Abstract
Epitelial eggstokkreft er den mest dødelige gynekologisk kreft i USA. Selv om pasienter i utgangspunktet svare til dagens standardbehandling som består av kirurgisk debulking og kombinasjonskjemoterapi som består av platina og taxan forbindelser, nesten 90% av pasientene går igjen i løpet av få år. I disse pasientene utviklingen av sykdommen kjemoresistent begrenser effekten av tiden tilgjengelige kjemoterapeutiske midler, og derfor bidrar til høy dødelighet. Å oppdage nye behandlingsmuligheter som kan målrette tilbakevendende sykdom, er egnede dyremodeller som tett etterligner den kliniske profilen til pasienter med residiverende eggstokkreft nødvendig. Utfordringen i å overvåke intra-peritoneal (ip) sykdommen begrenser bruken av ip modeller og dermed de fleste xenografts er etablert subkutant. Vi har utviklet en følsom optisk imaging plattform som gjør det mulig å oppdage og anatomiske plasseringen av ip tumormasse. Plattformen inkluderer use av optiske reportere som strekker seg fra synlig lys til nær infrarødt spekter, som i kombinasjon med 2-dimensjonal røntgenstråle-co-registrering kan gi anatomisk lokalisering av molekyl signaler. Deteksjon blir betydelig forbedret ved bruk av en rotasjonssystem som driver dyret til flere vinkelposisjoner til 360 graders avbildning, slik at identifisering av tumorer som ikke er synlig i enkeltretning. Denne plattformen gir en unik modell til en ikke invasiv monitor tumorvekst og evaluere effekten av nye terapier for forebygging eller behandling av tilbakevendende kreft i eggstokkene.
Introduction
Dyremodeller er uunnværlige verktøy i life science forskning. I kreft spesielt, data ervervet fra dyrestudier gi nødvendig informasjon som kreves for å starte testing av nye diagnostiske eller terapeutiske bruksområder hos mennesker 1-3. Dyremodeller for solide kreftformer er klassisk etablert subkutant som det gir en enkel måte å måle tumorbelastning og evaluere behandlingseffekten uten å måtte ofre dyrene. Faktisk, intra-peritoneal (ip) modeller krever at dyr ofres for å oppdage og måle eventuelle endringer i tumorvekst. Imidlertid, for ip cancertyper slik eggstokkreft, ortotropiske modeller har den fordelen av å studere sykdommen i sin riktige miljø 4-6. For en slik modell for å være av anvendelse ved evaluering av antitumoraktivitet, ikke-invasive avbildningsmetoder trenger å bli utviklet som tillater kvantifisering av tumorbyrde ip i levende mus.
En stor utfordring iBruk av IP dyremodeller er vanskeligheten med nøyaktig kvantifisering av tumorbelastning ved fysisk undersøkelse. Nøyaktig kvantifisering av ip svulster vanligvis krever mus for å bli ofret for disseksjon. Denne fremgangsmåten krever bruk av høye antall dyr, som ville bli ofret ved forskjellige tidspunkter. I tillegg til kostnaden, introduserer den høye data variasjon på grunn av iboende variasjoner innenfor hvert dyr. Ikke-invasive in vivo optisk avbildning gir en mer passende måte å overvåke ip tumorbyrde i levende mus.
Flere ikke-invasive avbildningsmetoder er for tiden brukes i pre-klinisk forskning for overvåking av tumorvekst og terapeutiske svar. Disse omfatter computertomografi (CT), ultralyd (US), magnetisk resonans imaging (MRI), positronemisjonstomografi (PET), og optisk avbildning som fluorescens og bioluminescens 7-12. CT er en overføring avbildingsprosessen kombinere X-ray og computeh teknologi. Den produserer et tverrsnitt bilde av detekterte stråler av høy-energi-foton, som går gjennom kroppen med forskjellig hastighet. USA er en type refleksjon image, som sender høyfrekvente lyder til kroppen skaper lydbølger som reflekteres med forskjellig hastighet avhengig vevstetthet og gjenkjent av datamaskinen til å produsere et visuelt bilde. MR og PET er utslipps avbildningsmodaliteter som bruker magnetisk energi og kjernepartikler, henholdsvis for å frembringe bildet. MRI skaper et sterkt magnetisk felt som induserer celler til å produsere sine egne radiofrekvenser, som brukes til å skape et bilde mens PET krever en følsom kamera til å detektere radioaktiviteten av det administreres merket 2-fluorodeoxy-D-glukose 7,9,11. Til slutt blir optisk avbildning basert på deteksjonen av utslipp av lys bioluminescerende eller fluorescerende reportere eller sonder 9,12.
I denne rapporten beskriver vi bruk av fluorescens, som tilbyrnoen fordeler i forhold til de andre typer av bildediagnostikk. Med fluorescens-avbildning kan cellene fremstilles ved gensløyd for å uttrykke proteiner fluorescerende konstant uten å kreve tilsetning av et substrat eller en ligerings-baserte prober, som er nødvendige for bioluminescens og magnetisk resonansavbildning, respektivt. Fluorescens reportere uttrykker også typisk en lysere signal således tillater bruk av en mindre sensitiv deteksjonsmetode 8,12. I tillegg, med fluorescens-avbildning, er det mulig å detektere tumorer som er mindre enn 1 cm, som ikke er oppnåelig med CT 7-9. Til slutt, i motsetning til bioluminescens, betyr fluorescens-signalet krever ikke et aerobt miljø, og dermed signalet ikke er begrenset i hypoksiske omgivelser, som vanligvis forekommer i de kjerner av 13 store tumorer.
Imidlertid, som en hvilken som helst annen teknologi, fluorescerende-basert bildedannende fremgangsmåter har sine ulemper. En av dem er manglende evne til machine generert lavenergi fotoner til å trenge i tilstrekkelig dybde. For således å minimalisere mengden av diffust vev fotoner dyrene skal avbildes i forskjellige vinkler. Vi beskriver en protokoll for å etablere en ip eggstokkreft i nakne mus og en tilnærming for ip svulst overvåking som gir hele dyr avbildning gjennom rotasjon. Rotatoren vinkler musen til bestemte stillinger og repeterbare avtagende vevet forstyrrelser som ofte forekommer mellom lyskilden og detektoren. Dette optimaliserer visualisering av mindre svulster som ellers kan gå glipp av.
Protocol
The Yale University Institutional Animal Care og bruk komité godkjenne all in vivo arbeidet beskrevet. Prøvetaking ble utført med pasienten samtykke og godkjent av komiteen fra Yale University School of Medicine menneske Investigations.
1. Utarbeidelse av menneskelig eggstokkreft celler
- Før forbereder cellene sørge for at alle materialer som kreves for intrauterin injeksjon beskrevet nedenfor er klare og lett tilgjengelige. Injisere cellesuspensjonen så snart den er klar.
- Grow fluorescerende merkede kreftceller i kultur. Vi bruker et F2-generasjonen av menneskelig CD44 + / MyD88 + epitelovarialcancer kreftceller, som vi tidligere har vist til båtplass stemness egenskaper som tumorigenicity, chemoresistance og høy kapasitet for svulst reparasjon 14-19. Disse cellene ble samlet til å stabilt uttrykke mCherry fluorescens (F2-mCherry, fig. 1) ved hjelp av lentivirus fremstilt fra polyetylenimin(PEI) protokoll 20,21.
- På dagen for injeksjon, høste celler ved trypsinering og vaskes en gang med fosfatbufret saltvann (PBS).
- Bestem celletall og suspen cellene på 3 x 10 6 celler / 50 ul i passende vekstmedier. For eggstokkreft celler bruker vi RPMI 160 med 10% FBS. Hold cellene i kuvøse til den er klar til å injisere, men ikke holde lenger enn 15 min. Dette er nok for en mus injeksjon.
2. Intra-livmor Injeksjon av menneskelig eggstokkreft celler i atymiske Nude Mus
Vær oppmerksom på at følgende prosedyre krever assistanse fra en annen person. I tillegg, siden dette er å overleve operasjonen, bruke sterile kirurgiske instrumenter. Dette overlevelse kirurgi prosedyre bør ta ca 10 til 15 min.
- Anesthetize musen med 2% isofluran. 7- til 8 uker gamle atymiske nakne mus anvendes typisk.
- Kontroller at dyret er komplettely bedøvet ved å knipe foten pad bruker fingrene eller pinsett. Dyret skal være fullstendig ikke-responsiv til smerten før start av kirurgi.
- Plasser bedøvet mus ventral side opp på en steril kompress med hodet vekk fra etterforsker.
- Påfør salve på øynene med en bomulls-tip applikator for å hindre tørrhet mens under anestesi.
- Umiddelbart sette inn et innlegg i en nesekonus system koblet til en fordamper isofluran (fig. 2A). Dette leverer anestesi hele den kirurgiske prosedyren.
- Desinfiser venstre (eller høyre) side av magen ved hjelp av alkohol pads (Fig. 2B) etterfulgt av jod deretter plassere en steril kirurgisk drapere over operasjonsstedet.
- Ved hjelp av sterile kirurgiske sakser og pins foreta en 1-2 cm innsnitt på den nedre venstre kvadrant av mus (fig. 2C).
- Løft muskel og lage et snitt for å nå bukhinnen. <li> Skjær skrå muskler til å eksponere bukhulen.
- Finne og identifisere den venstre livmor horn (Fig. 2D).
- Bruk steril hemostat, klemme både fremre og bakre sider av horn (Fig. 2E). Plasser fremre klemme rett under egglederen og bakre klemmen rett over livmorhalsen.
- Har den andre personen injisere cellesuspensjonen. Plassere nålen inneholdende celler, ved 45 ° vinkel vinkelrett på hornet (fig. 2F). Meget langsomt injisere 50 pl av cellesuspensjonen inn i lumen av det uterine horn.
- Fjern nålen og slipp fremre klemmen.
- Slipp posterior klemmen og erstatte livmor horn i bukhulen.
- Lukk peritoneum ved hjelp av en syntetisk absorberbare sutur og lukke huden ved hjelp av en vev lim.
- Fjern musen fra nesepartiet og plassere tilbake i buret. Om nødvendig, endre beddings å sikre en Clean bur etter operasjonen. Sørg for at alle dyr er våken og aktiv før avreise uten tilsyn.
- Gi Ibuprofen på 0,11 mg / ml drikkevann for første 48 timer etter operasjonen. Etterpå erstatte med vanlig drikkevann.
- Merk: at hvis atymiske nakne mus anvendes, og huden blir lukket ved hjelp av klebemiddel vev i stedet for suturer, er det ikke nødvendig å separere mus etter kirurgi. SCID-mus er mer aggressive og kan ha som skal separeres.
- Følge nøye incisjonsstedet for mulig smitte på grunn av åpent sår.
3. Påvisning av Early Stage Intra-peritoneal Ovarian Cancer av Live In Vivo Imaging
Bestemme tilstedeværelsen av intra-peritoneal ip sykdom av levende in vivo imaging. En Multimodal Animal Rotation System (MARS) brukes i denne protokollen.
- Åpne MARS fange programvare fra i MI-programvaren. Denne modulen girsamordnet kontroll av MARS fange innstillingene mens utnytte bilde systemets fangst og analysekapasitet. Optimalisere individuelle opptaksinnstillinger for hver modalitet ved hjelp av en enkelt-view imaging før utvikle rotasjonen protokollen i trinn 3.4.
- Input forhåndsbestemt fangst verdier. For fluorescens fangst, bruker 10 sek eksponering, 2 x 2 binning, f-stopp 2.8, FOV 120 mm, ex: 550 nm, em: 600 nm filter fangst setting. For X-ray fangst, bruk en 10 sek eksponering, 2 x 2 binning, f-stopp 2.8, FOV 120 mm, 35 kVp, 0,4 mm Al filter fangst setting.
- Lagre parametrene i trinn 3.2 som individuelle session-filer.
- Lag en bevegelsessekvensen protokollen ved å velge Create / Edit Protokoller knappen fra systemgrensesnittet erverve vinduet.
- Velg tidligere lagret fluorescens session fil og lagre som Step One. Deretter velger du tilsvarende X-ray session fil og lagre som trinn to.
- Med Step One valgt, bruker du Set RotasjonSerien fra før Image Capture lokalmenyen for å stille inn ønsket startvinkel, rekkevidde, og tilvekst for å sikre sømløs visualisering av funksjoner. De spesifikke verdier inkluderer en startvinkel på -180 grader, en rekkevidde på 375 grader, og en trinnstørrelse på 15 grader.
- Lagre protokollen, og klikk på Ferdig-knappen for å initialisere MARS og kartlegge stepper motorposisjoner som svarer til hver av trinn vinkelen.
- Utføre den endelige kalibrering som beskrevet nedenfor for å justere den ventrale, rygg- og sidebilder for den bestemte dyret plassert i dyret støtte med bestemte grader av rotasjon for å bli brukt av programvareprotokoll.
- Bedøve mus ved anvendelse av en blanding av luft og medisinsk 2% isofluran ved en strømningshastighet på 2 l / min.
- Starte justeringen ved å velge knappen Forhåndsvisning fra i Acquire-menyen for å få opp kategorien Rotator. Bruk det reflekterende lys modalitet snarere enn multiwavelength eller X-ray modaliteter for å fremskynde prosessen.
- Velg Load Mouse alternativet og gå gjennom serien av posisjonerings menyer.
- Sørg for at tubed slutten av den sammen nosecone er i nosecone fordypningen og plasser musen i liggende retning med hodet i nosecone.
- Begynn kalibrering ved 0 grader posisjon med ventral side av dyret vendt ned. Bruk de to knottene på rotasjonssystem for å plassere dyret slik at det ser ut til sentrert i forhåndsvisningsvinduet.
- Gjenta prosessen som blir bedt for -180, - 90, 90, og 180 graders stillinger og klikker på Ferdig.
- Utfør den tidligere lagrede protokollen ved å klikke på Execute Protocol knappen fra hoved erverve vinduet. Under gjennomføringen av protokollen, observere et statusvindu som gir sanntid statusoppdateringer for gjeldende Capture, Exposure Varighet og generelle Protocol trinn.
- Sett sammen enkeltbilder i en film format ved hjelp avRotasjon programvare. Bruk Skjermkontroller for å justere lysstyrke / kontrast, åpenhet, og for å velge displayfarge for fluorescens signal.
- Eksportere den endelige sekvens av bilder i * .AVI fil format for presentasjon.
4. Administrasjon av 1. og 2. runde Kjemoterapi
- Etter ip svulst deteksjon av MARS, bestemme innledende tumorbyrde region av interesse (ROI) ved hjelp av standard to-dimensjonale posisjonering. Dette utføres på en gjennomsiktig dyr skuffen montert i bildedanningssystemet som beskrevet nedenfor i avsnitt 5. Når initial ROI er bestemt, 4 administrere doser på 12 mg / kg ip Paclitaxel hver tredje dag. Paclitaxel oppnås fra Hospira Inc. i en ferdig-til-å gå formulering med Chremaphor som kjøretøyet. Vi har tidligere demonstrert at denne behandlingsregime har sterk antitumoraktivitet mot xenograft modell sammenlignet med vehikkel-kontroll og induserer fullstendig utrydding av detekterbar tumor byrden 20. Men på grunn av sykdommens art, ip svulster gjentas et par dager etter behandlingen avsluttes 20.
- Overvåke respons på behandling av tenkelig hver 3. dag ved hjelp av standard to-dimensjonale posisjonering.
- Etter den fjerde dose av paclitaxel, klassifisere de musene som å ha fullstendig respons (ROI mindre enn 2000), delvis respons (opp til 35% reduksjon fra det innledende ROI oppnådd fra trinn 4.1, stabil sykdom (opp til 50% økning fra den opprinnelige ROI ), progresjon eller behandling med (mer enn 50% økning fra initial ROI) basert på det fluorescerende signalet observert.
- For mus med komplett respons, overvåke tilbakefall av tenkelig hver 3. dag. Når tilbakefall er observert (ROI = førstegang ROI i trinn 4.1), re-starte den andre runden av paclitaxel som beskrevet i 4.1.
- Hos mus med delvis sykdom, stabil sykdom, eller de som kommet med behandling, re-starte andre runde av Paclitaxel tre dager etter 4. doseav Paclitaxel. Tilsvarende bilde disse hver tredje dag.
5. Overvåking behandlingsrespons Bruke Standard To-dimensjonal Positioning
- Bedøve musene som skal avbildes ved hjelp av en blanding av luft og medisinsk 2% isofluran ved en strømningshastighet på 2 l / min.
- Plasser hodet av de bedøvede mus i enkelte nosecones i den gjennomsiktige dyr skuffen innen avbildningskammeret (Fig. 3).
- Inngangs de forutbestemte parametre stråling for fluorescens (10 sek eksponering, 2 x 2 binning, f-stopp 2,8, FOV 120 mm, ex: 550 nm, em: 600 nm) og X-ray (20 sek eksponering, 2 x 2 binning, f-stopp 2.8, FOV 120 mm, 35 kVp, 0,4 mm Al-filter).
- Klikk Expose å fange begge bildene i rekkefølge.
- Åpne bildene i Bruker MI programvare for visuell inspeksjon og regionen av interesse analyse.
6. bildeoverlegg og analyse
For å gi et gyldig sammenligning for both visuell og kvantitativ analyse av tidsforløpet bildesekvens prosessen alle forgrunns- og bakgrunnsbilder på lignende måte.
- Åpne både forgrunnsbildet (dvs. fluorescens) og bakgrunnen bildebehandling i programvaren og velg flis funksjon fra Window-menyen øverst (Fig. 4A).
- Å behandle forgrunnsbildet; åpne kategorien bildeskjermen på den øverste linjen (Fig. 4A, rød pil) og sette min / max verdier til 260 og 5000, henholdsvis (Fig. 4A, blå pil)
Merk: Bildevisningsområde forskjellig fra studie til studie avhengig av fluorescens signal intensiteter fanget i bilder. Bilder bør stå i motsetning til en min / max som vil vise tumormasser, ennå ikke vise bakgrunnen fra autofluorescens av dyret. - Neste åpen Auto-ROIs Tab fra navigasjonspanelet til venstre (fig. 4B, rød pil) og velg New ROI Set fra menyen (fig. 4C, red enrrow). Justere innstillingene for å bruke Threshold algoritmen på 630 gråtoner nivåer og velg bort Begrense størrelsen Max for å sikre alle potensielle ROI-er innspilt (Fig. 4C).
Merk: Terskelinnstillinger kan variere fra studie til studie avhengig av fluorescens signal intensiteter fanget i bilder. Bilder terskel å kvantifisere signal fra tumormasser ennå ikke måle signalet fra bakgrunnen fra autofluorescens av dyret. - Fra i bildeskjermen Window velge Mask funksjon. Nå er det bare i området som tilsvarer pikslene som har verdier lik eller overstiger terskelverdien på 630 gråtoner nivåene vil bli vist.
- Hvis du vil vise de kvantitative resultatene velg fanen Analysis fra den øverste menylinjen og velg fanen displayet (fig. 4D, røde piler).
- Fra displaymenyen velger du serienummeret, Sum, Mean, og området i boksene, og klikk deretter på OK.
- Lagre bildet slik at verdiene kan være exportert sammen når alle fluorescens bilder blir behandlet.
- Deretter markere X-ray bilde og åpne bildeskjermen igjen fra menylinjen øverst. Sette verdiene for min, max og gamma for å gi best visuell representasjon av musen skjelettet.
Legg merke til: Siden ingen kvantifisering utføres på de røntgenbilder hvert enkelt røntgenbilde fra tidssekvens kan behandles (dvs. min, maks og gamma-verdier) for å frembringe den flott representasjon av den datasettet. - Igjen med X-ray bilde uthevet velge Overlay boksen og velg den tilsvarende fluorescens bildefilen navn fra rullegardinmenyen (fig. 4E).
- Hvis du vil trekke den overlappet utgang, velg fanen Merknader fra navigasjonsmenyen (Fig. 4B, blå pil) til venstre. Velg riktige kategoriene for å legge til noen ekstra data eller tekst og til slutt legge intensiteten skala bar slik at fluorescens intensitet data kan raskt fastslått fra imalder.
- Når merknadene er fullført høydepunkt alle objektene på merknader side og velg kopi fra Edit-menyen øverst og lim overlappende bildedata til den aktuelle filen (for eksempel Word, PowerPoint, og / eller Photoshop) for visning.
- Gjenta trinn 6.1 6,11 for alle par av fluorescens og røntgenbilder i sekvensen. Sørg for å trygge alle bildene før du lukker dem.
- For endelig kvantifisering åpne alle fluorescens bilder samtidig, og velg Flis fra Vindu-menyen øverst.
- Neste velg Export alle åpne dokumenter for å vise dataene.
Merk: I fravær av Excel-programmet, fjerner du markeringen i kategorien. MI vil generere en tabulatordelt tekst (dvs. .txt) som kan overføres til en egnet datamaskin for videre analyse.
Representative Results
Non-invasiv levende avbildning tillater overvåking av ip tumorprogresjon fra samme musene gjennom tiden. Intra-uterin injeksjon av mCherry-merkede F2 eggstokkkreftceller ved hjelp av den beskrevne protokoll genererer ip synlige tumorer ved dag 5, og karsinomatose ved dag 32 (fig. 5). Figur 6 viser korrelasjonen av de oppnådde bilder med karsinomatose observert etter å ofre musene .
Avbildning ved hjelp MARS tillater påvisning av ip svulster som ellers vil bli savnet dersom bildet er ervervet fra bare ett enkelt plan. Figur 7 (toppanelet) viser at selv i Kontrollmus med betydelig tumorbyrde, kan tumorstørrelse undervurderes avhengig av vinkelen bildet ble tatt fra. Evnen til å sikre at tumormasse ikke blir gått glipp eller undervurdert er enda viktigere ved avslutningen av 1 m runde kjemoterapi når dyrene er kategorisert som enten en fullstendig reagereeh, delvis responder, eller non-responder (Fig. 7 midtre panelet). Tilsvarende ved vedlikeholdsbehandling er det av største betydning å oppdage svært små tilbakevendende svulster å riktig utpeke dager med gjentakelse som definerer progresjonsfri intervall (Fig. 7 midtre panelet).
Kvantitativ vurdering av tumorbyrde er optimalisert gjennom dyre rotasjon. Rotasjon av dyret til vinkler som vil minimere dybden eksitasjon og emisjon lyset går igjennom, vil muliggjøre en mest mulig nøyaktig fangst av fotonene fra den fluorescens, noe som er en indikasjon på mengden av tumorceller og dermed tumorbyrde. Derfor er optimalisert for kvantifisering spesifikke tumorer i dyr, avhengig av sin posisjon i bevegelsessekvensen.
I å presentere bilder av rotasjons datasett, er det viktig å tildele bildene en min / max image kontrastomfang som effektivt vil vise alle tumormasser, samtidig som for visu al avgrensning av individuelle tumormasser. For denne studien, var ideell kontrastomfang funnet å være minimum 50 teller, og en max på 1200 teller. Disse verdiene kan sees som en rettesnor for andre studier, vil imidlertid optimal kontrast skytebaner varierer fra studie til studie avhengig av tumorbelastning nivå, fluorescerende peptid uttrykk nivåer i cellene, bildebehandling systemkonfigurasjon, og fangstinnstillinger.
Figur 1: F2 eggstokkreft celler stabilt uttrykker mCherry fluorescens. (A) Fase bilde; (B) fluorescens bilde; (C) overlegget av A og B. Merk at 100% av cellene uttrykker fluorescensen reporter.
s.jpg "width =" 600 "/>
Figur 2: Intra-livmor injeksjon av eggstokkreft celler. (A) anestesi blir kontinuerlig administrert via en nesekonus; (BE) hud er radert å finne og klemme livmor horn; (F) kreftceller injiseres langsomt inn i lumen av livmoren.
Figur 3: (A) 2D-avbildning med en temperaturstyrt og i nærheten krets ventilert gjennomsiktig dyr skuffen inne i avbildningskammeret; (B, C) brettet er utstyrt med nese kjegler for å levere anestesi og kan holde opp til fem mus.
<strong> Figur 4: Representant vinduspaneler tatt fra analyseprogramvare for å bistå i dataanalyse. Vennligst se tekst for forklaring.
Figur 5: Påvisning av mCherry fluorescens samlokalisert med X-ray i lengdebildesekvens. Tre mus med ip svulst blir fulgt gjennom tiden for å vurdere ip tumorprogresjon. Legg merke til at tumorprogresjon kan variere. Figuren er et representativt bilde av tre mus med ulike satser for tumorprogresjon og derfor varierende tumorbelastning over tid.
Figur 6: Sammenheng mellom ip tumorbelastning (øverste panel) og fluorescens / X-ray overlegg image (nedre panel). Ca 32 dager etter injeksjon av F2-mCherry ovarian kreftceller, 2D-avbildning er utført og mus ofret for å korrelere selve tumorbyrde med den kjøpte bildet. Røde pilene peker på tumorbelastning.
Figur 7: Rotasjon datasett slik at multi-vinkel bildebehandling og påvisning av svulster i Control (øverste panel), Paclitaxel behandlet (midtre panelet), og tilbakevendende mus (nedre panel). Figuren viser bildet av en enkelt mus pr panel som det blir rotert ved hjelp av MARS systemet. Legg merke til at selv i Kontrollmus med betydelig tumorbyrde, kan tumorstørrelse undervurderes avhengig av vinkelen bildet ble tatt fra.
Discussion
Vi beskriver en protokoll for å etablere en ip menneskelig eggstokkreft dyremodell som etterligner den kliniske profilen observert hos pasienter. I tillegg, beskriver vi bruken av et dyr rotasjonsanordning som løser følsomheten begrensning av 2D-avbildning. Til sammen kan disse teknikkene fungere som plattformer for å oppdage nye forbindelser som kan målrette kjemoresistent vendende eggstokkreft. I tillegg kan en slik modell brukes til å forstå den biologiske tilbakefall av kreft og progresjon.
På grunn av sin retroperitoneal beliggenhet, tidlig stadium ip eggstokkreft xenografts er nesten umulig å oppdage ved fysisk å undersøke musen. I de fleste tilfeller, når sykdommen kan palperes, er tumorbyrde allerede betydelig, og derfor begrenser evaluering av behandlingseffekten. Bruken av fluorescerende merkede celler gjør det mulig for oss å bedømme etablering av tumor ip i sann tid, og følgelig å identifisere det optimale tidspunkt for å begynne treatment. På lignende måte, fluorescensmerkede xenotransplantater tillate overvåking av behandlingsrespons. Det skal påpekes imidlertid at ut-ip tumorer dypere enn 1 cm er vanligvis ikke påvisbar uavhengig av reportersystem.
Bruken av menneskelige eggstokkreft stamceller 14,15,17,22 genererer xenografts som etterligner den kliniske profilen observert hos pasienter. Som en primær sykdom, er modellen lydhør overfor Paclitaxel men avsluttet behandling til slutt fører til kjemoresistent tilbakevendende sykdom. Vi presenterer cellene gjennom livmor horn på tettheten angitt i protokollen delen resulterer vanligvis i ovarietumorer innen 10 dager med noen få peritoneal implantater, og derfor etterligner tidlig stadium sykdom. Bruken av fluorescerende merkede celler tillater oss å vurdere etablering av tumor ip i sanntid og følgelig identifiserer den optimale tid for å begynne behandlingen. På lignende måte, fluorescensmerkede xenotransplantater tillate overvåkning of respons på behandling. Hvis andre typer kreft-cellelinjer blir anvendt, ovarial eller på annen måte, er det mulig at denne profil ikke kan observeres. Når SKOV3 brukes for eksempel, har det blitt rapportert at de innledende ip tumorer allerede er motstandsdyktig 23. Likevel, hvis merket med en rapportør slik som fluorescens, ip, sykdommen kan bli fulgt i sanntid.
Dersom annet fluorescerende reporter anvendes, er det viktig å utføre innledende avbildning med en kontroll (ingen tumor) dyr. Dette vil tillate optimalisering av bilde protokollen for å oppnå best mulig bakgrunn for å signalisere forholdet. I vår erfaring, nakne mus vanligvis har høy bakgrunn når avbildes ved hjelp av GFP oppkjøps innstillinger.
Det er viktig at cellene injisert intra-uterin er i enkelt suspensjon for å unngå etablering av tumorer i livmor. Det er også viktig å unngå riper i livmor epitellaget, noe som også letter innpoding av kreftcellens i livmoren og dermed produsere en intra-uterin tumor i stedet for en ip sykdom. I tillegg, under analyse av data, er det viktig å angi at gamma-verdien til 1. Dette sikrer at intensiteten av bildene er lineær og tillater sammenligning mellom bildene.
Under oppkjøpet av Mars-bilder, er det viktig å sikre at tubed slutten av den sammen nosecone er i nosecone fordypningen. Den nosecone fungerer som et kontaktpunkt for mus og er derfor nødvendig for å få nøyaktig kalibrert vinkler. For lengre bildebehandling protokoller (dvs. lenger enn 1 time), injisere 100 mL sterilt saltvann subkutant for å hindre dehydrering. Animalsk kroppstemperatur skal opprettholdes ved hjelp av varm luft strømmet gjennom systemet ved omtrent 37 ° C. En begrensning av den MARS system er at kun ett dyr kan avbildes på en gang med en total kjøretid på ca. 1 time pr dyr.
Avslutningsvis beskriver vi establishment av en dyremodell som etterligner eggstokkreft, både primær og tilbakevendende sykdom. Denne modellen kan brukes til å evaluere effekten av nye diagnostiske eller terapeutiske modaliteter.
Disclosures
Publiserings avgifter for denne artikkelen ble delvis sponset av Bruker Corporation.
Acknowledgments
Denne studien ble støttet av NIH tilskudd RO1CA118678 og RO1CA127913, ved Sands Family Foundation, og Discovery å kurere Program.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| RPMI 1640 media | GIBCO, by Life Technologies | 23400-021 | |
| fetal bovine serum | Gemini Bioproducts | 100-106 | |
| T75 cell culture flasks | Corning | 430641 | |
| PBS | Life Technologies | 10010-023 | |
| Trypsin | GIBCO, by Life Technologies | 25300-054 | |
| Isoflurane | Butler Schein | NDC 11695-6776-1 | |
| Alcohol pads | Fischer Scientific | 06-669-62 | |
| 1 ml syringe | Becton Dickinson | 309602 | |
| 25 gauge needle | Becton Dickinson | 305122 | |
| synthetic absorbable suture | Covidien | SL-636 | |
| tissue adhesive | Vetbond | 1469SB | |
| surgical scissors | VWR | 82027-584 | |
| surgical forceps | VWR | 82027-386 | |
| hemostat | VWR | 82027-422 | |
| Paclitaxel | Hospira, Inc. | NDC 61703-345-50 | |
| Ibuprofen | Walgreens | Children's Ibuprofen 100 (100 mg/5 ml) | |
| Puralube Vet ointment | Pharmaderm | ||
| In vivo MS FX PRO | Bruker Corporation | ||
| MI software | Bruker Corporation | ||
| athymic nude mice | Harlan |
References
- Cho, K. R. Ovarian cancer update: lessons from morphology, molecules, and mice. Archives of pathology & laboratory medicine. 133, 1775-1781 (2009).
- Jong, M., Maina, T. Of mice and humans: are they the same?--Implications in cancer translational research. Journal of nuclear medicine : official publication, Society of Nuclear Medicine. 51, 501-504 (2010).
- Langdon, S. P. Animal modeling of cancer pathology and studying tumor response to therapy. Current drug targets. 13, 1535-1547 (2012).
- Mullany, L. K., Richards, J. S. Minireview: animal models and mechanisms of ovarian cancer development. Endocrinology. 153, 1585-1592 (2012).
- Ricci, F., Broggini, M., Damia, G. Revisiting ovarian cancer preclinical models: implications for a better management of the disease. Cancer treatment reviews. 39, 561-568 (2013).
- Pizzonia, J., et al. Multimodality animal rotation imaging system (Mars) for in vivo detection of intraperitoneal tumors. Am J Reprod Immunol. 67, 84-90 (2012).
- House, C. D., Hernandez, L., Annunziata, C. M. Recent Technological Advances in Using Mouse Models to Study Ovarian Cancer. Frontiers in oncology. 4, 26 (2014).
- Rao, J., Dragulescu-Andrasi, A., Yao, H. Fluorescence imaging in vivo: recent advances. Current opinion in biotechnology. 18, 17-25 (2007).
- Manegold-Brauer, G., Bellin, A. K., Tercanli, S., Lapaire, O., Heinzelmann-Schwarz, V. The special role of ultrasound for screening, staging and surveillance of malignant ovarian tumors: distinction from other methods of diagnostic imaging. Archives of gynecology and obstetrics. 289, 491-498 (2014).
- Zinn, K. R., et al. Noninvasive bioluminescence imaging in small animals. ILAR journal / National Research Council, Institute of Laboratory Animal Resources. 49, 103-115 (2008).
- Rockall, A. G., et al. Repeatability of Quantitative FDG-PET/CT and Contrast-Enhanced CT in Recurrent Ovarian Carcinoma: Test-Retest Measurements for Tumor FDG Uptake, Diameter, and Volume. Clin Cancer Res. 20, 2751-2760 (2014).
- Hickson, J. In vivo optical imaging: preclinical applications and considerations. Urologic oncology. 27, 295-297 (2009).
- Contag, C. H., Bachmann, M. H. Advances in in vivo bioluminescence imaging of gene expression. Annual review of biomedical engineering. 4, 235-260 (2002).
- Alvero, A. B., et al. Molecular phenotyping of human ovarian cancer stem cells unravels the mechanisms for repair and chemoresistance. Cell Cycle. 8, 158-166 (2009).
- Alvero, A. B., et al. Stem-like ovarian cancer cells can serve as tumor vascular progenitors. Stem Cells. 27, 2405-2413 (2009).
- Alvero, A. B., et al. NV-128, a novel isoflavone derivative, induces caspase-independent cell death through the Akt/mammalian target of rapamycin pathway. Cancer. , (2009).
- Chefetz, I., et al. TLR2 enhances ovarian cancer stem cell self-renewal and promotes tumor repair and recurrence. Cell Cycle. 12, 511-521 (2013).
- Liu, M., et al. High frequency of putative ovarian cancer stem cells with CD44/CK19 coexpression is associated with decreased progression-free intervals in patients with recurrent epithelial ovarian cancer. Reprod Sci. 20, 605-615 (2013).
- Steffensen, K. D., et al. Prevalence of epithelial ovarian cancer stem cells correlates with recurrence in early-stage ovarian cancer. J Oncol. 2011, 620523 (2011).
- Craveiro, V., Yang-Hartwich, Y., Holmberg, J., Sumi, N., Pizzonia, J., Griffin, B., Gill, S., Silasi, D., Azodi, M., Rutherford, T., Alvero, A. B., Mor, G. Phenotypic Modifications in Ovarian Cancer Stem Cells Following Paclitaxel Treatment. Cancer Medicine. , (2013).
- Kuroda, H., Marino, M. P., Kutner, R. H., Reiser, J., et al. Production of lentiviral vectors in protein-free media. Current protocols in cell biology / editorial board, Juan S. Bonifacino..[etal.]. 26, (2011).
- Yin, G., et al. Constitutive proteasomal degradation of TWIST-1 in epithelial-ovarian cancer stem cells impacts differentiation and metastatic potential. Oncogene. 32, 39-49 (2013).
- Vassileva, V., Allen, C. J., Piquette-Miller, M. Effects of sustained and intermittent paclitaxel therapy on tumor repopulation in ovarian cancer. Mol Cancer Ther. 7, 630-637 (2008).
