivningen i 4.1.
- Hos möss med partiell sjukdom, stabil sjukdom, eller de som gått med behandling, åter initiera andra omgången av Paclitaxel 3 dagar efter den 4: e dosenav Paclitaxel. Likaså bild dessa varje tre dagar.
5. Övervakning Svar på behandling använder standard Tvådimensionell Positionering
- Söva möss som skall avbildas med användning av en blandning av medicinsk luft och 2% isofluran vid en flödeshastighet av 2 l / min.
- Placera huvudet på de sövda möss i enskilda nosecones i genomskinliga djurmagasinet inom avbildning kammaren (Fig. 3).
- Mata in de förutbestämda exponeringsparametrar för fluorescens (10 sek exponering, 2 x 2 binning, f-stop 2.8, FOV 120 mm, ex: 550 nm, em: 600 nm) och röntgen (20 sek exponering, 2 x 2 binning, f-stop 2.8, FOV 120 mm, 35 kVp, 0,4 mm Al-filter).
- Klicka Exponera att fånga både bilder i sekvens.
- Öppna bilderna i Bruker MI programvara för visuell inspektion och regionen av intresse analys.
6. Bildöver och analys
För att ge en giltig jämförelse efter both visuell och kvantitativ analys av tidsförloppet bildsekvens processen alla för- och bakgrundsbilder på samma sätt.
- Öppna både förgrunden bild (t.ex. fluorescens) och bakgrunds bildbehandling i programvaran och välj kakel funktionen på Fönster-menyn högst upp (Fig. 4A).
- För att bearbeta förgrundsbilden; Öppna bildskärmen fliken i det översta fältet (fig. 4A, röd pil) och ställ in min / max värden till 260 och 5000, respektive (fig. 4A, blå pil)
OBS: bildskärmen Området skiljer mellan olika studier beroende på fluorescenssignalen intensiteter fångas i bilderna. Bilder ska ställas mot en min / max som visar tumörmassor, som ännu inte visar bakgrund från autofluorescens av djuret. - Nästa öppna Auto ROI Tab från navigationspanelen till vänster (fig. 4B, röd pil) och välj New ROI Set från menyn (fig. 4C, röd arrow). Justera inställningarna för att använda Threshold algoritmen på 630 gråskala nivåer och avmarkera Begränsa storlek Max för att garantera alla potentiella ROI registreras (fig. 4C).
Obs: Tröskel inställningar kan skilja sig från studie till studie beroende på fluorescenssignalen intensiteter fångas i bilderna. Bilder tröskel att kvantifiera signal från tumörmassor ännu inte mäta signal från bakgrund från autofluorescens av djuret. - Inifrån bildskärmen fönstret välj Mask. Nu bara det område som motsvarar de pixlar som har värden som är lika med eller överstiger tröskelvärdet på 630 gråskala nivåer kommer att visas.
- Om du vill visa de kvantitativa resultaten välj fliken Analysis från den övre menyraden och välj fliken Visning (Fig. 4D, röda pilar).
- Från menyn Display välja serienummer, Sum, Mean, och området kryssrutor och klicka på OK.
- Spara bilden så att värdena kan vara exporteras tillsammans när alla fluorescens bilderna bearbetas.
- Nästa, markera röntgenbilden och återigen öppna bildskärmen från den övre menyraden. Ställ in värdena för min, max och gamma för att ge bästa visuell representation av musen skelettet.
OBS: Eftersom ingen kvantifiering utförs på röntgenbilder varje individuell röntgenbilden från tidssekvens kan behandlas (dvs min, max och gammavärden) för att producera den snyggaste representationen av den datamängd. - Återigen med röntgenbilden markerad Markera kryssrutan Overlay och väljer motsvarande fluorescens bild filnamnet från rullgardinsmenyn (Fig. 4E).
- För att extrahera overlayed utgång, välj fliken Anteckningar från navigationsmenyn (Fig. 4B, blå pil) till vänster. Välj lämpliga flikar för att lägga till ytterligare data eller text och slutligen lägga intensitetsskalan bar så fluorescensintensiteten data snabbt kan bestämmas från imålder.
- När anteckningarna är klara höjdpunkt alla objekt på Anteckningar sidan och välj kopiera på menyn Redigera i toppen och klistra in överskiktbilddata till rätt fil (t.ex. Word, PowerPoint och / eller Photoshop) för visning.
- Upprepa steg 6.1- 6.11 för alla par av fluorescens och röntgenbilder i sekvensen. Var noga med att säkra alla bilder innan du stänger dem.
- För slutlig kvantifiering öppna alla fluorescens bilder samtidigt och väljer kakel på Fönster-menyn längst upp.
- Nästa välja Exportera alla öppna dokument för att visa data.
Obs: I avsaknad av Excel-program avmarkerar fliken. MI kommer att generera en tabbavgränsad text (dvs. .txt) som kan överföras till en lämplig dator för vidare analys.
Representative Results
Icke-invasiv levande avbildning möjliggör övervakning av ip tumörprogression från samma möss genom tiden. Intrauterin injektion av mCherry-märkta F2 äggstockscancerceller med hjälp av den beskrivna protokollet ger synliga ip tumörer vid dag 5 och karcinomatos vid dag 32 (fig. 5). Figur 6 visar korrelationen av de erhållna bilderna med karcinomatos observerats efter offra mössen .
Avbildning med MARS medger detektering av ip tumörer som annars kommer att missa om bilden överförs från endast en enda plan. Figur 7 (övre panelen) visar att även i Kontroll möss med stor tumörbörda, kan tumörstorlek underskattas beroende på vinkeln bilden togs från. Förmågan att se till att tumörmassa inte missas eller underskattas är ännu viktigare vid slutet av 1: a omgången kemoterapi när djur kategoriseras som antingen en komplett svaraER, partiell responder, eller icke-responder (fig. 7 mellersta panelen). Likaså är det vid underhållsbehandling av yttersta vikt för att upptäcka mycket små återkommande tumörer att korrekt utse dagar till återfall, som definierar progressionsfri intervall (Fig. 7 mellersta panel).
Kvantitativ bedömning av tumörbördan optimeras genom djur rotation. Rotation av djuret till vinklar som kommer att minimera djupet excitation och emissionsljuset färdas genom kommer att möjliggöra en så exakt avskiljning av fotoner från den fluorescens, som är indikativ för den mängd av tumörceller och sålunda tumörbörda. Därför är kvantifiering optimerad för specifika tumörer i djur beroende på dess position i rotationssekvensen.
Genom att presentera bilder av rotationsdatamängder, är det viktigt att ge bilderna en min / max bildkontrastomfång som effektivt kommer att visa alla tumörmassor, med möjlighet till visu al avgränsning av individuella tumörmassor. För denna studie var perfekt kontrastomfång befunnits vara minst 50 punkter och en max 1.200 punkter. Dessa värden kan ses som en riktlinje för andra studier kommer dock optimala kontrastområdena skiljer sig från studie till studie beroende på tumörbördan nivå, fluorescerande peptiduttrycksnivåer i celler, systemkonfiguration bildbehandling, och inställningar för fotografering.
Figur 1: F2 äggstockscancerceller stabilt uttrycker mCherry fluorescens. (A) Phase bild; (B) fluorescensbilden; (C) överlagring av A och B. Observera att 100% av cellerna uttrycker fluorescensreporter.
s.jpg "width =" 600 "/>
Figur 2: intrauterin injektion av äggstockscancerceller. (A) anestesi administrerades kontinuerligt via en noskon; (BE) hud snittas för att lokalisera och klämma livmoderhorn; (F) cancerceller injiceras långsamt in i lumen av livmodern.
Figur 3: (A) 2D med en temperaturstyrd och nära krets ventilerad transparent djur fack inom avbildning kammare; (B, C) Skålen är försedd med noskoner att leverera anestesi och rymmer upp till fem möss.
<strong> Figur 4: Representant fönsterpaneler som tas från analysprogrammet för att hjälpa till dataanalys. Se text för förklaring.
Figur 5: Påvisande av mCherry fluorescens samlokaliserade med röntgen i längsavbildningssekvensen. Tre möss med ip tumör följs genom tiden för att bedöma ip tumörprogression. Observera att tumörprogression kan variera. Figuren är en representativ bild av 3 möss med olika hastigheter av tumörprogression och därmed varierande tumörbörda genom tiden.
Figur 6: Korrelation mellan ip tumörbörda (övre panelen) och fluorescens / röntgen overlay imaGE (nedre panelen). Cirka 32 dagar efter injektion av F2-mCherry äggstockscancerceller, 2D-imaging utförs och mössen korrelera verkliga tumörbördan med den förvärvade bilden. Röda pilar pekar på tumörbördan.
Figur 7: Rotation datamängder som tillåter flera vinklar avbildning och upptäckt av tumörer i Control (övre panelen), paklitaxel behandlad (mitten panel), och återkommande möss (nedre panelen). Figuren visar bilden av en enda mus per panel som det roteras med hjälp av MARS-systemet. Observera att även i Kontroll möss med stor tumörbörda, kan tumörstorlek underskattas beroende på vinkeln bilden togs från.
Discussion
Vi beskriver ett protokoll för att upprätta en ip human äggstockscancer djurmodell som efterliknar den kliniska profilen hos patienter. Dessutom beskriver vi användningen av en djurrotationsanordning som adresserar känsligheten begränsning av 2D-avbildning. Sammantaget kan dessa tekniker användas som plattformar för att upptäcka nya föreningar som kan rikta kemoresistenta recidiverande äggstockscancer. Dessutom kan en sådan modell kan användas för att förstå biologi cancerrecurrence och progression.
På grund av dess retroperitoneal läge, tidigt stadium ip äggstockscancer xenografter är nästan omöjligt att upptäcka genom att fysiskt undersöka musen. I de flesta fall, så snart sjukdomen kan palperas, är tumörbördan redan betydande och begränsar utvärdering av behandlingseffektivitet därför. Användningen av fluorescensmärkta celler tillåter oss att bedöma om ip tumör i realtid och därmed identifiera den optimala tiden för att börja treatment. På ett liknande sätt, fluorescensmärkta xenografter möjliggöra övervakning av behandlingssvar. Det bör påpekas-påpekar emellertid att ip tumörer djupare än 1 cm är vanligen inte detekterbar oberoende av reportersystem.
Användningen av mänskliga äggstockscancerstamceller 14,15,17,22 genererar xenotransplantat som efterliknar den kliniska profilen hos patienter. Som en primär sjukdom, är modellen svarar på Paclitaxel men avslutad behandling leder så småningom till kemoresistenta återkommande sjukdom. Presentation av cellerna genom livmoderhornen på densiteten anges i det protokoll avsnittet oftast resulterar i äggstockstumörer inom 10 dagar med ett fåtal peritoneal implantat, och därför härmar tidigt stadium av sjukdomen. Användningen av fluorescensmärkta celler tillåter oss att bedöma om ip tumör i realtid och därmed identifiera den optimala tiden för att börja behandlingen. På ett liknande sätt, fluorescensmärkta xenografter möjligt att övervaka of svar på behandlingen. Om andra typer av cancercellinjer används, äggstocks- eller på annat sätt, är det möjligt att denna profil inte kan observeras. När SKOV3 används till exempel, har det rapporterats att de ursprungliga ip tumörer är redan resistenta 23. Icke desto mindre, om märkt med en reporter såsom fluorescens, ip, sjukdomar kan följas i realtid.
Om andra fluorescerande reporter användes, är det viktigt att utföra inledande avbildning med en kontroll (ingen tumör) djur. Detta kommer att möjliggöra optimering av bildprotokoll för att uppnå den bästa bakgrunden till signalförhållande. Vår erfarenhet är nakna möss har normalt hög bakgrund när avbildas med hjälp av GFP förvärvsinställningarna.
Det är viktigt att celler injicerade intrauterin finns i enstaka fjädring för att undvika att inrätta tumörer i livmodern. Det är också viktigt att undvika att repa livmoder epitelskiktet, vilket också underlättar inympning av cancercellens i livmodern således skapas en intrauterin tumör i stället för en ip sjukdom. Dessutom, under analys av data, är det viktigt att ställa in gammavärdet till 1. Detta säkerställer att intensiteten hos bilderna är linjär och möjliggör jämförelse mellan bilderna.
Under förvärvs av MARS-bilder är det viktigt att säkerställa att den tubed änden av den hopfällbara noskonen är i noskonen urtagningen. Noskonen fungerar som en kontaktpunkt för musen och krävs därför för att få exakt kalibrerade vinklar. För längre avbildningsprotokoll (dvs mer än 1 timme), injicera 100 ul steril saltlösning subkutant för att förhindra uttorkning. Djurkroppstemperaturen bör upprätthållas med hjälp av varm luft strömmade genom systemet vid ca 37 ° C. En begränsning av Mars-systemet är att endast ett djur kan avbildas på en gång med en total körtid av omkring 1 timme per djur.
Sammanfattningsvis beskriver vi establishment av en djurmodell som nära efterliknar äggstockscancer, både primär och återkommande sjukdom. Denna modell kan användas för att utvärdera effekten av nya diagnostiska eller terapeutiska modaliteter.
Disclosures
Publicerings avgifter för denna artikel har delvis sponsrad av Bruker Corporation.
Acknowledgments
Denna studie stöddes av NIH bidrag RO1CA118678 och RO1CA127913, vid Sands Family Foundation, och Discovery för att bota Program.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| RPMI 1640 media | GIBCO, by Life Technologies | 23400-021 | |
| fetal bovine serum | Gemini Bioproducts | 100-106 | |
| T75 cell culture flasks | Corning | 430641 | |
| PBS | Life Technologies | 10010-023 | |
| Trypsin | GIBCO, by Life Technologies | 25300-054 | |
| Isoflurane | Butler Schein | NDC 11695-6776-1 | |
| Alcohol pads | Fischer Scientific | 06-669-62 | |
| 1 ml syringe | Becton Dickinson | 309602 | |
| 25 gauge needle | Becton Dickinson | 305122 | |
| synthetic absorbable suture | Covidien | SL-636 | |
| tissue adhesive | Vetbond | 1469SB | |
| surgical scissors | VWR | 82027-584 | |
| surgical forceps | VWR | 82027-386 | |
| hemostat | VWR | 82027-422 | |
| Paclitaxel | Hospira, Inc. | NDC 61703-345-50 | |
| Ibuprofen | Walgreens | Children's Ibuprofen 100 (100 mg/5 ml) | |
| Puralube Vet ointment | Pharmaderm | ||
| In vivo MS FX PRO | Bruker Corporation | ||
| MI software | Bruker Corporation | ||
| athymic nude mice | Harlan |
References
- Cho, K. R. Ovarian cancer update: lessons from morphology, molecules, and mice. Archives of pathology & laboratory medicine. 133, 1775-1781 (2009).
- Jong, M., Maina, T. Of mice and humans: are they the same?--Implications in cancer translational research. Journal of nuclear medicine : official publication, Society of Nuclear Medicine. 51, 501-504 (2010).
- Langdon, S. P. Animal modeling of cancer pathology and studying tumor response to therapy. Current drug targets. 13, 1535-1547 (2012).
- Mullany, L. K., Richards, J. S. Minireview: animal models and mechanisms of ovarian cancer development. Endocrinology. 153, 1585-1592 (2012).
- Ricci, F., Broggini, M., Damia, G. Revisiting ovarian cancer preclinical models: implications for a better management of the disease. Cancer treatment reviews. 39, 561-568 (2013).
- Pizzonia, J., et al. Multimodality animal rotation imaging system (Mars) for in vivo detection of intraperitoneal tumors. Am J Reprod Immunol. 67, 84-90 (2012).
- House, C. D., Hernandez, L., Annunziata, C. M. Recent Technological Advances in Using Mouse Models to Study Ovarian Cancer. Frontiers in oncology. 4, 26 (2014).
- Rao, J., Dragulescu-Andrasi, A., Yao, H. Fluorescence imaging in vivo: recent advances. Current opinion in biotechnology. 18, 17-25 (2007).
- Manegold-Brauer, G., Bellin, A. K., Tercanli, S., Lapaire, O., Heinzelmann-Schwarz, V. The special role of ultrasound for screening, staging and surveillance of malignant ovarian tumors: distinction from other methods of diagnostic imaging. Archives of gynecology and obstetrics. 289, 491-498 (2014).
- Zinn, K. R., et al. Noninvasive bioluminescence imaging in small animals. ILAR journal / National Research Council, Institute of Laboratory Animal Resources. 49, 103-115 (2008).
- Rockall, A. G., et al. Repeatability of Quantitative FDG-PET/CT and Contrast-Enhanced CT in Recurrent Ovarian Carcinoma: Test-Retest Measurements for Tumor FDG Uptake, Diameter, and Volume. Clin Cancer Res. 20, 2751-2760 (2014).
- Hickson, J. In vivo optical imaging: preclinical applications and considerations. Urologic oncology. 27, 295-297 (2009).
- Contag, C. H., Bachmann, M. H. Advances in in vivo bioluminescence imaging of gene expression. Annual review of biomedical engineering. 4, 235-260 (2002).
- Alvero, A. B., et al. Molecular phenotyping of human ovarian cancer stem cells unravels the mechanisms for repair and chemoresistance. Cell Cycle. 8, 158-166 (2009).
- Alvero, A. B., et al. Stem-like ovarian cancer cells can serve as tumor vascular progenitors. Stem Cells. 27, 2405-2413 (2009).
- Alvero, A. B., et al. NV-128, a novel isoflavone derivative, induces caspase-independent cell death through the Akt/mammalian target of rapamycin pathway. Cancer. , (2009).
- Chefetz, I., et al. TLR2 enhances ovarian cancer stem cell self-renewal and promotes tumor repair and recurrence. Cell Cycle. 12, 511-521 (2013).
- Liu, M., et al. High frequency of putative ovarian cancer stem cells with CD44/CK19 coexpression is associated with decreased progression-free intervals in patients with recurrent epithelial ovarian cancer. Reprod Sci. 20, 605-615 (2013).
- Steffensen, K. D., et al. Prevalence of epithelial ovarian cancer stem cells correlates with recurrence in early-stage ovarian cancer. J Oncol. 2011, 620523 (2011).
- Craveiro, V., Yang-Hartwich, Y., Holmberg, J., Sumi, N., Pizzonia, J., Griffin, B., Gill, S., Silasi, D., Azodi, M., Rutherford, T., Alvero, A. B., Mor, G. Phenotypic Modifications in Ovarian Cancer Stem Cells Following Paclitaxel Treatment. Cancer Medicine. , (2013).
- Kuroda, H., Marino, M. P., Kutner, R. H., Reiser, J., et al. Production of lentiviral vectors in protein-free media. Current protocols in cell biology / editorial board, Juan S. Bonifacino..[etal.]. 26, (2011).
- Yin, G., et al. Constitutive proteasomal degradation of TWIST-1 in epithelial-ovarian cancer stem cells impacts differentiation and metastatic potential. Oncogene. 32, 39-49 (2013).
- Vassileva, V., Allen, C. J., Piquette-Miller, M. Effects of sustained and intermittent paclitaxel therapy on tumor repopulation in ovarian cancer. Mol Cancer Ther. 7, 630-637 (2008).
