Abstract
Cancro ovarico epiteliale è la neoplasia maligna ginecologica più letale negli Stati Uniti. Anche se i pazienti inizialmente rispondono alla attuale standard di cura costituito da debulking chirurgico e chemioterapia combinata che comprende composti del platino e taxani, quasi il 90% dei pazienti che ricorrono nel giro di pochi anni. In questi pazienti lo sviluppo della malattia chemioresistente limita l'efficacia degli agenti chemioterapici attualmente disponibili e quindi contribuisce all'elevata mortalità. Per scoprire le opzioni terapeutiche innovative in grado di indirizzare recidiva di malattia, modelli animali che imitano da vicino il profilo clinico dei pazienti con carcinoma ovarico ricorrente sono obbligatori. La sfida nel monitoraggio (ip) malattia intraperitoneale limita l'uso di modelli ip e quindi la maggior parte per via sottocutanea xenotrapianti sono stabiliti. Abbiamo sviluppato una piattaforma di imaging ottico sensibile che consente l'individuazione e la localizzazione anatomica della massa tumorale ip. La piattaforma include la use del reporter ottici che si estendono dalla luce visibile al vicino infrarosso, che in combinazione con 2-dimensionale raggi X co-registrazione può fornire localizzazione anatomica di segnali molecolari. La rivelazione viene significativamente migliorata con l'uso di un sistema di rotazione che spinge l'animale a più posizioni angolari per l'imaging 360 gradi, che permette l'identificazione di tumori che non sono visibili in un'unica orientamento. Questa piattaforma fornisce un modello unico di modo non invasivo la crescita del tumore monitorare e valutare l'efficacia di nuove terapie per la prevenzione o il trattamento del cancro ovarico ricorrente.
Introduction
I modelli animali sono strumenti indispensabili nella ricerca delle scienze della vita. In particolare il cancro, i dati acquisiti da studi su animali forniscono le informazioni necessarie per avviare la sperimentazione di applicazioni diagnostiche o terapeutici nell'uomo 1-3. Modelli animali per i tumori solidi sono classicamente stabilite per via sottocutanea in quanto fornisce un mezzo semplice per misurare il carico tumorale e valutare l'efficacia del trattamento, senza dover sacrificare gli animali. In effetti, intra-peritoneale (ip) modelli richiedono che gli animali sacrificati per rilevare e misurare le variazioni di crescita del tumore. Tuttavia, per i tumori ip quali cancro ovarico, modelli ortotropici offrono il vantaggio di studiare la malattia nel suo ambiente appropriato 4-6. Per un tale modello sia di uso nella valutazione dell'attività antitumorale, metodi di imaging non invasive devono essere sviluppati che permettono la quantificazione di carico tumorale ip in topi vivi.
Una delle principali sfide nell'uso di modelli animali ip è la difficoltà di quantificare con precisione massa tumorale con l'esame fisico. Quantificazione accurata dei tumori ip di solito richiedono il mouse per essere sacrificato per la dissezione. Questo approccio richiede l'uso di elevato numero di animali, che sarebbero sacrificati a diversi tempi. Oltre al costo, introduce elevata variabilità dei dati a causa di variazioni inerenti all'interno di ogni animale. Non invasiva in vivo imaging ottico fornisce un approccio più adatta per monitorare ip massa tumorale in topi vivi.
Diversi metodi di imaging non invasive sono attualmente utilizzati nella ricerca pre-clinica per il monitoraggio della crescita tumorale e risposte terapeutiche. Questi includono la tomografia computerizzata (TC), l'ecografia (US), la risonanza magnetica (MRI), tomografia ad emissione di positroni (PET), e l'imaging ottico, come fluorescenza e bioluminescenza 7-12. CT è un processo di riproduzione di trasmissione combina raggi X e computtecnologia ER. Produce un'immagine sezione di travi rilevate di fotoni ad alta energia, che passa attraverso il corpo con velocità differente. Stati Uniti sono un tipo di immagine di riflessione, che invia i suoni ad alta frequenza per il corpo la creazione di onde sonore che si riflettono con velocità diversa a seconda della densità dei tessuti e riconosciuto dal computer per produrre una immagine visiva. MRI e PET sono modalità di imaging delle emissioni che utilizzano energia magnetica e particelle nucleari, rispettivamente, per produrre l'immagine. MRI crea un forte campo magnetico che induce le cellule a produrre le proprie frequenze radio, che vengono utilizzati per creare un'immagine mentre PET richiede una telecamera sensibile per rilevare la radioattività del marcato 7,9,11 2-fluorodeoxy-D-glucosio amministrato. Infine, imaging ottico si basa sulla rilevazione della luce di emissione del reporter o sonde 9,12 bioluminescenti o fluorescenti.
In questo rapporto, descriviamo l'uso della fluorescenza, che offrealcuni vantaggi rispetto agli altri tipi di modalità di imaging. Con fluorescenza, le cellule possono essere geneticamente ingegnerizzati per esprimere proteine fluorescenti costantemente senza richiedere l'aggiunta di un substrato o sonde basate legatura-, che sono necessarie per la bioluminescenza e la risonanza magnetica, rispettivamente. Reporter fluorescenza anche in genere esprimono un segnale luminoso consentendo l'uso di un metodo di rilevamento meno sensibile 8,12. Inoltre, con l'imaging di fluorescenza, è possibile rilevare tumori inferiori ad 1 cm, che non è ottenibile con TC 7-9. Infine, a differenza di bioluminescenza, segnale di fluorescenza non richiede un ambiente aerobico e quindi il segnale non è limitato in ambienti ipossia, che di solito verificano nei nuclei di grandi tumori 13.
Tuttavia, come qualsiasi altra tecnologia, metodi di imaging basate fluorescenti presentano svantaggi. Uno dei quali è l'incapacità del machifotoni a bassa energia ne-generato di penetrare ad una profondità sufficiente. Così, per minimizzare la quantità di fotoni tessuto diffusi gli animali devono essere esposte ad angoli differenti. Descriviamo un protocollo per stabilire un IP cancro alle ovaie in topi nudi e un approccio per il monitoraggio del tumore ip che fornisce tutta l'imaging animale attraverso la rotazione. Il rotatore angoli del mouse per posizioni specifiche e ripetibili diminuendo l'interferenza tessuto che spesso si verifica tra la sorgente luminosa e il rivelatore. Ciò consente di ottimizzare la visualizzazione dei tumori più piccoli che potrebbero altrimenti perdere.
Protocol
Il Istituzionale cura e l'uso degli animali Comitato Yale University approvare tutto il lavoro in vivo descritto. Raccolta dei campioni è stata effettuata con il consenso del paziente e approvato dal comitato di indagini Umane della Yale University School of Medicine.
1. Preparazione di cellule umane di cancro ovarico
- Prima di preparare le cellule assicurarsi che tutti i materiali necessari per l'iniezione intra-uterina descritto di seguito sono pronte e facilmente accessibile. Iniettare la sospensione cellulare non appena è pronto.
- Crescere le cellule tumorali fluorescenti marcate nella cultura. Usiamo un F2-generazione di CD44 + umane / MyD88 + cellule di cancro ovarico epiteliale, che abbiamo precedentemente dimostrato di nutrire proprietà staminalità quali tumorigenicità, chemioresistenza e ad alta capacità per la riparazione del tumore 14-19. Queste cellule sono state generate per esprimere stabilmente mCherry fluorescenza (F2-mCherry, Fig. 1) utilizzando lentivirus prodotta dal polietilenimmina(PEI) protocollo 20,21.
- Il giorno di iniezione, raccogliere le cellule da tripsinizzazione e lavare una volta con tampone fosfato (PBS).
- Determinare numero di celle e di sospendere le cellule a 3 x 10 6 cellule / 50 ml in terreno di coltura appropriato. Per le cellule tumorali ovariche usiamo RPMI 160 con 10% FBS. Mantenere le cellule in incubatore fino al momento di iniezione, ma non tenere più di 15 min. Questo è sufficiente per una iniezione mouse.
2. iniezione intra-uterina di cellule umane di cancro ovarico in topi nudi atimici
Si noti che la seguente procedura richiede l'assistenza di una seconda persona. Inoltre, poiché questa è la chirurgia sopravvivenza, utilizzare strumenti chirurgici sterili. Questa procedura di chirurgia sopravvivenza dovrebbe durare circa 10 a 15 min.
- Anestetizzare il mouse utilizzando 2% isoflurano. Da 7 a 8 settimane di età topi nudi atimici viene utilizzato in genere.
- Verificare che l'animale è completely anesthesized pizzicando il rilievo del piede con le dita o pinze. L'animale deve essere completamente non risponde al dolore prima di iniziare l'intervento chirurgico.
- Posizionare il lato ventrale del mouse anestetizzato su un tampone di garza sterile, con la testa fuori dal ricercatore.
- Applicare una pomata sugli occhi con un applicatore di cotone punta a prevenire la secchezza mentre sotto anestesia.
- Inserire immediatamente la testa in un sistema di cono collegato ad un vaporizzatore isoflurano (Fig. 2A). Questo garantisce anestesia durante tutta la procedura chirurgica.
- Disinfettare sinistra (o destra) lato del ventre con tamponi imbevuti di alcol (Fig. 2B), seguiti da iodio poi posto un telo chirurgico sterile, il sito chirurgico.
- Con le forbici chirurgiche sterili e pinze fare una incisione cutanea di 1-2 cm sul quadrante inferiore sinistro del mouse (Fig. 2C).
- Sollevare il muscolo e fare un'incisione per raggiungere il peritoneo. <li> sezionare il muscolo obliquo per esporre la cavità addominale.
- Individuare e identificare il corno uterino sinistro (Fig. 2D).
- Utilizzando emostatico sterile, bloccare entrambe le parti anteriore e posteriore del corno (Fig. 2E). Posizionare la pinza anteriore destra sotto la tuba di Falloppio e la pinza posteriore, proprio sopra il collo dell'utero.
- Avere la seconda persona iniettare la sospensione cellulare. Posizionare l'ago che contiene le cellule, a 45 ° perpendicolare al corno (Fig. 2F). Molto iniettare lentamente 50 ml di sospensione cellulare nel lume del corno uterino.
- Rimuovere l'ago e rilasciare il morsetto anteriore.
- Rilasciare il morsetto posteriore e sostituire il corno uterino nella cavità addominale.
- Chiudere il peritoneo con una sutura riassorbibile sintetica e chiudere la pelle con un adesivo tissutale.
- Rimuovere il mouse dal cono naso e mettere di nuovo in gabbia. Se necessario, cambiare le lenzuola per garantire un clean gabbia dopo l'intervento chirurgico. Assicurarsi che tutti gli animali sono svegli e attivi prima di lasciare incustodito.
- Fornire ibuprofene a 0,11 mg / ml di acqua potabile per il primo intervento dopo 48 ore. In seguito, sostituire con acqua potabile normale.
- Nota: che se vengono utilizzati topi nudi atimici e la pelle è chiuso con tessuto adesivo invece di suture, non è necessario separare i topi dopo l'intervento chirurgico. Topi SCID sono più aggressivi e possono essere separati.
- Seguire da vicino il sito di incisione possibile infezione a causa di ferita aperta.
3. Rilevamento di Early Stage intra-peritoneale cancro ovarico da Live In Vivo Imaging
Determinare la presenza di malattia ip intra-peritoneale da live imaging in vivo. Un sistema di rotazione degli animali multimodale (MARS) è utilizzato in questo protocollo.
- Accedi al software di acquisizione MARS all'interno del software IM. Questo modulo forniscecontrollo coordinato del MARS catturare impostazioni sfruttando funzionalità di acquisizione e di analisi del sistema di imaging. Ottimizzare le impostazioni di acquisizione individuali per ogni modalità di imaging utilizzando una singola vista prima di sviluppare il protocollo di rotazione al punto 3.4.
- Ingresso predeterminato valori di cattura. Per l'acquisizione di fluorescenza, utilizzare 10 sec di esposizione, 2 x 2 binning, f-stop 2.8, FOV 120 mm, es: 550 nm, em: 600 nm impostazione di acquisizione del filtro. Per la cattura dei raggi X, utilizzare un esposizione 10 sec, 2 x 2 binning, f-stop 2.8, FOV 120 mm, 35 kVp, 0.4 mm Al impostazione di acquisizione del filtro.
- Salvare i parametri al punto 3.2 come file di sessione singoli.
- Creazione di un protocollo sequenza di rotazione selezionando il pulsante Crea / Modifica protocolli dalla finestra acquisiscono interfaccia del sistema.
- Selezionare il file di sessione di fluorescenza precedentemente salvato e salvare come Fase uno. Quindi, selezionare il file di sessione di raggi X corrispondente e salvare come Fase due.
- Con Step One selezionato, utilizzare il set di rotazioneSerie dal menu a comparsa Acquisizione Immagine Prima di impostare l'angolo di partenza desiderato, gamma, e l'incremento di assicurare senza soluzione di continuità per la visualizzazione delle funzioni. I valori specifici includono un angolo iniziale di -180 gradi, una gamma di 375 gradi, e un incremento di 15 gradi.
- Salvare il protocollo e fare clic sul pulsante Fine per inizializzare il MARS e mappare le posizioni del motore passo-passo corrispondenti a ciascuno degli incrementi angolari.
- Eseguire la calibrazione finale come descritto di seguito per allineare ventrale, dorsale e laterale per l'animale specifico posizionata nel supporto animale con specifici gradi di rotazione per essere utilizzato dal protocollo software.
- Anestetizzare il mouse con una miscela di aria medicale e 2% isoflurano ad un flusso di 2 L / min.
- Avviare l'allineamento selezionando il pulsante Anteprima dall'interno del menu Acquisisci per visualizzare la scheda Rotator. Utilizzare la modalità luce riflettente piuttosto che la Multiwavelength o X-ramodalità y per accelerare il processo.
- Selezionare l'opzione mouse carico e procedere attraverso la serie di menu di posizionamento.
- Assicurarsi che l'estremità a valvole del nosecone pieghevole è nella cavità dell'ogiva e posizionare il mouse con l'orientamento prono con la testa sotto la nosecone.
- Iniziare la taratura nella posizione 0 gradi con il lato ventrale dell'animale rivolto verso il basso. Utilizzare le due manopole sul sistema di rotazione per posizionare l'animale in modo che appare centrato nella finestra di anteprima.
- Ripetere il processo come richiesto per -180, - 90, +90 e +180 gradi posizioni e fare clic su Fine.
- Eseguire il protocollo precedentemente salvato, fare clic sul pulsante Esegui Protocollo dalla finestra acquisire principale. Durante l'esecuzione del protocollo, osservare una finestra di stato che fornisce aggiornamenti di stato in tempo reale per la cattura corrente, Esposizione durata, e passo nel complesso protocollo.
- Assemblare le singole immagini in un formato filmato utilizzando ilSoftware di rotazione. Utilizzare i controlli del display per regolare la luminosità / contrasto, la trasparenza, e per impostare il colore di visualizzazione per il segnale di fluorescenza.
- Esportare la sequenza finale di immagini in formato * .AVI per la presentazione.
4. La somministrazione di 1 ° e 2 ° Turno chemioterapia
- Dopo il rilevamento del tumore ip da Mars, determinare l'area tumorale iniziale di interesse (ROI) utilizzando posizionamento bidimensionale standard. Questa operazione viene eseguita su un vassoio animali trasparente montato nel sistema di imaging come descritto di seguito nella sezione 5. Una volta ROI iniziale è determinata, somministrare 4 dosi di 12 mg / kg ip Paclitaxel ogni tre giorni. Paclitaxel è ottenuto da Hospira Inc. in una formulazione pronto per andare con cremaphor come veicolo. Abbiamo precedentemente dimostrato che questo regime di trattamento ha una significativa attività antitumorale contro il modello di xenotrapianto rispetto al controllo del veicolo e induce completa eradicazione della rilevabile tumor carico 20. Tuttavia, a causa della natura della malattia, tumori ip ricorrono alcuni giorni dopo il trattamento termina 20.
- Monitorare la risposta al trattamento ed eseguendo un'immagine ogni 3 giorni con il posizionamento bidimensionale standard.
- Dopo la quarta dose di Paclitaxel, classificare i topi come avente risposta completa (ROI inferiore a 2.000), risposta parziale (fino al 35% di diminuzione della ROI iniziale ottenuto dalla fase 4.1, malattia stabile (fino al 50% di aumento del ROI iniziale ), o la progressione con il trattamento (aumento di oltre il 50% dal ROI iniziale) in base al segnale di fluorescenza osservato.
- Per i topi con risposta completa, monitorare recidiva ed eseguendo un'immagine ogni 3 giorni. Una volta recidiva si osserva (ROI = ROI iniziale al punto 4.1), ri-avviare la seconda tornata di Paclitaxel come descritto in 4.1.
- Nei topi con malattia parziale, malattia stabile, o quelli che procedeva con il trattamento, riprendere la seconda tornata di Paclitaxel 3 giorni dopo il 4 ° dose didi Paclitaxel. Allo stesso modo, l'immagine questi ogni tre giorni.
Risposta 5. Monitoraggio di trattamento con Standard Positioning bidimensionale
- Anestetizzare i topi di essere ripreso con una miscela di aria medicale e 2% isoflurano ad un flusso di 2 L / min.
- Posizionare la testa dei topi anestetizzati nei singoli nosecones nel vassoio animali trasparente all'interno della camera di imaging (Fig. 3).
- Inserire i parametri di esposizione predeterminati per fluorescenza (10 sec di esposizione, 2 x 2 binning, f-stop 2.8, FOV 120 mm, es: 550 nm, em: 600 nm) e di raggi X (esposizione 20 sec, 2 x 2 binning, f-stop 2.8, FOV 120 mm, 35 kVp, 0.4 mm Filtro Al).
- Clicca Esporre per catturare sia immagini in sequenza.
- Aprire le immagini nel software Bruker MI per l'ispezione visiva e la regione di analisi di interesse.
6. Immagine Overlay e analisi
Per fornire un confronto valido per both analisi visiva e quantitativa dell'immagine naturalmente processo di sequenza temporale di tutte le immagini di primo piano e di sfondo simile.
- Aprire sia l'immagine in primo piano (vale a dire a fluorescenza) e la formazione immagine di sfondo nel software e selezionare la funzione di piastrelle dal menu Finestra in alto (Fig. 4A).
- Per elaborare l'immagine in primo piano; aprire la scheda di visualizzazione delle immagini sulla barra in alto (Fig. 4A, freccia rossa) e impostare i valori min / max a 260 e 5.000, rispettivamente (Fig. 4A, freccia blu)
Nota: Campo di visualizzazione delle immagini è diverso da uno studio all'altro a seconda delle intensità di segnale di fluorescenza catturati in immagini. Le immagini devono essere in contrasto con un min / max che mostrerà masse tumorali, ma non mostrare sfondo da autofluorescenza dell'animale. - Successivo aperto Auto-ROI scheda dal pannello di navigazione a sinistra (Fig. 4B, freccia rossa) e selezionare il ROI Nuovo set dal menu (Fig. 4C, un rossoRROW). Regolare le impostazioni per utilizzare l'algoritmo di soglia a 630 livelli di grigio e deselezionare l'Limita dimensione massima per garantire che tutti (Fig. 4C) ROI potenziale di sono registrati.
Nota: le impostazioni di soglia possono differire da studio a studio a seconda delle intensità di segnale di fluorescenza catturati in immagini. Immagini thresholded per quantificare segnale da masse tumorali ma non misurare il segnale da sfondo da autofluorescenza dell'animale. - Dall'interno dell'immagine per la visualizzazione della finestra selezionare la funzione Mask. Ora verrà visualizzata solo l'area corrispondente ai pixel che hanno valori pari o superiore al valore di soglia di 630 livelli di scala di grigi.
- Per visualizzare i risultati quantitativi selezionare la scheda Analisi nella barra dei menu in alto e selezionare la scheda display (Fig. 4D, frecce rosse).
- Nel menu Visualizza selezionare il numero di serie, Somma, medi, e Area caselle di controllo e quindi fare clic su OK.
- Salvare l'immagine in modo che i valori possono essere exportato avanti una volta che tutte le immagini di fluorescenza vengono elaborate.
- Avanti, evidenziare l'immagine a raggi X e di nuovo aprire il display LCD dalla barra dei menu in alto. Impostare i valori di min, max e gamma per dare la migliore rappresentazione visiva dello scheletro del mouse.
Nota: Dal momento che nessuna quantificazione viene eseguita sulle immagini a raggi X ogni singola immagine a raggi X dalla sequenza temporale può essere processati (cioè min, max e valori gamma) per produrre la migliore rappresentazione in cerca di quel set di dati. - Anche in questo caso l'immagine a raggi X con evidenziato selezionare la casella di controllo Overlay e scegliere il nome del corrispondente file di immagini di fluorescenza dal menu (Fig. 4E) verso il basso.
- Per estrarre l'uscita sovrapposto, selezionare la scheda Annotazioni dal menu di Navigazione (Fig. 4B, freccia blu) sulla sinistra. Selezionare le schede appropriate per aggiungere eventuali dati aggiuntivi o testo e, infine, aggiungere la barra di scala di intensità in modo che i dati di intensità di fluorescenza è possibile determinare rapidamente dalla iml'età.
- Una volta che le annotazioni sono state completate clou tutti gli oggetti della pagina Annotazioni e selezionare Copia dal menu Modifica nella parte superiore e incollare i dati di immagine sovrapposti nel file appropriato (ad esempio Word, PowerPoint, e / o Photoshop) per la visualizzazione.
- Ripetere i passaggi a 6.1 6.11 per tutte le coppie di immagini di fluorescenza e raggi X nella sequenza. Assicurati di sicurezza tutte le immagini prima di chiuderli.
- Per la quantificazione finale aprire tutte le immagini di fluorescenza contemporaneamente e selezionare Tile dal menu Finestra lungo la parte superiore.
- Quindi selezionare i Esporta tutto Apri documenti per visualizzare i dati.
Nota: In assenza del programma Excel, deselezionare la scheda. MI genererà un file di testo delimitato da tabulazioni (cioè .txt) che possono essere trasferiti ad un computer appropriato per ulteriori analisi.
Representative Results
Non invasiva di imaging in tempo reale consente il monitoraggio della progressione tumorale ip dal medesimo topi nel tempo. Iniezione intra-uterina di F2 cellule di cancro ovarico mCherry-etichettati utilizzando il protocollo descritto genera tumori ip visibili il giorno 5 e carcinomatosi al giorno 32 (Fig. 5). Figura 6 mostra la correlazione delle immagini ottenute con carcinomatosi osservato dopo sacrificare i topi .
Imaging utilizzando MARS consente l'individuazione di tumori ip che altrimenti perdere se l'immagine viene acquisita da un solo unico piano. Figura 7 (pannello superiore) mostra che, anche nei topi di controllo con un significativo carico tumorale, la dimensione del tumore può essere sottovalutato in funzione dell'angolo l'immagine è stata scattata da. La capacità di garantire che la massa tumorale non è mancato o sottovalutato è ancora più importante a conclusione del 1 ° turno chemioterapia quando gli animali sono classificati sia come rispondere completoer, responder parziali, o non-responder (Fig. 7 pannello centrale). Allo stesso modo, durante la terapia di mantenimento è della massima importanza per individuare oggetti molto piccoli tumori ricorrenti per indicare correttamente giorni alla recidiva, che definisce l'intervallo libero da progressione (Fig. 7 pannello centrale).
Valutazione quantitativa del carico tumorale è ottimizzata attraverso la rotazione degli animali. Rotazione dell'animale ad angoli in grado di minimizzare l'eccitazione profondità e la luce di emissione viaggia attraverso consentirà la cattura più accurata di fotoni da fluorescenza, che è indicativa della quantità di cellule tumorali e quindi massa tumorale. Pertanto, la quantificazione è ottimizzato per i tumori specifici nell'animale a seconda della sua posizione nella sequenza di rotazione.
Nel presentare immagini di insiemi di dati di rotazione, è importante assegnare le immagini un'immagine intervallo minimo / massimo contrasto che effettivamente visualizzare tutte le masse tumorali, pur consentendo visu al delineazione delle singole masse tumorali. Per questo studio, gamma di contrasto ideale è risultato essere un minimo di 50 conteggi e un massimo di 1.200 conteggi. Questi valori possono essere visti come linea guida per altri studi, tuttavia, gli intervalli ottimali di contrasto saranno diversi da studio a studio a seconda del livello del tumore onere, fluorescenti livelli di espressione peptide nelle cellule, la configurazione del sistema di imaging, e le impostazioni di cattura.
Figura 1: cellule di cancro ovarico F2 stabilmente esprimono mCherry fluorescenza. (A) immagine di fase; (B) l'immagine di fluorescenza; (C) sovrapposizione di A e B. Si noti che il 100% delle cellule esprimono il reporter fluorescenza.
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Figura 2: iniezione intra-uterina di cellule di cancro ovarico. (A) l'anestesia viene continuamente somministrato attraverso un cono di naso; (BE), la pelle viene incisa per individuare e bloccare il corno uterino; (F) cellule tumorali vengono iniettate lentamente nel lume dell'utero.
Figura 3: (A) immagini 2D con temperatura controllata e circuito chiuso ventilato vassoio animale trasparente all'interno della camera di imaging; (B, C) vassoio è dotato di coni d'ogiva per fornire anestesia e può contenere fino a cinque topi.
<> Figura 4 forti: Rappresentante vetrate tratte dal software di analisi per aiutare nell'analisi dei dati. Si prega di vedere il testo per la spiegazione.
Figura 5: Rilevamento di mCherry fluorescenza co-localizzato con i raggi X in sequenza di imaging longitudinale. Tre topi con tumore ip sono seguiti nel tempo per valutare la progressione del tumore ip. Si noti che la progressione del tumore può variare. La figura è un'immagine rappresentativa di 3 topi con diversi tassi di progressione del tumore e quindi variando il carico tumorale attraverso il tempo.
Figura 6: Correlazione tra massa tumorale ip (pannello superiore) e la fluorescenza / X-ray overlay image (pannello inferiore). Circa 32 giorni dopo l'iniezione di cellule di cancro ovarico F2-mCherry, 2D imaging viene eseguita e topi sacrificati per correlare effettivo carico tumorale con l'immagine acquisita. Le frecce rosse indicano il carico tumorale.
Figura 7: rotazione set di dati che consentono di imaging multi-angolo e la rilevazione di tumori a controllo (pannello superiore), Paclitaxel trattati (pannello centrale), e topi ricorrente (pannello inferiore). La figura mostra l'immagine di un singolo mouse per pannello come viene ruotato utilizzando il sistema MARS. Si noti che anche nei topi di controllo con un significativo carico tumorale, la dimensione del tumore può essere sottovalutato in funzione dell'angolo l'immagine è stata presa da.
Discussion
Descriviamo un protocollo per stabilire un modello animale ip umana cancro ovarico che imita il profilo clinico osservato nei pazienti. Inoltre, si descrive l'utilizzo di un dispositivo di rotazione animale che affronta la limitazione sensibilità di immagini 2D. Nel loro insieme, queste tecniche possono fungere da piattaforme di scoprire nuovi composti in grado di indirizzare chemioresistente recidiva di cancro ovarico. Inoltre, tale modello può essere utilizzato per comprendere la biologia di recidiva e progressione del cancro.
Grazie alla sua posizione retroperitoneale, in fase iniziale ip xenotrapianti di cancro ovarico sono quasi impossibili da rilevare esaminando fisicamente il mouse. Nella maggior parte dei casi, una volta che la malattia può essere palpata, il carico tumorale è già significativo e quindi limita la valutazione dell'efficacia del trattamento. L'uso di cellule marcate modo fluorescente ci permette di valutare la creazione di tumore ip in tempo reale e quindi individuare il momento ottimale per iniziare tRATTAMENTO. In modo simile, xenotrapianti fluorescenti marcati consentono il monitoraggio della risposta al trattamento. Va sottolineato, tuttavia, che ip tumori più profonda di 1 cm non sono tipicamente rilevabili indipendentemente dal sistema reporter.
L'utilizzo di cancro ovarico cellule staminali umane 14,15,17,22 genera xenotrapianti che imitano il profilo clinico osservato nei pazienti. Come una malattia primaria, il modello è sensibile a Paclitaxel ma la cessazione del trattamento fine porta a recidive chemioresistente. Introducendo le cellule attraverso le corna uterine alla densità specificata nella sezione Protocollo di solito si traduce in tumori ovarici entro 10 giorni con un paio di impianti peritoneali, e quindi imita malattia in stadio precoce. L'uso di cellule fluorescente ci permette di valutare la creazione di tumore ip in tempo reale e di conseguenza individuare il momento ottimale per iniziare il trattamento. In modo simile, xenotrapianti fluorescenti marcati consentono il monitoraggio of risposta al trattamento. Se si utilizzano altri tipi di linee cellulari tumorali, ovarico o altro, è possibile che questo profilo non può essere osservato. Quando SKOV3 viene utilizzato ad esempio, è stato riportato che i tumori ip iniziali sono già resistenti 23. Tuttavia, se marcato con un reporter come la fluorescenza, ip, malattia può essere seguita in tempo reale.
Se viene utilizzato altro reporter fluorescente, è importante effettuare l'imaging iniziale con un controllo (senza tumore) animale. Ciò permetterà l'ottimizzazione del protocollo di imaging per ottenere lo sfondo migliore rapporto segnale. Nella nostra esperienza, topi nudi in genere hanno un alto background quando ripreso utilizzando le impostazioni di acquisizione GFP.
È importante che le cellule iniettate intrauterina sono singole sospensioni per evitare la creazione di tumori dell'utero. E 'anche importante evitare di graffiare lo strato epiteliale uterina, che facilita anche attecchimento della cellula tumorales dell'utero producendo così un tumore intrauterina invece di una malattia ip. Inoltre, durante l'analisi dei dati, è importante impostare il valore gamma di 1. Ciò assicura che l'intensità delle immagini è lineare e permette il confronto tra le immagini.
Durante l'acquisizione di immagini MARS, è importante garantire che l'estremità a valvole del musetto pieghevole è nella cavità dell'ogiva. Il nosecone funge da punto di contatto per il mouse ed è quindi necessaria per ottenere gli angoli accuratamente tarata. Per i protocolli di imaging più lunghi (cioè più di 1 ora), iniettare 100 ml di soluzione salina sterile per via sottocutanea per aiutare a prevenire la disidratazione. Temperatura del corpo animale deve essere mantenuta utilizzando aria calda fluiva attraverso il sistema a circa 37 ° C. Una limitazione del sistema MARS è che solo un animale può essere ripreso alla volta con un tempo totale di circa 1 ora per animale.
In conclusione, si descrive l'establishment di un modello animale che imita da vicino il cancro ovarico, sia malattia primaria e ricorrente. Questo modello può essere utilizzato per valutare l'efficacia delle modalità diagnostiche o terapeutici.
Disclosures
Spese di pubblicazione per questo articolo sono stati parzialmente sponsorizzati da Bruker Corporation.
Acknowledgments
Questo studio è stato sostenuto da sovvenzioni NIH RO1CA118678 e RO1CA127913, dalla Family Foundation Sands, e la scoperta per curare Programma.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| RPMI 1640 media | GIBCO, by Life Technologies | 23400-021 | |
| fetal bovine serum | Gemini Bioproducts | 100-106 | |
| T75 cell culture flasks | Corning | 430641 | |
| PBS | Life Technologies | 10010-023 | |
| Trypsin | GIBCO, by Life Technologies | 25300-054 | |
| Isoflurane | Butler Schein | NDC 11695-6776-1 | |
| Alcohol pads | Fischer Scientific | 06-669-62 | |
| 1 ml syringe | Becton Dickinson | 309602 | |
| 25 gauge needle | Becton Dickinson | 305122 | |
| synthetic absorbable suture | Covidien | SL-636 | |
| tissue adhesive | Vetbond | 1469SB | |
| surgical scissors | VWR | 82027-584 | |
| surgical forceps | VWR | 82027-386 | |
| hemostat | VWR | 82027-422 | |
| Paclitaxel | Hospira, Inc. | NDC 61703-345-50 | |
| Ibuprofen | Walgreens | Children's Ibuprofen 100 (100 mg/5 ml) | |
| Puralube Vet ointment | Pharmaderm | ||
| In vivo MS FX PRO | Bruker Corporation | ||
| MI software | Bruker Corporation | ||
| athymic nude mice | Harlan |
References
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