Abstract
Epitelovariecancer er den mest dødelige gynækologisk malignitet i USA. Selvom patienterne initialt reagere på den nuværende standard for pleje, der består af kirurgisk debulking og kombinationskemoterapi bestående af platin og taxanforbindelser, næsten 90% af patienterne igen inden for et par år. Hos disse patienter begrænser udviklingen af kemoresistent sygdom Effekten af for tiden tilgængelige kemoterapeutiske stoffer og derfor bidrager til den høje dødelighed. At opdage nye behandlingsmuligheder, der kan målrette tilbagevendende sygdom, er egnede dyremodeller, der nøje efterligner den kliniske profil af patienter med recidiverende ovariecancer påkrævet. Udfordringen i overvågningen intra-peritoneal (ip) sygdom begrænser brugen af ip modeller og således de fleste xenotransplantater er etableret subkutant. Vi har udviklet en følsom optisk billeddannelse platform, der muliggør påvisning og anatomiske placering af ip tumormasse. Platformen omfatter use af optiske reportere, der strækker sig fra det synlige lys til nær infrarødt, som i kombination med 2-dimensional X-ray co-registrering kan give anatomiske placering af molekylære signaler. Detection forbedres væsentligt ved anvendelse af et rotationssystem, der driver dyret til flere vinkelstillinger for 360 graders billeddannelse, som muliggør identifikation af tumorer, der ikke er synlige i en enkelt orientering. Denne platform giver en unik model til ikke-invasivt monitor tumorvækst og evaluere effekten af nye terapier til forebyggelse eller behandling af æggestokkræft.
Introduction
Dyremodeller er uundværlige værktøjer i life science forskning. I kræft især data indhentet fra dyreforsøg give de nødvendige oplysninger, der kræves for at indlede afprøvning af nye diagnostiske eller terapeutiske anvendelser i mennesker 1-3. Dyremodeller for solide kræftformer er klassisk etableret subkutant, da det giver en nem måde at måle tumorbyrde og evaluere behandlingseffekt uden at ofre dyr. Faktisk intraperitoneal (IP) modeller kræver, at dyr aflives for at detektere og måle eventuelle ændringer i tumorvækst. Men for ip kræftformer sådan ovariecancer, orthotrope modeller har den fordel at studere sygdommen i dens rette omgivelser 4-6. For at en sådan model være af i evalueringen af anti-tumor aktivitet, der skal udvikles, der tillader kvantificering af ip tumorbyrde i levende mus ikke-invasive billeddannende metoder.
En stor udfordring ianvendelse af ip dyremodeller er vanskeligheden ved nøjagtigt at kvantificere tumorbyrde ved fysisk undersøgelse. Nøjagtig kvantificering af ip tumorer kræver normalt musene at blive ofret for dissektion. Denne fremgangsmåde kræver anvendelse af store antal dyr, som vil blive aflivet på forskellige tidspunkter. Ud over omkostninger, det indfører høj variabilitet data på grund af iboende variationer inden for hvert dyr. Non-invasiv in vivo optisk billedbehandling giver en mere passende fremgangsmåde til at overvåge ip tumor byrde i levende mus.
Adskillige non-invasive imaging metoder der i øjeblikket anvendes i præ-klinisk forskning for overvågning af tumorvækst og terapeutiske respons. Heriblandt computertomografi (CT), ultralyd (US), magnetisk resonans (MRI), positron emission tomografi (PET), og optisk billeddannelse, såsom fluorescens og bioluminescens 7-12. CT er en transmission imaging proces, der kombinerer X-ray og comare teknologi. Den producerer et tværsnit billede af detekterede stråler af høj energi fotoner, der passerer gennem kroppen med forskellig hastighed. USA er en form for refleksion billede, som sender højfrekvente lyde til kroppen skaber lydbølger, der afspejles med forskellig hastighed afhængig af væv tæthed og genkendes af computeren til at frembringe et visuelt billede. MRI og PET er emission billeddannende modaliteter, der anvender magnetisk energi og kernepartikler, henholdsvis at frembringe billedet. MRI skaber et stærkt magnetfelt, der inducerer celler til at producere deres egne radiofrekvenser, som bruges til at skabe et billede, mens PET kræver en følsom kamera til at opdage radioaktivitet administrerede mærket 2-fluorodeoxy-D-glucose 7,9,11. Endelig er optisk billeddannelse baseret på påvisning af emissionen af lys bioluminescerende eller fluorescerende reportere eller prober 9,12.
I denne rapport beskriver vi brugen af fluorescens, som tilbydernogle fordele i forhold til andre typer af billeddannende modaliteter. Med fluorescensimagografi kan celler gensplejses til at udtrykke fluorescerende proteiner konstant uden at kræve tilsætning af et substrat eller ligerings--baserede prober, som er nødvendige for bioluminescens og magnetisk resonans, henholdsvis. Fluorescens reportere også typisk udtrykke en lysere signal således tillader anvendelse af et mindre følsomt påvisningsmetode 8,12. Desuden med fluorescensimagografi, er det muligt at detektere tumorer mindre end 1 cm, hvilket ikke kan opnås med CT 7-9. Endelig, i modsætning til bioluminescens, fluorescenssignal kræver ikke et aerobt miljø og dermed signalet er ikke begrænset i hypoxiske miljøer, som normalt forekommer i kernerne af store tumorer 13.
Men som enhver anden teknologi, fluorescerende-baserede billeddannende metoder har sine ulemper. Hvoraf den ene er den manglende evne til machine-genereret lavenergi fotoner at trænge igennem til en tilstrækkelig dybde. Således, at minimere mængden af diffust væv fotoner dyrene skal afbildes i forskellige vinkler. Vi beskriver en protokol for at etablere en ip æggestokkræft i nøgne mus og en tilgang til IP Tumorovervågningssystem der giver hele dyret billeddannelse gennem rotation. Rotator vinkler musen til specifikke og reproducerbare positioner faldende vævet interferens, der ofte forekommer mellem lyskilden og detektoren. Dette optimerer visualiseringen af mindre tumorer, som ellers kan blive savnet.
Protocol
Yale University Institutional Animal Care og brug Udvalg godkender alle in vivo arbejde beskrevet. Prøvetagning blev udført med patientens samtykke og godkendt af Human Undersøgelser Udvalg for Yale University School of Medicine.
1. Fremstilling af human ovariecancerceller
- Før udarbejdelse af cellerne sørge for alle materialer, der er nødvendige for intrauterin injektion beskrevet nedenfor er klar og let tilgængelig. Injicer cellesuspensionen, så snart den er klar.
- Grow fluorescerende mærkede cancerceller i kultur. Vi bruger en F2-generation af humant CD44 + / MyD88 + epiteliale ovariecancerceller, som vi tidligere har vist, at havnen stemness egenskaber såsom tumorigenicitet, kemoresistens og høj kapacitet til tumor reparation 14-19. Disse celler blev genereret til stabilt udtrykker mCherry fluorescens (F2-mCherry, fig. 1) med lentivirus fremstillet af polyethylenimin(PEI) protokol 20,21.
- På dagen for injektion, høste cellerne ved trypsinbehandling og vaskes en gang med phosphatbufret saltvand (PBS).
- Bestem celletælling og suspendere cellerne ved 3 x 10 6 celler / 50 pi i passende vækstmedier. For ovariecancerceller vi bruger RPMI 160 med 10% FBS. Opbevar cellerne i inkubatoren indtil den er klar til at injicere, men ikke holder længere end 15 min. Det er nok for en mus injektion.
2. Intra-uterine injektion af humant ovariecancerceller i athymiske nøgne mus
Bemærk, at den følgende procedure kræver assistance fra en anden person. Hertil kommer, at da dette er overlevelse kirurgi, skal du bruge sterile kirurgiske instrumenter. Denne overlevelse kirurgi procedure bør tage omkring 10 til 15 min.
- Bedøver musen ved at bruge 2% isofluran. 7- til 8-uger gamle athymiske nøgne mus anvendes typisk.
- Kontroller, at dyret er completely bedøves ved at klemme foden pad hjælp fingre eller pincet. Dyret bør være fuldstændig ikke-responderende til smerte før start af kirurgi.
- Placer den bedøvede mus ventrale side op på en steril gaze med hovedet væk fra investigator.
- Påfør salve på øjne med en bomuld-tip applikator til at forebygge tørhed, mens under anæstesi.
- Indsæt straks hovedet i en næse kegle system tilsluttet en isofluran fordamper (fig. 2A). Det giver anæstesi hele den kirurgiske procedure.
- Desinficere venstre (eller højre) side af maven ved hjælp af alkoholservietter (fig. 2B) efterfulgt af iod derefter placere en steril kirurgisk afdækningsstykke over operationsstedet.
- Brug sterile kirurgiske saks og pincet lave en 1-2 cm hudincision på den nederste venstre kvadrant af musen (fig. 2C).
- Løft muskel og foretage en incision for at nå bughinden. <li> Skær skrå muskel at eksponere bughulen.
- Lokalisere og identificere venstre uterine horn (fig. 2D).
- Anvendelse af sterilt hæmostat, klemme både anteriore og posteriore sider af hornet (fig. 2E). Anbring den forreste klemme lige under æggelederen og den bageste klemme lige over livmoderhalsen.
- Få den anden person injicere den celle suspension. Placer nålen holdige celler ved 45 ° vinkelret på horn (fig. 2F). Meget langsomt injiceres 50 pi cellesuspension ind i hulrummet af den uterine horn.
- Fjern nålen og slip den forreste klemme.
- Slip bageste klemme og erstatte børhornet i bughulen.
- Luk peritoneum under anvendelse af en syntetisk absorberbar sutur og lukke huden ved hjælp af et væv klæbemiddel.
- Fjern musen fra næsekeglen og placere tilbage i buret. Hvis det er nødvendigt, skal du ændre strøelse for at sikre en clean bur efter operationen. Sørg for, at alle dyr er vågen og aktiv, før de forlader uden opsyn.
- Give Ibuprofen på 0,11 mg / ml af drikkevand i de første 48 timer efter operationen. Bagefter erstatte med regelmæssig drikkevand.
- Bemærk: at hvis der anvendes athymiske nøgne mus, og huden lukkes med vævsklæber i stedet for suturer, er det ikke nødvendigt at adskille mus efter kirurgi. SCID-mus er mere aggressive og muligvis skal separeres.
- Nøje overvåge stedet for indsnit for eventuel infektion på grund af åbne sår.
3. Påvisning af Early Stage Intra-peritoneal Kræft i æggestokkene af Live In Vivo Imaging
Bestemme tilstedeværelsen af intra-peritoneal ip sygdom i levende in vivo billeddannelse. Et multimodalt Animal Rotation (MARS) anvendes i denne protokol.
- Gå til MARS capture software inde fra MI-softwaren. Dette modul giverkoordineret kontrol af MARS fange indstillinger, mens udnytte imaging systemets opsamling og analyse kapaciteter. Optimer individuelle capture indstillinger for hver modalitet hjælp af en enkelt-view billeddannelse inden udvikle rotation protokollen i trin 3.4.
- Input forudbestemt capture værdier. For fluorescens capture, skal du bruge 10 sek eksponering, 2 x 2 binning, f-stop 2.8 FOV 120 mm, ex: 550 nm, em: 600 nm filter capture indstilling. For X-ray capture, skal du bruge en 10 sek eksponering, 2 x 2 binning, f-stop 2.8 FOV 120 mm, 35 kVp, 0,4 mm Al filter capture indstilling.
- Gem parametrene i trin 3.2 som individuelle session filer.
- Opret en rotation sekvens protokol ved at vælge Opret Edit Protokoller knap / fra systeminteraktionen erhverve vindue.
- Vælg den tidligere gemte fluorescens session-fil og gem som Step One. Dernæst skal du vælge den tilsvarende X-ray-session-fil og gem som Step Two.
- Med Step One valgt, skal du bruge Set RotationSerie fra Før Billedoverførsel pop-up menu til at indstille den ønskede start vinkel, rækkevidde og tilvækst at sikre problemfri visualisering af funktioner. De specifikke værdier omfatter en start vinkel på -180 grader, en vifte af 375 grader, og en stigning på 15 grader.
- Gemme protokollen, og klik på knappen Udført for at initialisere MARS og kortlægge stepmotor positioner svarende til hver af stigninger vinklen.
- Udføre den endelige kalibrering som beskrevet nedenfor for at tilpasse den ventrale, dorsale og laterale visninger for det specifikke dyr anbragt i dyret støtte med specifikke grader af rotation, der skal anvendes af softwaren protokollen.
- Bedøve mus under anvendelse af en blanding af medicinsk luft og 2% isofluran ved en strømningshastighed på 2 l / min.
- Start tilpasningen ved at vælge knappen Eksempel indefra Acquire i menuen for at hente fanen Rotator. Anvende reflekterende lys modalitet snarere end multibølgelængdedetektor eller X-ray modaliteter til at fremskynde processen.
- Vælg Load Mouse indstillingen og fortsætte gennem rækken af positionering menuer.
- Sørg for, at tubed ende af den sammenklappelige Næsekeglen er i næsekeglens fordybning og placere musen i tilbøjelige orientering med hovedet i næsekeglens.
- Begynder kalibreringen ved 0 graders position med den ventrale side af dyret nedad. Brug de to drejeknapper på turnusordningen at placere dyret, så det vises centreret i Preview vinduet.
- Gentag processen, som bliver bedt om -180, - 90, +90 og +180 graders positioner, og klik på Udført.
- Udfør den tidligere gemte protokol ved at klikke på protokollen knappen Execute fra de vigtigste erhverve vinduet. Under udførelse af protokollen, observere en status vindue leverer realtid statusopdateringer for den aktuelle Capture, Exposure varighed, og den samlede protokol skridt.
- Saml enkelte billeder i en film format ved hjælp afRotation software. Brug skærmens Controls for at justere lysstyrke / kontrast, gennemsigtighed og for at indstille skærmen farve til fluorescens-signalet.
- Eksportere den afsluttende sekvens af billeder i * .AVI filformat til præsentationen.
4. Administration af 1. og 2. Runde Kemoterapi
- Følgende IP tumor detektion af MARS, bestemme den initiale tumorbyrde område af interesse (ROI) ved hjælp af standard to-dimensionel positionering. Dette udføres på en gennemsigtig dyr bakke monteret i imaging system som beskrevet nedenfor i afsnit 5. Når indledende ROI bestemmes, administrere 4 doser på 12 mg / kg paclitaxel ip hver tre dage. Paclitaxel opnås fra Hospira Inc. i en klar-til-go formulering med Cremaphor som køretøjet. Vi har tidligere påvist, at denne behandlingsregime har signifikant anti-tumor-aktivitet mod xenograft model i forhold til vehikelkontrol og inducerer fuldstændig udryddelse af påviseligt tumor byrde 20. Men på grund af arten af sygdommen, ip tumorer igen et par dage efter behandlingen ender 20.
- Monitorere respons på behandling ved at afbilde hver 3 dage ved hjælp af standard to-dimensional positionsbestemmelse.
- Efter den fjerde dosis paclitaxel, klassificere musene som havende komplet respons (ROI mindre end 2.000), partiel respons (op til 35% reduktion fra den oprindelige ROI opnået fra trin 4.1, stabil sygdom (op til 50% stigning fra den oprindelige ROI ) eller progression med behandling (mere end 50% stigning fra indledende ROI) baseret på fluorescerende signal observeret.
- For mus med komplet respons, overvåger gentagelse af imaging hver 3 dage. Når tilbagefald observeres (ROI = til indledende ROI i trin 4.1), re-indlede anden runde af Paclitaxel som beskrevet i 4.1.
- Hos mus med delvis sygdom, stabil sygdom, eller dem, der skred med behandling, re-indlede anden runde af Paclitaxel 3 dage efter 4 th dosisPaclitaxel. Tilsvarende billede disse hver tre dage.
5. Overvågning Reaktion på behandling med Standard Two-dimensional Positioning
- Bedøve musene, der skal afbildes under anvendelse af en blanding af medicinsk luft og 2% isofluran ved en strømningshastighed på 2 l / min.
- Placer lederen af bedøvede mus i de enkelte nosecones i den gennemsigtige dyr bakke inden afbildningskammeret (fig. 3).
- Input forudbestemte eksponering parametre for fluorescens (10 sek eksponering, 2 x 2 binning, f-stop 2.8 FOV 120 mm, ex: 550 nm, em 600 nm), og X-ray (20 sek eksponering, 2 x 2 binning, f-stop 2.8 FOV 120 mm, 35 kVp, 0,4 mm Al filter).
- Klik Expose at fange begge billeder i rækkefølge.
- Åbn billederne i Bruker MI software til visuel inspektion og region af interesse analyse.
6. Image Overlay og Analyse
At give en gyldig sammenligning for both visuel og kvantitativ analyse af tidsforløbet billedsekvens proces alle forgrund og baggrund billeder på samme måde.
- Åbn både forgrundsbilledet (dvs. fluorescens) og baggrunden imaging i softwaren og vælg flise funktion fra menuen Vindue i toppen (fig. 4A).
- Til at behandle billedet i forgrunden; åbne fanen displayet på den øverste bar (Fig. 4A, rød pil) og indstille min / max værdier på 260 og 5000, henholdsvis (Fig. 4A, blå pil)
Bemærk: Image Display interval varierer fra undersøgelse til undersøgelse afhængigt af fluorescens signalintensiteter fanget i billeder. Billeder skal sammenholdes med en min / max, der vil vise tumormasser, endnu ikke viser baggrund fra autofluorescens af dyret. - Næste åbne Auto-ROIs Tab fra navigationspanelet til venstre (fig. 4B, rød pil), og vælg den nye ROI Set fra menuen (fig. 4C, rød enRROW). Juster indstillingerne for at bruge Threshold algoritmen på 630 gråtoner niveauer og fravælge Begræns størrelse Max til at sikre alle potentielle ROI s er optaget (fig. 4C).
Bemærk: Threshold indstillinger kan variere fra undersøgelse til undersøgelse afhængigt af fluorescens signalintensiteter fanget i billeder. Billeder tærsklingsbehandles at kvantificere signalet fra tumormasser endnu ikke måle signalet fra baggrunden fra autofluorescens af dyret. - Fra i displayet Window vælge Mask funktionen. Nu er det kun det område, der svarer til de pixels, der har værdier svarer til eller overstiger tærskelværdien på 630 gråtoner niveauer vil blive vist.
- For at se de kvantitative resultater vælge fanen Analyse fra den øverste menubjælke og vælg fanen displayet (fig. 4D, røde pile).
- Fra menuen Display vælge Serienummer, Sum, betyder, og området afkrydsningsfelterne og klik derefter på OK.
- Gem billedet, så værdierne kan være exteret langs når alle fluorescensbilleder behandles.
- Dernæst fremhæve røntgenbilledet og igen åbne displayet fra den øverste menulinje. Indstille værdier for min, max og gamma at give den bedste visuelle repræsentation af skelettet musen.
Bemærk: Da ingen kvantificering udføres på de røntgenbilleder enkelte røntgenbillede fra det tidspunkt sekvens kan behandles (dvs. min, max og gamma værdier) til at producere den bedste leder repræsentation af det pågældende datasæt. - Igen med X-ray billede fremhævet vælge Overlay afkrydsningsfeltet og vælg den tilsvarende fluorescensbillede filnavnet fra drop down menu (fig. 4E).
- At udtrække overlejret output, skal du vælge fanen Annotations fra Navigation menuen (Fig. 4B, blå pil) til venstre. Vælg relevante faner for at tilføje yderligere data eller tekst og til sidst tilføje intensitet skala bar så fluorescensintensiteten data kan hurtigt bestemmes ud fra imalder.
- Når anmærkninger er afsluttet fremhæve alle objekter på anmærkninger siden, og vælg kopi fra menuen Rediger øverst og indsæt overlejret billeddata til den relevante fil (f.eks Word, PowerPoint og / eller Photoshop) til visning.
- Gentag trin 6.1- 6.11 for alle par af fluorescens og røntgenbilleder i sekvensen. Vær sikker på at sikre alle billederne, før du lukker dem.
- For endelig kvantificering åbne alle fluorescensbilleder på samme tid, og vælg Tile menuen Vindue langs toppen.
- Næste vælge Export Alle åbne dokumenter for at se dataene.
Bemærk: I fravær af Excel-programmet, skal du fravælge fanen. MI vil generere en tabulatorsepareret tekstfil (dvs. .txt), som kan overføres til en passende computer til yderligere analyse.
Representative Results
Non-invasiv billeddannelse muliggør overvågning af IP-tumor progression fra samme mus gennem tiden. Intrauterin injektion af mCherry-mærkede F2 ovariecancerceller anvender den beskrevne protokol genererer synlige ip tumorer på dag 5 og carcinomatose på dag 32 (fig. 5). Figur 6 viser korrelationen af de opnåede billeder med carcinomatose observeret efter ofre musene .
Imaging hjælp MARS muliggør påvisning af ip tumorer, som ellers vil blive savnet, hvis billedet er erhvervet fra kun en enkelt plan. Figur 7 (øverste panel) viser, at selv i kontrol mus med betydelig tumorbyrde, kan tumor størrelse undervurderes afhængig af vinklen billedet blev taget fra. Evnen til at sikre, at tumor masse ikke springes over eller undervurderes, er endnu vigtigere ved afslutningen af 1. runde kemoterapi, når dyrene er kategoriseret som enten en komplet reagereis, delvis reageret, eller ikke-responder (fig. 7 midterste panel). Ligeledes under vedligeholdelsesbehandling er det af yderste vigtighed at detektere meget små tilbagevendende tumorer til korrekt udpege dage til gentagelse, som definerer progressionsfri interval (fig. 7 midterste panel).
Kvantitativ vurdering af tumorbyrde er optimeret gennem dyr rotation. Rotation af dyret til vinkler, som minimerer dybde excitation og emission lys rejser gennem vil give mulighed for den mest nøjagtige indfangning af fotoner fra den fluorescens, som er indikativ for mængden af tumorceller og dermed tumorbyrde. Derfor er kvantificering optimeret til specifikke tumorer i dyr, afhængigt af dens position i rotation sekvens.
Præsentere billeder af rotation datasæt, er det vigtigt at tildele billederne en min / max billedets kontrast række, der effektivt vil vise alle tumormasser, samtidig med at visu al afgrænsning af individuelle tumorer. Til denne undersøgelse blev ideel kontrast rækkevidde sig at være mindst 50 tæller, og et max på 1.200 tællinger. Disse værdier kan ses som en rettesnor for andre studier, dog vil optimal kontrast intervaller afvige fra undersøgelse til undersøgelse afhængigt af tumorbyrde niveau, fluorescerende peptid ekspressionsniveauer i celler, imaging system konfiguration og indstillinger capture.
Figur 1: F2 ovariecancerceller stabilt udtrykker mCherry fluorescens. (A) Phase billede; (B) fluorescensbillede; (C) overlejring af A og B. Bemærk, at 100% af cellerne udtrykker fluorescens reporter.
s.jpg "width =" 600 "/>
Figur 2: Intra-uterine injektion af ovariecancerceller. (A) anæstesi administreres kontinuert via en næse kegle; (BE) hud indsnit til at lokalisere og klemme børhornet; (F) cancerceller injiceres langsomt ind i lumen af livmoderen.
Figur 3: (A) 2D med et temperaturreguleret og tæt kredsløb ventileret gennemsigtig dyr bakke inden afbildningskammeret; (B, C) bakken er forsynet med næse kegler at levere anæstesi og kan indeholde op til fem mus.
<strong> Figur 4: Repræsentant vinduespartier taget fra analysen software til at hjælpe med dataanalyse. Se tekst for forklaring.
Figur 5: Detektion af mCherry fluorescens co-lokaliseret med X-ray i langsgående billeddannelse sekvens. Tre mus med ip tumor følges gennem tid til at vurdere ip tumor progression. Bemærk, at tumorudvikling kan variere. Figuren er et repræsentativt billede af 3 mus med forskellige satser for tumor progression og dermed varierende tumor byrde gennem tiden.
Figur 6: Sammenhæng mellem IP tumorbyrde (øverste panel) og fluorescens / X-ray overlay imaGE (nederste panel). Omkring 32 dage efter injektion af F2-mCherry ovariecancer celler, 2D-billedbehandling udføres og mus aflivet at korrelere egentlig tumor byrde med den erhvervede billede. Røde pile peger på tumorbyrde.
Figur 7: Rotation datasæt tillader multi-vinkel billeddannelse og påvisning af tumorer i Kontrolpanel (øverste panel), Paclitaxel behandlet (midterste panel), og tilbagevendende mus (nederste panel). Figuren viser et billede af en enkelt mus per panel, når den roteres ved hjælp af Mars-systemet. Bemærk, at selv i kontrol mus med betydelig tumorbyrde, kan tumor størrelse undervurderes afhængig af vinklen billedet blev taget fra.
Discussion
Vi beskriver en protokol for at etablere en ip human ovariecancer dyremodel, der efterligner den kliniske profil observeret hos patienter. Endvidere beskriver vi anvendelse af et dyr rotationsindretning, der løser følsomhed begrænsning af 2D-billedbehandling. Tilsammen kan disse teknikker tjene som platforme for at opdage nye forbindelser, som kan målrette kemoterapi tilbagevendende ovariecancer. Desuden kan en sådan model kan bruges til at forstå biologi cancer tilbagefald og progression.
På grund af sin retroperitoneal placering, er næsten umulige at påvise ved fysisk at undersøge mus tidlige fase ip kræft i æggestokkene xenotransplantater. I de fleste tilfælde, når sygdommen kan palperes, tumorbyrden er allerede stor og begrænser derfor evaluering af behandlingseffekt. Anvendelse af fluorescensmærkede celler tillader os at vurdere fastsættelsen af ip tumor i realtid og dermed identificere det optimale tidspunkt til at begynde treatment. På en lignende måde, fluorescerende-mærkede xenotransplantaterne tillade overvågning af behandlingsrespons. Det skal bemærkes ud imidlertid, at ip tumorer dybere end 1 cm er typisk ikke påviselig uanset reporter system.
Anvendelse af menneskelige ovariecancerceller stamceller 14,15,17,22 genererer xenotransplantater, der efterligner den kliniske profil observeret hos patienter. Som en primær sygdom, modellen er lydhør over for paclitaxel, men behandlingsophør sidste ende fører til kemoresistent tilbagevendende sygdom. Introduktion af cellerne gennem livmoderhornene på tæthed nærmere specificeret i protokol afsnittet normalt resulterer i æggestokkræft inden for 10 dage med et par peritoneale implantater, og derfor efterligner den tidlige fase af sygdommen. Anvendelsen af fluorescens-mærkede celler giver os mulighed for at vurdere fastsættelsen af ip tumor i realtid og dermed identificere det optimale tidspunkt at begynde behandling. På lignende måde, fluorescensmærkede xenotransplantater muligt at overvåge of respons på behandlingen. Hvis der anvendes, ovarie- eller på anden måde andre typer af cancer cellelinjer, er det muligt, at denne profil ikke kan observeres. Når SKOV3 anvendes for eksempel er det blevet rapporteret, at de oprindelige ip tumorer er allerede resistente 23. Men hvis mærket med en reporter, såsom fluorescens, ip, sygdom kan følges i realtid.
Hvis der anvendes andre fluorescerende reporter, er det vigtigt at udføre indledende billeddannelse med en kontrol (ingen tumor) dyr. Dette vil give en optimal billeddannelse protokol for at opnå den bedste baggrund at signalere ratio. Det er vores erfaring, nøgne mus har typisk høj baggrund, når filmede med indstillingerne GFP erhvervelse.
Det er vigtigt, at celler injiceres intra-uterin er i enkelt suspension at undgå etableringen af tumorer i livmoderen. Det er også vigtigt at undgå at ridse den uterine epitel lag, som også letter indpodning af kræftcellens i livmoderen, hvorved der frembringes en intrauterin tumor i stedet for en IP sygdom. Desuden under dataanalyse, er det vigtigt at indstille gamma værdien 1. Dette sikrer, at intensiteten af billederne er lineær og muliggør en sammenligning mellem billeder.
Under erhvervelsen af MARS billeder, er det vigtigt at sikre, at tubed ende af den sammenklappelige Næsekeglen er i næsekeglens fordybning. Næsekeglen fungerer som et kontaktpunkt for musen, og er derfor påkrævet for at opnå præcist kalibrerede vinkler. Ved længere imaging protokoller (dvs. længere end 1 time), injiceres 100 pi sterilt saltvand subkutant for at forhindre dehydrering. Dyrekroppen temperatur bør holdes ved hjælp af varm luft strømme gennem systemet på ca. 37 ° C. En begrænsning af MARS system er, at kun et dyr kan afbildes på et tidspunkt med en total kørselstid på ca. 1 time pr dyr.
Afslutningsvis beskriver vi establishment af en dyremodel, der nøje efterligner ovariecancer, både primær og tilbagevendende sygdom. Denne model kan anvendes til at vurdere effektiviteten af nye diagnostiske eller terapeutiske modaliteter.
Disclosures
Frikøbte til denne artikel er delvis sponsoreret af Bruker Corporation.
Acknowledgments
Denne undersøgelse blev støttet af NIH tilskud RO1CA118678 og RO1CA127913 ved Sands Family Foundation, og Discovery at helbrede Program.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| RPMI 1640 media | GIBCO, by Life Technologies | 23400-021 | |
| fetal bovine serum | Gemini Bioproducts | 100-106 | |
| T75 cell culture flasks | Corning | 430641 | |
| PBS | Life Technologies | 10010-023 | |
| Trypsin | GIBCO, by Life Technologies | 25300-054 | |
| Isoflurane | Butler Schein | NDC 11695-6776-1 | |
| Alcohol pads | Fischer Scientific | 06-669-62 | |
| 1 ml syringe | Becton Dickinson | 309602 | |
| 25 gauge needle | Becton Dickinson | 305122 | |
| synthetic absorbable suture | Covidien | SL-636 | |
| tissue adhesive | Vetbond | 1469SB | |
| surgical scissors | VWR | 82027-584 | |
| surgical forceps | VWR | 82027-386 | |
| hemostat | VWR | 82027-422 | |
| Paclitaxel | Hospira, Inc. | NDC 61703-345-50 | |
| Ibuprofen | Walgreens | Children's Ibuprofen 100 (100 mg/5 ml) | |
| Puralube Vet ointment | Pharmaderm | ||
| In vivo MS FX PRO | Bruker Corporation | ||
| MI software | Bruker Corporation | ||
| athymic nude mice | Harlan |
References
- Cho, K. R. Ovarian cancer update: lessons from morphology, molecules, and mice. Archives of pathology & laboratory medicine. 133, 1775-1781 (2009).
- Jong, M., Maina, T. Of mice and humans: are they the same?--Implications in cancer translational research. Journal of nuclear medicine : official publication, Society of Nuclear Medicine. 51, 501-504 (2010).
- Langdon, S. P. Animal modeling of cancer pathology and studying tumor response to therapy. Current drug targets. 13, 1535-1547 (2012).
- Mullany, L. K., Richards, J. S. Minireview: animal models and mechanisms of ovarian cancer development. Endocrinology. 153, 1585-1592 (2012).
- Ricci, F., Broggini, M., Damia, G. Revisiting ovarian cancer preclinical models: implications for a better management of the disease. Cancer treatment reviews. 39, 561-568 (2013).
- Pizzonia, J., et al. Multimodality animal rotation imaging system (Mars) for in vivo detection of intraperitoneal tumors. Am J Reprod Immunol. 67, 84-90 (2012).
- House, C. D., Hernandez, L., Annunziata, C. M. Recent Technological Advances in Using Mouse Models to Study Ovarian Cancer. Frontiers in oncology. 4, 26 (2014).
- Rao, J., Dragulescu-Andrasi, A., Yao, H. Fluorescence imaging in vivo: recent advances. Current opinion in biotechnology. 18, 17-25 (2007).
- Manegold-Brauer, G., Bellin, A. K., Tercanli, S., Lapaire, O., Heinzelmann-Schwarz, V. The special role of ultrasound for screening, staging and surveillance of malignant ovarian tumors: distinction from other methods of diagnostic imaging. Archives of gynecology and obstetrics. 289, 491-498 (2014).
- Zinn, K. R., et al. Noninvasive bioluminescence imaging in small animals. ILAR journal / National Research Council, Institute of Laboratory Animal Resources. 49, 103-115 (2008).
- Rockall, A. G., et al. Repeatability of Quantitative FDG-PET/CT and Contrast-Enhanced CT in Recurrent Ovarian Carcinoma: Test-Retest Measurements for Tumor FDG Uptake, Diameter, and Volume. Clin Cancer Res. 20, 2751-2760 (2014).
- Hickson, J. In vivo optical imaging: preclinical applications and considerations. Urologic oncology. 27, 295-297 (2009).
- Contag, C. H., Bachmann, M. H. Advances in in vivo bioluminescence imaging of gene expression. Annual review of biomedical engineering. 4, 235-260 (2002).
- Alvero, A. B., et al. Molecular phenotyping of human ovarian cancer stem cells unravels the mechanisms for repair and chemoresistance. Cell Cycle. 8, 158-166 (2009).
- Alvero, A. B., et al. Stem-like ovarian cancer cells can serve as tumor vascular progenitors. Stem Cells. 27, 2405-2413 (2009).
- Alvero, A. B., et al. NV-128, a novel isoflavone derivative, induces caspase-independent cell death through the Akt/mammalian target of rapamycin pathway. Cancer. , (2009).
- Chefetz, I., et al. TLR2 enhances ovarian cancer stem cell self-renewal and promotes tumor repair and recurrence. Cell Cycle. 12, 511-521 (2013).
- Liu, M., et al. High frequency of putative ovarian cancer stem cells with CD44/CK19 coexpression is associated with decreased progression-free intervals in patients with recurrent epithelial ovarian cancer. Reprod Sci. 20, 605-615 (2013).
- Steffensen, K. D., et al. Prevalence of epithelial ovarian cancer stem cells correlates with recurrence in early-stage ovarian cancer. J Oncol. 2011, 620523 (2011).
- Craveiro, V., Yang-Hartwich, Y., Holmberg, J., Sumi, N., Pizzonia, J., Griffin, B., Gill, S., Silasi, D., Azodi, M., Rutherford, T., Alvero, A. B., Mor, G. Phenotypic Modifications in Ovarian Cancer Stem Cells Following Paclitaxel Treatment. Cancer Medicine. , (2013).
- Kuroda, H., Marino, M. P., Kutner, R. H., Reiser, J., et al. Production of lentiviral vectors in protein-free media. Current protocols in cell biology / editorial board, Juan S. Bonifacino..[etal.]. 26, (2011).
- Yin, G., et al. Constitutive proteasomal degradation of TWIST-1 in epithelial-ovarian cancer stem cells impacts differentiation and metastatic potential. Oncogene. 32, 39-49 (2013).
- Vassileva, V., Allen, C. J., Piquette-Miller, M. Effects of sustained and intermittent paclitaxel therapy on tumor repopulation in ovarian cancer. Mol Cancer Ther. 7, 630-637 (2008).
