Abstract
उपकला डिम्बग्रंथि के कैंसर संयुक्त राज्य अमेरिका में सबसे घातक gynecologic द्रोह है. रोगियों शुरू में शल्य debulking और प्लैटिनम और taxane यौगिकों से मिलकर संयोजन कीमोथेरपी से मिलकर देखभाल के मौजूदा मानक का जवाब हालांकि, रोगियों के लगभग 90% एक कुछ वर्षों के भीतर फिर से याद पड़ना. इन रोगियों में chemoresistant रोग का विकास वर्तमान में उपलब्ध कीमोथेरेपी एजेंटों की प्रभावकारिता को सीमित करता है और इसलिए उच्च मृत्यु दर में योगदान देता है. आवर्तक रोग लक्षित कर सकते हैं कि उपन्यास चिकित्सा विकल्पों की खोज करने के लिए, निकट बारम्बार डिम्बग्रंथि के कैंसर के रोगियों के नैदानिक प्रोफाइल की नकल है कि उचित पशु मॉडल के लिए आवश्यक हैं. इंट्रा-पेरिटोनियल (आईपी) रोग निगरानी में चुनौती आईपी मॉडल और इस तरह सबसे xenografts स्थापित कर रहे हैं subcutaneously के उपयोग की सीमा. हम पता लगाने और आईपी ट्यूमर जन की संरचनात्मक स्थान की अनुमति देता है कि एक संवेदनशील ऑप्टिकल इमेजिंग मंच विकसित किया है. मंच यू शामिल2-आयामी एक्स-रे सह पंजीकरण के साथ संयोजन में आणविक संकेतों के संरचनात्मक स्थान प्रदान कर सकते हैं जो निकट अवरक्त को दिखाई प्रकाश रेंज से विस्तार है कि ऑप्टिकल संवाददाताओं के एसई. जांच में काफी एकल अभिविन्यास में दिखाई नहीं हैं कि ट्यूमर की पहचान की अनुमति, 360 डिग्री इमेजिंग के लिए कई कोणीय पदों के लिए पशु ड्राइव कि एक रोटेशन प्रणाली के इस्तेमाल से सुधार हुआ है. यह मंच गैर invasively निगरानी ट्यूमर के विकास के लिए एक अनूठा मॉडल प्रदान करता है और रोकथाम या बारम्बार डिम्बग्रंथि के कैंसर के इलाज के लिए नए उपचारों की प्रभावकारिता का मूल्यांकन.
Introduction
पशु मॉडलों जीवन विज्ञान अनुसंधान में अनिवार्य उपकरण हैं. कैंसर में विशेष रूप से, जानवरों के अध्ययन से प्राप्त डेटा मनुष्यों 1-3 में उपन्यास निदान या चिकित्सीय अनुप्रयोगों का परीक्षण आरंभ करने के लिए आवश्यक आवश्यक जानकारी प्रदान करते हैं. यह जानवरों का बलिदान करने के लिए बिना उपचार प्रभावकारिता ट्यूमर बोझ को मापने और मूल्यांकन करने के लिए एक आसान साधन प्रदान करता है के रूप में ठोस कैंसर के लिए पशु मॉडल प्रतिष्ठित subcutaneously स्थापित कर रहे हैं. दरअसल, इंट्रा-पेरिटोनियल (आईपी) मॉडल जानवरों का पता लगाने और ट्यूमर के विकास में किसी भी बदलाव को मापने के लिए बलिदान किया है कि आवश्यकता होती है. हालांकि, आईपी कैंसर ऐसे डिम्बग्रंथि के कैंसर के लिए, orthotropic मॉडल इसके समुचित वातावरण 4-6 में रोग का अध्ययन का लाभ प्रदान करते हैं. इस तरह के एक मॉडल विरोधी ट्यूमर गतिविधि के मूल्यांकन में उपयोग की होने के लिए, गैर इनवेसिव इमेजिंग तरीकों लाइव चूहों में आईपी ट्यूमर बोझ की मात्रा का ठहराव की अनुमति है कि विकसित किए जाने की जरूरत है.
में एक बड़ी चुनौतीआईपी पशु मॉडल का उपयोग सही ढंग से शारीरिक परीक्षा से ट्यूमर बोझ बढ़ाता में कठिनाई है. आईपी ट्यूमर की सटीक मात्रा का ठहराव आमतौर पर विच्छेदन के लिए बलिदान करने के लिए चूहों की आवश्यकता होती है. यह दृष्टिकोण अलग समय बिंदुओं पर बलिदान किया जाएगा जो जानवरों की उच्च संख्या के उपयोग की आवश्यकता है. लागत के अलावा, यह कारण प्रत्येक जानवर के भीतर निहित विविधताओं को उच्च डेटा परिवर्तनशीलता परिचय. विवो ऑप्टिकल इमेजिंग में नॉन-इनवेसिव लाइव चूहों में आईपी ट्यूमर बोझ नजर रखने के लिए एक उपयुक्त तरीका प्रदान करता है.
कई गैर इनवेसिव इमेजिंग तरीकों वर्तमान में ट्यूमर के विकास और चिकित्सीय प्रतिक्रियाओं की निगरानी के लिए पूर्व नैदानिक अनुसंधान में उपयोग किया जाता है. ये ऐसे प्रतिदीप्ति और bioluminescence 7-12 के रूप में गणना टोमोग्राफी (सीटी), अल्ट्रासाउंड (अमेरिका), चुंबकीय अनुनाद इमेजिंग (एमआरआई), पोजीट्रान एमिशन टोमोग्राफी (पीईटी), और ऑप्टिकल इमेजिंग शामिल हैं. सीटी एक्स-रे और कंप्यूटर प्रणालियों के संयोजन एक संचरण इमेजिंग प्रक्रिया हैएर प्रौद्योगिकी. यह अलग गति के साथ शरीर के माध्यम से गुजरता है, जो उच्च ऊर्जा फोटॉन, का पता लगाया मुस्कराते हुए एक पार अनुभाग छवि पैदा करता है. अमेरिका उच्च आवृत्ति अलग गति ऊतक घनत्व पर निर्भर करता है और एक दृश्य छवि का निर्माण करने के लिए कंप्यूटर द्वारा मान्यता प्राप्त के साथ परिलक्षित होते हैं कि शरीर बनाने ध्वनि तरंगों को लगता है भेजता है जो प्रतिबिंब छवि, का एक प्रकार है. एमआरआई और पीईटी छवि का उत्पादन क्रमश: चुंबकीय ऊर्जा और परमाणु कणों का उपयोग करने वाले उत्सर्जन रूपरेखा इमेजिंग हैं. पीईटी administrated लेबल 2-fluorodeoxy-ग्लूकोज़ 7,9,11 की रेडियोधर्मिता का पता लगाने के लिए एक संवेदनशील कैमरे की आवश्यकता है, जबकि एमआरआई एक छवि बनाने के लिए उपयोग किया जाता है जो अपने खुद के रेडियो फ्रीक्वेंसी, निर्माण करने के लिए कोशिकाओं को प्रेरित करता है कि एक मजबूत चुंबकीय क्षेत्र पैदा करता है. अंत में, ऑप्टिकल इमेजिंग bioluminescent या फ्लोरोसेंट संवाददाताओं से या जांच 9,12 के उत्सर्जन प्रकाश का पता लगाने पर आधारित है.
इस रिपोर्ट में, हम जो प्रदान करता है, प्रतिदीप्ति के उपयोग का वर्णनइमेजिंग तौर तरीकों के अन्य प्रकार पर कुछ लाभ. प्रतिदीप्ति इमेजिंग के साथ, कोशिकाओं लगातार क्रमशः bioluminescence और चुंबकीय अनुनाद इमेजिंग, के लिए अपेक्षित हैं जो एक सब्सट्रेट या बंधाव आधारित जांच, के अलावा आवश्यकता के बिना फ्लोरोसेंट प्रोटीन व्यक्त करने के लिए आनुवंशिक रूप से इंजीनियर हो सकता है. प्रतिदीप्ति संवाददाताओं भी आम तौर पर इस प्रकार एक कम संवेदनशील पहचान पद्धति 8,12 के उपयोग की अनुमति एक उज्जवल संकेत व्यक्त करते हैं. इसके अलावा, प्रतिदीप्ति इमेजिंग के साथ, यह सीटी 7-9 से प्राप्त नहीं है जो 1 सेमी, की तुलना में छोटे ट्यूमर का पता लगाने के लिए संभव है. अंत में, bioluminescence के विपरीत, प्रतिदीप्ति संकेत एक एरोबिक वातावरण की आवश्यकता नहीं है और इसलिए संकेत आम तौर पर बड़े ट्यूमर 13 की कोर में होने वाली हैं जो hypoxic वातावरण में ही सीमित नहीं है.
हालांकि, किसी भी अन्य प्रौद्योगिकी के रूप में, फ्लोरोसेंट आधारित इमेजिंग तरीकों इसके नुकसान है. जिनमें से एक machi के की अक्षमता हैपूर्वोत्तर जनित कम ऊर्जा फोटॉनों एक पर्याप्त गहराई तक घुसना. इस प्रकार, जानवरों विभिन्न कोणों पर imaged किया जाना चाहिए विसरित ऊतक फोटॉनों की मात्रा को कम करने के लिए. हम नग्न चूहों में एक आईपी डिम्बग्रंथि के कैंसर और रोटेशन के माध्यम से पूरे पशु इमेजिंग प्रदान करता है कि आईपी ट्यूमर की निगरानी के लिए एक दृष्टिकोण की स्थापना के लिए एक प्रोटोकॉल का वर्णन. रोटेटर अक्सर प्रकाश स्रोत और डिटेक्टर के बीच होता है कि ऊतक हस्तक्षेप कम विशिष्ट और repeatable पदों के लिए माउस कोण. इस अन्यथा याद किया जा सकता है कि छोटे ट्यूमर के दृश्य का अनुकूलन.
Protocol
येल विश्वविद्यालय संस्थागत पशु की देखभाल और उपयोग समिति वर्णित सभी में विवो काम को मंजूरी. नमूना संग्रह रोगी सहमति के साथ प्रदर्शन किया और चिकित्सा के येल विश्वविद्यालय के स्कूल ऑफ ह्यूमन जांच समिति द्वारा अनुमोदित किया गया था.
मानव डिम्बग्रंथि कैंसर कोशिकाओं के 1. तैयारी
- तैयारी से पहले कोशिकाओं नीचे वर्णित भीतर गर्भाशय इंजेक्शन के लिए आवश्यक सभी सामग्री तैयार है और आसानी से उपलब्ध हैं सुनिश्चित करें. यह तैयार है जैसे ही सेल निलंबन इंजेक्षन.
- संस्कृति में फ्लोरोसेंट लेबल कैंसर कोशिकाओं को विकसित. हम पहले ऐसे tumorigenicity, chemoresistance और ट्यूमर की मरम्मत 14-19 के लिए उच्च क्षमता के रूप में stemness गुण बंदरगाह के लिए प्रदर्शन किया जो मानव CD44 + / MyD88 + उपकला डिम्बग्रंथि कैंसर कोशिकाओं के एक F2 पीढ़ी का उपयोग करें. इन कोशिकाओं को स्थिरतापूर्वक mCherry प्रतिदीप्ति व्यक्त करने के लिए उत्पन्न किया गया (F2-mCherry, अंजीर. 1) lentivirus polyethylenimine से उत्पादन का उपयोग(पी) प्रोटोकॉल 20,21.
- इंजेक्शन के दिन, trypsinization द्वारा कोशिकाओं फसल और फॉस्फेट बफर खारा (पीबीएस) के साथ एक बार धो लो.
- कोशिकाओं की संख्या का निर्धारण करते हैं और 3 x 10 6 कोशिकाओं / उचित विकास मीडिया में 50 μl में कोशिकाओं को निलंबित. डिम्बग्रंथि कैंसर कोशिकाओं के लिए हम 10% FBS के साथ RPMI 160 का उपयोग करें. इंजेक्षन करने के लिए तैयार है जब तक इनक्यूबेटर में कोशिकाओं रखें लेकिन अब से 15 मिनट नहीं रखते. यह एक माउस इंजेक्शन के लिए पर्याप्त है.
Athymic नग्न चूहों में मानव डिम्बग्रंथि कैंसर कोशिकाओं के 2. भीतर गर्भाशय इंजेक्शन
निम्नलिखित प्रक्रिया एक दूसरे व्यक्ति से सहायता की आवश्यकता है कि ध्यान दें. इस अस्तित्व सर्जरी के बाद से इसके अलावा, बाँझ शल्य चिकित्सा उपकरणों का उपयोग करें. यह अस्तित्व सर्जरी प्रक्रिया लगभग 10 से 15 मिनट लग चाहिए.
- 2 isoflurane% का उपयोग माउस anesthetize. 7- 8 सप्ताह पुरानी athymic नग्न चूहों आम तौर पर प्रयोग किया जाता है.
- पशु complet है कि सत्यापित करेंइली उंगलियों या संदंश का उपयोग पैर पैड pinching द्वारा anesthesized. पशु शल्य चिकित्सा शुरू करने से पहले दर्द को पूरी तरह से गैर जिम्मेदार होना चाहिए.
- दूर अन्वेषक से सिर के साथ एक बाँझ धुंध पैड पर anesthetized माउस उदर पक्ष ऊपर रखें.
- संज्ञाहरण के तहत जबकि सूखापन को रोकने के लिए एक कपास-टिप applicator के साथ आंखों पर मरहम लागू करें.
- तुरंत एक isoflurane vaporizer (चित्र. 2A) से जुड़े एक नाक शंकु प्रणाली में सिर डालने. इस शल्य चिकित्सा प्रक्रिया के दौरान संज्ञाहरण बचाता है.
- तो शल्य साइट पर एक बाँझ सर्जिकल कपड़ा जगह छोड़ दिया कीटाणुरहित (या सही) आयोडीन द्वारा पीछा पेट का उपयोग शराब पैड (छवि. 2 बी) की ओर.
- का प्रयोग बाँझ सर्जिकल कैंची और संदंश माउस (छवि. -2 सी) के निचले बाएँ वृत्त का चतुर्थ भाग पर एक 1-2 सेमी त्वचा चीरा बनाते हैं.
- पेशी लिफ्ट और पेरिटोनियम तक पहुंचने के क्रम में एक चीरा बनाने. <ली> उदर गुहा का पर्दाफाश करने के लिए परोक्ष पेशी काटना.
- जानें, और छोड़ दिया गर्भाशय सींग (छवि. 2 डी) की पहचान.
- बाँझ hemostat के प्रयोग, सींग (छवि. 2 ई) के दोनों पूर्वकाल और कूल्हों पक्षों दबाना. सही फैलोपियन ट्यूब नीचे पूर्वकाल दबाना और सही गर्भाशय ग्रीवा के ऊपर पीछे दबाना रखें.
- दूसरा व्यक्ति सेल निलंबन इंजेक्षन है. सींग (छवि. 2 एफ) को सीधा 45 डिग्री के कोण पर कोशिकाओं से युक्त सुई, रखें. बहुत धीरे गर्भाशय सींग का लुमेन में सेल निलंबन के 50 μl इंजेक्षन.
- सुई निकालें और पूर्वकाल दबाना जारी.
- पीछे दबाना छोड़ दें और उदर गुहा में गर्भाशय सींग जगह.
- एक सिंथेटिक absorbable सीवन का उपयोग पेरिटोनियम बंद करें और एक ऊतक चिपकने का उपयोग त्वचा को बंद करें.
- नाक शंकु से माउस निकालें और पिंजरे में वापस जगह है. यदि आवश्यक हो, एक clea सुनिश्चित करने के लिए बिस्तर बदलसर्जरी के बाद एन पिंजरे. सभी जानवरों नायाब जाने से पहले जाग और सक्रिय हैं सुनिश्चित करें.
- पहले 48 घंटे के बाद सर्जरी के लिए पीने के पानी की 0.11 मिलीग्राम / एमएल पर ब्रुफेन प्रदान करें. बाद में, नियमित रूप से पीने के पानी के साथ बदलें.
- नोट: athymic नग्न चूहों का इस्तेमाल किया जाता है और त्वचा के बजाय टांके के ऊतक चिपकने का उपयोग बंद कर दिया है, तो यह सर्जरी के बाद चूहों अलग करने के लिए आवश्यक नहीं है कि. SCID चूहों अधिक आक्रामक होते हैं और अलग होना पड़ सकता है.
- निकट होने के कारण खुले घाव के लिए संभव संक्रमण के लिए चीरा की साइट पर नजर.
लाइव vivo इमेजिंग द्वारा प्रारंभिक स्टेज इंट्रा-पेरिटोनियल डिम्बग्रंथि के कैंसर के 3. जांच
Vivo इमेजिंग में रहते द्वारा इंट्रा-पेरिटोनियल आईपी रोग की उपस्थिति निर्धारित करते हैं. एक बहुविध पशु रोटेशन प्रणाली (मंगल) इस प्रोटोकॉल में प्रयोग किया जाता है.
- एमआई सॉफ्टवेयर के भीतर से मार्स कब्जा सॉफ्टवेयर. इस मॉड्यूल प्रदान करता हैइमेजिंग प्रणाली का कब्जा और विश्लेषण क्षमताओं का लाभ, जबकि मंगल ग्रह के समन्वित नियंत्रण सेटिंग्स पर कब्जा. कदम 3.4 में रोटेशन प्रोटोकॉल विकसित करने के लिए पहले एक एकल दृश्य इमेजिंग का उपयोग कर प्रत्येक साधन के लिए व्यक्तिगत कब्जा सेटिंग्स का अनुकूलन.
- इनपुट पर कब्जा मूल्यों पूर्व निर्धारित. 550 एनएम, उन्हें: 600 एनएम फिल्टर कब्जा सेटिंग प्रतिदीप्ति कब्जा करने के लिए, 10 सेकंड जोखिम, 2 एक्स 2 binning उपयोग, 2.8, FOV 120 मिमी, पूर्व एफ बंद करो. एक्स-रे को पकड़ने के लिए, एक 10 सेकंड जोखिम का उपयोग, 2 एक्स 2 binning, 2.8, FOV 120 मिमी, 35 केवीपी, 0.4 मिमी अल फिल्टर कब्जा सेटिंग एफ बंद करो.
- व्यक्तिगत सत्र फ़ाइलों के रूप में 3.2 कदम में मापदंडों को बचाओ.
- सिस्टम इंटरफ़ेस अधिग्रहण खिड़की से बनाएँ / संपादित प्रोटोकॉल बटन का चयन करके एक रोटेशन अनुक्रम प्रोटोकॉल बनाएँ.
- पहले से बचाया प्रतिदीप्ति सत्र फ़ाइल का चयन करें और एक कदम के रूप में बचाने के लिए. इसके बाद, इसी एक्स-रे सत्र फ़ाइल का चयन और दो कदम के रूप में बचाने के लिए.
- एक कदम चयनित के साथ, सेट रोटेशन का उपयोगइससे पहले छवि कैद पॉप-अप मेनू से सीरीज सुविधाओं की सहज दृश्य के लिए सुनिश्चित करने के लिए वांछित शुरू कर कोण, सीमा, और वेतन वृद्धि तय है. विशिष्ट मूल्यों -180 डिग्री शुरू करने कोण, 375 डिग्री की एक सीमा है, और 15 डिग्री की एक वेतन वृद्धि भी शामिल है.
- प्रोटोकॉल सहेजें और मंगल को प्रारंभ और कोण वेतन वृद्धि में से प्रत्येक के लिए इसी stepper मोटर पदों नक्शा करने के लिए ठीक है बटन पर क्लिक करें.
- सॉफ्टवेयर प्रोटोकॉल द्वारा प्रयोग की जाने वाली रोटेशन के विशिष्ट डिग्री के साथ पशु समर्थन में तैनात विशिष्ट पशु के लिए उदर, पृष्ठीय और पार्श्व विचारों संरेखित करने के लिए नीचे वर्णित के रूप में अंतिम अंशांकन प्रदर्शन.
- 2 एल / मिनट की एक प्रवाह दर पर चिकित्सा हवा और 2% isoflurane के एक मिश्रण का उपयोग माउस anesthetize.
- अंग को घुमानेवाली पेशी टैब को लाने के लिए मोल मेनू के भीतर से पूर्वावलोकन बटन का चयन करके संरेखण शुरू करो. Multiwavelength या एक्स-आरए बजाय चिंतनशील प्रकाश साधन का प्रयोग करेंY तौर तरीकों प्रक्रिया को तेज करने के लिए.
- लोड माउस विकल्प का चयन करें और स्थिति मेनू की श्रृंखला के माध्यम से आगे बढ़ना.
- बंधनेवाला nosecone के tubed अंत nosecone अवकाश में है कि यह सुनिश्चित करें और nosecone में अपने सिर के साथ होने का खतरा अभिविन्यास में माउस जगह है.
- नीचे का सामना करना पड़ पशु के उदर पक्ष के साथ 0 डिग्री स्थिति पर अंशांकन शुरू करो. यह पूर्वावलोकन विंडो में केंद्रित प्रतीत होता है कि इतने जानवरों की स्थिति के लिए रोटेशन प्रणाली पर दो knobs का प्रयोग करें.
- 90, 90, और 180 डिग्री पदों और क्लिक करें - -180 के लिए संकेत के रूप में, इस प्रक्रिया को दोहराएं.
- मुख्य अधिग्रहण खिड़की से प्रोटोकॉल बटन निष्पादित क्लिक करके पहले से बचाया प्रोटोकॉल निष्पादित. प्रोटोकॉल के निष्पादन के दौरान, वर्तमान कब्जा, एक्सपोजर अवधि, और समग्र प्रोटोकॉल कदम के लिए वास्तविक समय स्थिति अद्यतन प्रदान स्थिति विंडो निरीक्षण करते हैं.
- का उपयोग करते हुए एक फिल्म प्रारूप में अलग-अलग छवियों को इकट्ठारोटेशन सॉफ्टवेयर. चमक / विपरीत, पारदर्शिता समायोजित करने के लिए, और प्रतिदीप्ति संकेत के लिए प्रदर्शन रंग सेट करने के लिए प्रदर्शन नियंत्रणों का उपयोग करें.
- प्रस्तुति के लिए * .AVI फ़ाइल प्रारूप में छवियों के अंतिम दृश्य में निर्यात करें.
1 सेंट और 2 एन डी दौर कीमोथेरेपी के 4. प्रशासन
- मंगल द्वारा आईपी ट्यूमर का पता लगाने के बाद, मानक दो आयामी स्थिति का उपयोग ब्याज (आरओआई) की प्रारंभिक ट्यूमर बोझ क्षेत्र निर्धारित करते हैं. इस प्रारंभिक रॉय निर्धारित किया जाता है एक बार, 12 मिलीग्राम / किग्रा पैक्लिटैक्सेल आईपी के 4 खुराक हर तीन दिन प्रशासन की धारा 5 में नीचे वर्णित के रूप में इमेजिंग सिस्टम में फिट एक पारदर्शी पशु ट्रे पर किया जाता है. Paclitaxel वाहन के रूप में cremaphor साथ एक तैयार-जाने के लिए तैयार करने में Hospira इंक से प्राप्त किया जाता है. हम पहले इस इलाज के आहार वाहन नियंत्रण की तुलना में xenograft मॉडल के खिलाफ महत्वपूर्ण विरोधी ट्यूमर गतिविधि है कि प्रदर्शन किया और पता लगाने योग्य टी के पूर्ण उन्मूलन लातीumor बोझ 20. उपचार 20 समाप्त होने के बाद हालांकि, की वजह बीमारी की प्रकृति के कारण, आईपी ट्यूमर कुछ दिनों पुनरावृत्ति होना.
- मानक दो आयामी स्थिति का उपयोग हर 3 दिन इमेजिंग द्वारा उपचार के लिए प्रतिक्रिया की निगरानी.
- Paclitaxel की चौथी खुराक के बाद, (प्रारंभिक रॉय से 50% वृद्धि करने के लिए ऊपर पूर्ण प्रतिक्रिया (आरओआई कम से कम 2,000), आंशिक प्रतिक्रिया (कदम 4.1, स्थिर रोग से प्राप्त प्रारंभिक रॉय से अप करने के लिए 35% कमी होने के रूप में चूहों को वर्गीकृत ), या मनाया फ्लोरोसेंट संकेत के आधार पर उपचार (प्रारंभिक रॉय से अधिक से अधिक 50% की वृद्धि) के साथ प्रगति.
- पूर्ण प्रतिक्रिया के साथ चूहों के लिए, हर 3 दिन इमेजिंग द्वारा पुनरावृत्ति की निगरानी. पुनरावृत्ति (कदम 4.1 में रॉय प्रारंभिक रॉय =) मनाया जाता है एक बार, 4.1 में वर्णित के रूप में पैक्लिटैक्सेल के दूसरे दौर पुनः आरंभ.
- आंशिक रोग, स्थिर रोग, या उपचार के साथ आगे बढ़े कि उन लोगों के साथ चूहों में, 3 दिन 4 वें खुराक के बाद पैक्लिटैक्सेल के दूसरे दौर पुनः आरंभPaclitaxel की. इसी तरह, छवि इन हर तीन दिन.
स्टैंडर्ड दो आयामी स्थिति निर्धारण का उपयोग उपचार के लिए 5. निगरानी रिस्पांस
- चूहों चतनाशून्य 2 एल / मिनट की एक प्रवाह दर पर चिकित्सा हवा और 2% isoflurane के एक मिश्रण का उपयोग imaged किया जाना है.
- इमेजिंग कक्ष (छवि. 3) के भीतर पारदर्शी पशु ट्रे में व्यक्तिगत nosecones में से anesthetized चूहों के सिर रखें.
- इनपुट प्रतिदीप्ति के लिए पूर्व निर्धारित जोखिम मानकों (10 सेकंड जोखिम, 2 एक्स 2 binning, FOV 120 मिमी, पूर्व 2.8 एफ बंद करो:, उन्हें 550 एनएम: 600 एनएम), 2 एक्स 2 binning और एक्स-रे (20 सेकंड प्रदर्शन, 2.8, FOV 120 मिमी, 35 केवीपी, 0.4 मिमी अल फिल्टर) एफ बंद करो.
- इस क्रम में दोनों छवियों पर कब्जा करने बेनकाब क्लिक करें.
- दृश्य निरीक्षण और ब्याज विश्लेषण के क्षेत्र के लिए Bruker एमआई सॉफ्टवेयर में छवियों को खोलें.
6. छवि ओवरले और विश्लेषण
बो के लिए एक वैध तुलना प्रदान करने के लिएसभी अग्रभूमि और पृष्ठभूमि छवियों इसी प्रकार समय पाठ्यक्रम छवि अनुक्रम प्रक्रिया वें दृश्य और मात्रात्मक विश्लेषण.
- सॉफ्टवेयर में अग्रभूमि छवि (यानी प्रतिदीप्ति) और पृष्ठभूमि इमेजिंग दोनों खुला और ऊपर (छवि. -4 ए) पर विंडो मेनू से टाइल समारोह का चयन करें.
- अग्रभूमि छवि पर कार्रवाई करने के लिए; शीर्ष बार (चित्र. -4 ए, लाल तीर) पर छवि दिखाना टैब खुला और क्रमश: 260 और 5000, को न्यूनतम / अधिकतम मूल्य निर्धारित (छवि. -4 ए, नीले तीर)
नोट: छवि दिखाना रेंज छवियों में कब्जा प्रतिदीप्ति संकेत तीव्रता के आधार पर अध्ययन करने के लिए अध्ययन से अलग है. छवियाँ ट्यूमर जनता को दिखाने के, अभी तक पशु की autofluorescence से पृष्ठभूमि नहीं दिखाया जाएगा कि एक न्यूनतम / अधिकतम के साथ विषम जाना चाहिए. - बाएँ पर नेविगेशन पैनल (छवि. 4B, लाल तीर) से अगले खुला ऑटो ROIs के टैब और मेनू से नई रॉय सेट का चयन (छवि. 4C, लाल एकrrow). 630 स्केल स्तरों पर थ्रेसहोल्ड कलन विधि का उपयोग करने के लिए सेटिंग्स समायोजित करें और के दर्ज हैं सभी संभावित रॉय (छवि. 4C) सुनिश्चित करने के लिए आकार अधिकतम प्रतिबंधित अचयनित.
नोट: थ्रेसहोल्ड सेटिंग्स छवियों में कब्जा प्रतिदीप्ति संकेत तीव्रता के आधार पर अध्ययन करने के लिए अध्ययन से भिन्न हो सकती है. छवियाँ अभी तक ट्यूमर जनता से संकेत quantitate पशु की autofluorescence से पृष्ठभूमि से संकेत उपाय नहीं करने के लिए thresholded. - छवि डिस्प्ले विंडो के भीतर से नकाब समारोह का चयन करें. अब के बराबर मान या 630 स्केल के स्तर की दहलीज मूल्य से अधिक है कि पिक्सल के लिए इसी ही क्षेत्र प्रदर्शित किया जाएगा.
- मात्रात्मक परिणाम शीर्ष मेनू पट्टी का चयन करें और प्रदर्शन टैब (छवि. 4D, लाल तीर) से विश्लेषण टैब का चयन देखने के लिए.
- प्रदर्शन मेनू से सीरियल नंबर, राशि, मीन, और क्षेत्र के चेक बॉक्स का चयन करें और फिर ठीक क्लिक करें.
- मूल्यों पूर्व हो सकते हैं तो छवि सहेजेंसाथ में रखी एक बार सभी प्रतिदीप्ति छवियों कार्रवाई कर रहे हैं.
- अगला, एक्स-रे छवि पर प्रकाश डाला और फिर शीर्ष मेनू पट्टी से छवि दिखाना खुला. माउस कंकाल का सबसे अच्छा दृश्य प्रतिनिधित्व देने के लिए न्यूनतम, अधिकतम और गामा के लिए मूल्यों को निर्धारित करें.
नोट: कोई quantitation के समय अनुक्रम से प्रत्येक व्यक्ति के एक्स-रे छवि कार्रवाई की जा सकती एक्स-रे चित्र पर किया जाता है के बाद से (यानी न्यूनतम, अधिकतम और गामा मान) कि डेटा सेट का सबसे अच्छा लग प्रतिनिधित्व निर्माण करने के लिए. - फिर एक्स-रे छवि के साथ ओवरले चेक बॉक्स का चयन करें और मेनू (छवि. 4E) ड्रॉप डाउन से इसी प्रतिदीप्ति छवि फ़ाइल नाम का चयन पर प्रकाश डाला.
- Overlayed उत्पादन निकालने के लिए, बाईं ओर नेविगेशन मेनू (छवि. 4B, नीले तीर) से टिप्पणियां टैब का चयन करें. प्रतिदीप्ति तीव्रता डेटा जल्दी आईएम से निर्धारित किया जा सकता है इसलिए किसी भी अतिरिक्त डेटा या पाठ जोड़ सकते हैं और अंत में तीव्रता पैमाने पर पट्टी जोड़ने के लिए उपयुक्त टैब का चयन करेंउम्र.
- एनोटेशन उजागर प्रदर्शन के लिए सभी टिप्पणियां पेज पर वस्तुओं और शीर्ष पर संपादित करें मेनू से चुनें कॉपी और उचित फ़ाइल में overlayed छवि डेटा पेस्ट (जैसे वर्ड, PowerPoint, और / या फ़ोटोशॉप) पूरा कर रहे हैं एक बार.
- दोहराएँ कदम 6.1- अनुक्रम में प्रतिदीप्ति और एक्स-रे चित्र के सभी जोड़ों के लिए 6.11. उन्हें बंद करने से पहले सुरक्षित सभी छवियों के लिए सुनिश्चित करें.
- अंतिम quantitation के लिए एक ही समय में सभी प्रतिदीप्ति छवियों को खोलने और शीर्ष के साथ विंडो मेनू से टाइल का चयन करें.
- अगला डेटा देखने के लिए निर्यात सभी खुले दस्तावेज़ों का चयन करें.
नोट: एक्सेल कार्यक्रम के अभाव में, टैब अचयनित. एमआई एक टैब सीमांकित पाठ आगे के विश्लेषण के लिए एक उपयुक्त कंप्यूटर को हस्तांतरित किया जा सकता है (यानी .txt) फ़ाइल उत्पन्न होगा.
Representative Results
गैर-आक्रामक रहते इमेजिंग समय के माध्यम से ही चूहों से आईपी ट्यूमर प्रगति की निगरानी की अनुमति देता है. वर्णित प्रोटोकॉल का उपयोग mCherry लेबल F2 डिम्बग्रंथि कैंसर कोशिकाओं के भीतर गर्भाशय इंजेक्शन दिन 32 दिन 5 और कार्सिनोमामयता पर दिखाई आईपी ट्यूमर को उत्पन्न करता है (छवि. 5). आंकड़ा 6 चूहों त्याग के बाद मनाया कार्सिनोमामयता के साथ प्राप्त चित्रों के संबंध को दर्शाता है .
मार्स का उपयोग इमेजिंग छवि केवल एक ही विमान से अधिग्रहण कर लिया है अगर नहीं तो याद किया जाएगा कि आईपी ट्यूमर का पता लगाने के लिए अनुमति देता है. 7 (शीर्ष पैनल) चित्रा कोण के आधार पर भी महत्वपूर्ण ट्यूमर बोझ के साथ नियंत्रण चूहों में ट्यूमर के आकार को कम करके आंका जा सकता है कि पता चलता है छवि से लिया गया था. जानवरों या तो एक पूरा जवाब के रूप में वर्गीकृत किया जाता है जब ट्यूमर जन चूक या कम करके आंका नहीं है कि यह सुनिश्चित करने की क्षमता 1 सेंट दौर कीमोथेरेपी के समापन पर और भी अधिक महत्वपूर्ण हैएर, आंशिक प्रत्युत्तर, या गैर प्रत्युत्तर (छवि. 7 मध्यम पैनल). इसी तरह, रखरखाव उपचार के दौरान यह ठीक से प्रगति से मुक्त अंतराल (छवि. 7 मध्यम पैनल) को परिभाषित करता है जो, पुनरावृत्ति दिनों को नामित करने के लिए बहुत छोटे आवर्तक ट्यूमर का पता लगाने के लिए अत्यंत महत्वपूर्ण है.
ट्यूमर बोझ के मात्रात्मक आकलन पशु रोटेशन के माध्यम से अनुकूलित है. गहराई उत्तेजना कम करने और उत्सर्जन प्रकाश ट्यूमर कोशिकाओं की मात्रा और इस प्रकार ट्यूमर बोझ का संकेत है जो प्रतिदीप्ति, से फोटॉनों की सबसे सटीक कब्जा करने के लिए अनुमति देगा माध्यम से यात्रा करेंगे कि कोण करने के लिए पशु की रोटेशन. इसलिए, quantitation के रोटेशन अनुक्रम में अपनी स्थिति के आधार पर पशु में विशिष्ट ट्यूमर के लिए अनुकूलित है.
रोटेशन डेटा सेट की छवियों को पेश करने में, यह विसू के लिए अनुमति देता है, जबकि प्रभावी रूप से सभी ट्यूमर जनता को प्रदर्शित करेगा कि एक न्यूनतम / अधिकतम छवि के विपरीत रेंज छवियों आवंटित करने के लिए महत्वपूर्ण है व्यक्तिगत ट्यूमर जनता के अल चित्रण. इस अध्ययन के लिए, आदर्श विपरीत सीमा 50 मामलों की एक न्यूनतम और 1,200 मामलों की एक अधिकतम हो पाया था. ये मान अन्य अध्ययन के लिए एक दिशानिर्देश के रूप में देखा जा सकता है, तथापि, इष्टतम विपरीत पर्वतमाला ट्यूमर बोझ स्तर, कोशिकाओं में फ्लोरोसेंट पेप्टाइड अभिव्यक्ति के स्तर, इमेजिंग सिस्टम विन्यास, और कब्जा सेटिंग्स के आधार पर अध्ययन करने के लिए अध्ययन से अलग होगा.
चित्रा 1: F2 डिम्बग्रंथि कैंसर कोशिकाओं स्थिरतापूर्वक mCherry प्रतिदीप्ति व्यक्त करते हैं. (ए) चरण छवि; (बी) प्रतिदीप्ति छवि; ए और बी (सी) ओवरले कोशिकाओं की 100% प्रतिदीप्ति रिपोर्टर व्यक्त ध्यान दें.
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चित्रा 2: डिम्बग्रंथि कैंसर कोशिकाओं के भीतर गर्भाशय इंजेक्शन. (ए) संज्ञाहरण लगातार एक नाक शंकु के माध्यम से प्रशासित किया जाता है; त्वचा लगाने और गर्भाशय सींग दबाना छिन्न है (इ); (एफ) कैंसर की कोशिकाओं को गर्भाशय के लुमेन में धीरे धीरे इंजेक्ट कर रहे हैं.
चित्रा 3: एक तापमान नियंत्रित और करीब सर्किट इमेजिंग कक्ष के भीतर पारदर्शी पशु ट्रे हवादार साथ (ए) 2 डी इमेजिंग; (बी, सी) ट्रे संज्ञाहरण देने के लिए और पांच चूहों को पकड़ कर सकते नाक शंकु के साथ फिट है.
<मजबूत> चित्रा 4: विश्लेषण सॉफ्टवेयर से लिया प्रतिनिधि खिड़की पैनलों डेटा विश्लेषण में सहायता करते हैं. विवरण के लिए पाठ देखें.
चित्रा 5: mCherry प्रतिदीप्ति की जांच अनुदैर्ध्य इमेजिंग अनुक्रम में एक्स-रे के साथ सह-स्थानीयकृत. आईपी ट्यूमर के साथ तीन चूहों आईपी ट्यूमर प्रगति का आकलन करने के लिए समय के माध्यम से पालन कर रहे हैं. ट्यूमर प्रगति भिन्न हो सकते हैं कि ध्यान दें. चित्रा अलग ट्यूमर प्रगति की दर और इसलिए समय के माध्यम से ट्यूमर बोझ बदलती के साथ 3 चूहों के एक प्रतिनिधि छवि है.
चित्रा 6: आईपी ट्यूमर बोझ (शीर्ष पैनल) और प्रतिदीप्ति / एक्स-रे ओवरले आईएमए के बीच सहसंबंधजीई (नीचे पैनल). के बारे में 32 दिनों में 2 डी इमेजिंग प्रदर्शन किया और चूहों का अधिग्रहण छवि के साथ वास्तविक ट्यूमर बोझ सहसंबंधी बलिदान है, F2-mCherry डिम्बग्रंथि कैंसर कोशिकाओं के इंजेक्शन के बाद. लाल तीर ट्यूमर बोझ को इंगित.
चित्रा 7: बहु कोण इमेजिंग और ट्यूमर का पता लगाने के नियंत्रण (शीर्ष पैनल), पैक्लिटैक्सेल में इलाज (मध्यम पैनल), और आवर्तक चूहों (नीचे पैनल) की अनुमति के रोटेशन डेटा सेट. यह मंगल ग्रह प्रणाली का उपयोग कर घुमाया जा रहा है के रूप में चित्रा पैनल प्रति एक माउस की छवि को दर्शाता है. यहां तक कि महत्वपूर्ण ट्यूमर बोझ के साथ नियंत्रण चूहों में ट्यूमर आकार छवि से लिया गया कोण के आधार पर कम करके आंका जा सकता है कि ध्यान दें.
Discussion
हम रोगियों में मनाया नैदानिक प्रोफाइल mimics कि एक आईपी मानव डिम्बग्रंथि के कैंसर पशु मॉडल की स्थापना के लिए एक प्रोटोकॉल का वर्णन. इसके अलावा, हम 2 डी इमेजिंग की संवेदनशीलता सीमा के पते एक जानवर है कि रोटेशन डिवाइस का उपयोग का वर्णन. साथ में ले ली, इन तकनीकों chemoresistant बारम्बार डिम्बग्रंथि के कैंसर लक्षित कर सकते हैं कि उपन्यास यौगिकों की खोज करने के लिए प्लेटफॉर्म के रूप में सेवा कर सकते हैं. इसके अलावा, इस तरह के मॉडल कैंसर पुनरावृत्ति और प्रगति के जीव विज्ञान को समझने के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है.
कारण इसकी retroperitoneal स्थान पर, प्रारंभिक अवस्था आईपी डिम्बग्रंथि के कैंसर xenografts शारीरिक रूप से माउस का परीक्षण करके पता लगाने के लिए लगभग असंभव है. ज्यादातर मामलों में, रोग palpated किया जा सकता है, एक बार ट्यूमर बोझ पहले से ही महत्वपूर्ण है और इसलिए उपचार प्रभावकारिता का मूल्यांकन सीमित करता है. fluorescently लेबल कोशिकाओं का उपयोग वास्तविक समय में और फलस्वरूप टी शुरू करने के लिए अधिकतम समय की पहचान आईपी ट्यूमर की स्थापना का आकलन करने के लिए हमें की अनुमति देता हैreatment. इसी तरह रास्ते में, फ्लोरोसेंट लेबल xenografts उपचार प्रतिक्रिया की निगरानी की अनुमति. यह बताया जाना चाहिए से बाहर हालांकि कि आईपी गहरे से 1 सेमी चाहे संवाददाता प्रणाली का आम तौर पर पहचाने नहीं हैं ट्यूमर.
मानव डिम्बग्रंथि के कैंसर स्टेम सेल 14,15,17,22 का उपयोग मरीजों में मनाया नैदानिक प्रोफाइल की नकल है कि xenografts उत्पन्न करता है. एक प्राथमिक रोग के रूप में, मॉडल पैक्लिटैक्सेल के लिए उत्तरदायी है लेकिन उपचार की समाप्ति के अंत में chemoresistant आवर्तक रोग होता है. नयाचार अनुभाग में निर्दिष्ट घनत्व में गर्भाशय सींग के माध्यम से कोशिकाओं को शुरू आमतौर पर इसलिए कुछ पेरिटोनियल प्रत्यारोपण, और mimics प्रारंभिक अवस्था रोग के साथ 10 दिनों के भीतर डिम्बग्रंथि ट्यूमर में यह परिणाम है. fluorescently लेबल कोशिकाओं का उपयोग वास्तविक समय में और फलस्वरूप इलाज शुरू करने के लिए अधिकतम समय की पहचान आईपी ट्यूमर की स्थापना का आकलन करने के लिए हमें की अनुमति देता है. इसी तरह रास्ते में, फ्लोरोसेंट लेबल xenografts निगरानी ओ की अनुमतिउपचार के लिए एफ प्रतिक्रिया. कैंसर सेल लाइनों के अन्य प्रकार डिम्बग्रंथि, इस्तेमाल किया या अन्यथा रहे हैं, यह इस प्रोफाइल देखा नहीं जा सकता है कि संभव है. SKOV3 उदाहरण के लिए इस्तेमाल किया जाता है, यह प्रारंभिक आईपी ट्यूमर पहले से ही 23 प्रतिरोधी रहे हैं कि सूचना दी गई है. ऐसे प्रतिदीप्ति, आईपी रूप में एक संवाददाता के साथ लेबल फिर भी, अगर, रोग वास्तविक समय में पीछा किया जा सकता.
अन्य फ्लोरोसेंट संवाददाता प्रयोग किया जाता है, तो यह एक नियंत्रण (कोई ट्यूमर) जानवर के साथ प्रारंभिक इमेजिंग प्रदर्शन करने के लिए महत्वपूर्ण है. इस इमेजिंग प्रोटोकॉल का अनुकूलन अनुपात संकेत करने के लिए सबसे अच्छा पृष्ठभूमि प्राप्त करने के लिए अनुमति देगा. GFP के अधिग्रहण सेटिंग्स का उपयोग imaged जब हमारे अनुभव में, नग्न चूहों आम तौर पर उच्च पृष्ठभूमि है.
यह कोशिकाओं गर्भाशय में ट्यूमर की स्थापना से बचने के लिए ही निलंबन में अंतर गर्भाशय रहे इंजेक्शन कि महत्वपूर्ण है. यह भी कैंसर सेल के engraftment की सुविधा है, जो गर्भाशय उपकला परत, scratching से बचने के लिए भी महत्वपूर्ण हैगर्भाशय में इस प्रकार एक अंतर गर्भाशय में ट्यूमर के बजाय एक आईपी रोग का निर्माण किया. इसके अलावा, डेटा विश्लेषण के दौरान, यह इस छवियों की तीव्रता रैखिक है और छवियों के बीच तुलना की अनुमति देता है कि सुनिश्चित करने के लिए 1. गामा मूल्य निर्धारित करने के लिए महत्वपूर्ण है.
मार्स छवियों के अधिग्रहण के दौरान, यह बंधनेवाला nosecone के tubed अंत nosecone अवकाश में है कि यह सुनिश्चित करने के लिए महत्वपूर्ण है. nosecone माउस के लिए संपर्क का एक बिंदु के रूप में कार्य करता है और इसलिए ठीक calibrated कोण प्राप्त करने के लिए आवश्यक है. अब इमेजिंग प्रोटोकॉल (यानी अब से 1 घंटा) के लिए, निर्जलीकरण को रोकने में मदद करने के लिए बाँझ खारा subcutaneously के 100 μl इंजेक्षन. पशु शरीर के तापमान में लगभग 37 डिग्री सेल्सियस प्रणाली के माध्यम से प्रवाहित गर्म हवा का उपयोग कर बनाए रखा जाना चाहिए. मार्स प्रणाली की एक सीमा केवल एक पशु पशु प्रति लगभग 1 घंटे की कुल चलाते समय के साथ एक समय में imaged किया जा सकता है.
अंत में, हम ब्याज का वर्णननिकट डिम्बग्रंथि के कैंसर, दोनों को प्राथमिक और आवर्ती रोग mimics कि एक पशु मॉडल की ablishment. इस मॉडल उपन्यास निदान या चिकित्सीय तौर तरीकों की प्रभावकारिता का मूल्यांकन करने के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है.
Disclosures
इस लेख के लिए प्रकाशन फीस आंशिक रूप से Bruker निगम द्वारा प्रायोजित किया गया था.
Acknowledgments
इस अध्ययन कार्यक्रम का इलाज करने के लिए रेत परिवार फाउंडेशन, और डिस्कवरी द्वारा, एनआईएच अनुदान RO1CA118678 और RO1CA127913 द्वारा समर्थित किया गया था.
Materials
Name | Company | Catalog Number | Comments |
RPMI 1640 media | GIBCO, by Life Technologies | 23400-021 | |
fetal bovine serum | Gemini Bioproducts | 100-106 | |
T75 cell culture flasks | Corning | 430641 | |
PBS | Life Technologies | 10010-023 | |
Trypsin | GIBCO, by Life Technologies | 25300-054 | |
Isoflurane | Butler Schein | NDC 11695-6776-1 | |
Alcohol pads | Fischer Scientific | 06-669-62 | |
1 ml syringe | Becton Dickinson | 309602 | |
25 gauge needle | Becton Dickinson | 305122 | |
synthetic absorbable suture | Covidien | SL-636 | |
tissue adhesive | Vetbond | 1469SB | |
surgical scissors | VWR | 82027-584 | |
surgical forceps | VWR | 82027-386 | |
hemostat | VWR | 82027-422 | |
Paclitaxel | Hospira, Inc. | NDC 61703-345-50 | |
Ibuprofen | Walgreens | Children's Ibuprofen 100 (100 mg/5 ml) | |
Puralube Vet ointment | Pharmaderm | ||
In vivo MS FX PRO | Bruker Corporation | ||
MI software | Bruker Corporation | ||
athymic nude mice | Harlan |
References
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