Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
Click here for the English version

Chemistry

Kütle spektrometresi ile In-jel Geliştirilmiş İndirgemeli β-Eleme Kapsamlı O-bağlı ve için Sulfo-Glikomik

doi: 10.3791/51840 Published: November 20, 2014

Introduction

or Start trial to access full content. Learn more about your institution’s access to JoVE content here

Glikosilasyon organizma fizyoloji, doku patolojisi ve hücre tanıma 1-3 katkıda bir esas teşkil eden protein translasyon sonrası değişiklik. Analitik Glycoscience büyük ilerlemelere rağmen, belirli bir protein glıkanların tam çeşitliliği tanımlamak özellikle temel biyolojik kaynaklardan izole edilmiş protein ile ilgili olarak, son derece zorlu bir iştir. Bununla birlikte, glikoprotein glıkanların mikroheterojenlik sıklıkla diğer proteinler ile fonksiyonel etkileşimlerin etkiler. Bu nedenle, glıkan çeşitlilik karakterizasyonu hücre ve doku glikosilasyon 4,5 'fizyolojik önemini anlamak için gereklidir. Doku fizyoloji ve patofizyoloji, sağlam, hassas ve kapsamlı glycomic analitik teknikleri glikoprotein glycosylation'nin katkılarını anlamak için giderek daha önemli hale gelmiştir. Proteomik analizde, protein, teşhisi genellikle LC-MS ile elde edilir/ Triptik peptitler 6 MS analizi. Protein sindirimi gibi 7-9, tripsin gibi proteazlar ile jel yumuşatıldıktan sonra, SDS-PAGE ile yeniden çözülmüş saflaştırılmış bir protein ya da proteinleri kullanılarak gerçekleştirilebilir. SDS-PAGE ile protein karışımı Önzenginleştirme proteini numarası derinliğini ve doğruluğunu arttırır. Glikoprotein Glikosillenmenin glycomic analizi için benzer stratejilerin geliştirilmesi Glycoscience ön planda yer alır.

Glıkanların iki ana sınıfı, N-bağ ya da O-bağlantısı yoluyla ya proteini omurgalarına bağlanır. N-bağlantılı glikanları asparagin bağlıdırlar (Asn), Asn-X-Ser / Thr / Cys olarak tanımlanan bir sequon kapsamında bulunan tortular (X, prolin dışında herhangi bir amino asittir) ve peptit N ile enzimatik sindirme ile serbest bırakılabilir -glycanase (PNGaseF veya A), ya da çözelti içinde,-jel ya da açık-blot 10-12. O-bağlantılı glıkanlar, esas olarak serin (Ser) veya treonin (Thr) kalıntılarına eklenir. Ancak, sadece bir enzim iden edilmiştirglikoproteinin, O-bağlantılı glikanları salabilen ve sadece basit O-bağlantılı glikanlar salan, son derece sınırlı bir glıkan özgüllüğe sahiptir giderilene. Chemical Release stratejileri glikoproteinlerden O-bağlantılı glıkanların kapsamlı serbest bırakılması için tercih edilen bir yöntem olmaya devam etmektedir. Indirgeyici ya da indirgeyici olmayan β-kaldırılması veya hidrazinolize İyi karakterize edilmiş kimyasal tahliye etme teknikleri ve glikoproteinlerin 13,14, O-bağlantılı glikanları salınması için en yaygın olarak kullanılan tedavi alanında bulunmaktadır. İndirgeyici β-eliminasyon, SDS-PAGE ile ayrılmış glikoproteinlerden O-bağlantılı glikanlar serbest bırakmak için kullanılmış olmasına rağmen, daha önceki yaklaşımlar sonraki analiz 15-17 HPLC ayırma gereklidir.

Çok Boyutlu MS (MS n) analizi şu anda en çok biyolojik kaynaklardan beklenen miktarlarda izole glikoproteinlerden serbest glikanları karakterize yapısal verilerin zengin kaynağı sağlar. MS derinliğimerkezli bir yapısal karakterizasyon büyük ölçüde önce analizleri için salınan glikanlar permethylating ile kolaylaştırılır. Permethylation iyonizasyon artırır ve glıkan yapıları 18,19 geniş bir aralığı boyunca mol sinyal tepkilerinin eşitlemeye çalışır. Buna ek olarak, permethylation açıkça böylece yapısal açıklanmasını 20-23 arttırıcı özgü kitleler terminal ve yer değiştirmiş monosakkarit kısımları, etiketler. Örneğin, asidik glıkanlar MS non-permetilatlı türler olarak tespit etmek için, genellikle zordur. Asidik glıkanlar MS ile de negatif iyon modunda tespit edilebilir, ancak, aynı iyon modunda hem asidik hem de nötr glikanların, tespit etmek mümkün değildir. Glıkan permethylation önemli bir avantajı, permetilatlı bir glıkan en monosakarit ikame üzerindeki serbest hidroksil gruplarının (OH) her bunları tespit yapmak, bir metil grubu (OCH3 ya da OMe), bu şekilde sialilatlı bir glıkan ücretlerini nötrleştirilir başlıklı hale olmasıdır nötr (asyalo) glıkanlar. Bununla birlikte, sulfoglycans sülfatlanmıştır kısımların hidroksil iyonizasyonunu ve hassasiyetini azaltır anyonik şarj, retansiyonu ile sonuçlanır permethylation dayanıklıdır. Bu bastırma anda sülfatlı glikanların 24-26 yüksek bir bereket taşımak gibi müsinlerin gibi çok karmaşık glikoproteinler, kapsamlı glycomic analizini önler.

Arındırıcı sülfatlı Glikanların dair son raporlar ters-faz saflaştırmak için kromatografi ve MALDI analizden önce ayrı permetilatlı glikanlar, ücret kullanılmıştır. Bu yöntem, organik faz bölümleme daha az kesin olarak bulduk, elüsyon için farklı mobil fazlar kullanılarak sülfatlı ve sülfatlı olmayan glıkanların tamamen ayrılmasına dayanır. Bu nedenle, sulfoglycans saptanması ve zenginleştirilmesi için uygun olan yeni bir teknik burada sunulmuştur. Bu teknikler, su ardından sulu faz içinde sülfatlanmış glıkanların kantitatif iyileşme sağlar: DCM (diklorometan)rutin glıkan permethylation reaksiyonlar 27 sonunda gerçekleştirilir ekstraksiyon. Ayrıca, MS 2 parçalanma desen basitleştirirken Önemli olarak, permetilatlı sülfatlanmamış glıkanların karışımından permetilatlı sulfoglycans bu sağlam ayrılması eş zamanlı olarak yüklü türler için zenginleştirir. Geliştirilmiş-jel O-bağlantılı glıkan analizi için kapsamlı bir protokol de sunulmuştur. Geliştirilmiş protokol, glıkan iyileşmeye katkıda MS ile elde edilebilen N permetilatlı glikanların analiz yapısal bilgi arttırır, ve biyolojik kaynaklardan izole edilmiş temel glikoproteinlerine uygulanan sulfoglycomic analiz duyarlılığını arttırır.

Bu protokol, tüm glikoprotein özleri O-bağlantılı glıkan analizi ya da SDS-PAGE ile çözülmüş, ilgilenilen belirli bir glikoproteini amaçlanmıştır üç deney prosedürleri oluşmaktadır; A) jel temizlik, B) jel indirgeyici β-eliminasyon, ve C) glukanıdır permethylation. Amaç, biyolojik açıdan ilgi (Şekil 1), başlıca kaynaklarından hasat glikoproteinler için kapsamlı bir O-bağlantılı glycomic verileri elde etmektir. SDS-PAGE ile ayrılmış Glikoproteinler boyama ve ilgili bantlar kesilir ve elde edilen jel bant küçük parçalar halinde dilimlenir tarafından görüntülenmiştir. Jel parçaları boyası ve jel kirletici maddelerin (Şekil 2A) ortadan kaldırılması için etil asetat yıkamaya tabi tutulur. Glikan serbest-jel indirgeyici β-eliminasyon (Şekil 2B) ile elde edilir ve salınan glikanlar permetilatlı edilir. Sulu organik ekstraksiyon takip permethylation kantitatif uzaklıkta, sülfatlı olmayan nötr glikanların (Şekil 2C) için anyonik sülfatlanmış glikanları böler. -Jel sulu-organik ekstre bağlanmış indirgeyici β-eliminasyon, SDS-PAGE ile ayrılmış glikoproteinin küçük miktarlarda serbest O-bağlantılı glıkanların ve sulfoglycans karakterizasyonu sağlar. Stratejik bakış hülâsa ​​olduğunuŞekil 1 ve ayrıntılarda kanşımının, Şekil 2'de gösterilmiştir. Buna ek olarak, boyası ile yıkandı, jel parçalarının bir kısmı, standart bir LC-MS / MS teknikleri proteomik protein numarası için kullanılabilir.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

or Start trial to access full content. Learn more about your institution’s access to JoVE content here

NOT: Lab Güvenlik Endişeleri

Standart laboratuvar iyi uygulamalar doğrultusunda, aşağıdaki gözlemlemek. Uygun yerlerde bütün organik çözücüler saklayın. Kimyasal bileşimleri açık etiketleme ile kimyasal atık kaplarda tüm atık malzemelerini saklayın. Bu protokollerde kullanılan çeşitli reaktifler gibi potansiyel kanserojen veya, uçucu yanıcı gazlar oluşturur havalandırma ile bir davlumbaz tüm reaktifler anlaştım. Organik çözücüler ile çalışırken eldiven, laboratuvar önlüğü, ve göz koruması gibi kişisel koruyucu ekipman kullanın.

Şekil 1,
-Jel O-Glikomik 1. Prosedürü Şekil. Çevrede bulunan (A), proteinler, uygun boyama prosedürleri (Coomassie ya da gümüş) tarafından tespit edilen, SDS-PAGE ile çözülmüş ve çıkarılır. Kesilen jel adet dilimlenmişküçük küpler halinde, boyası, ve daha sonra MS analizi müdahale kirletici maddeleri azaltmak için etil asetat ile yıkanmıştır. Jel diliminin bir kısmı LC-MS / MS ile-jel triptik sindirime ve ardından proteomik karakterizasyon için rezerve edilebilir. (B) O-bağlantılı glıkanlar-jel indirgeyici β-eliminasyonu ile çözüldü glikoproteinlerin salınır. Başlıca adımlar tuz giderme ve metanol ile azeotrop borat gidermeyi içerir. Permetilatlı ve daha sonra, sulu ve organik faz halinde bölünmüştür (C) indirgeyici β-gidermede glikanları O-bağlıdır. Sulfoglycans kantitatif olarak, üst (sulu) faz içinde geri kazanıldığı alt (DCM), bir tabaka halinde nötr ve siyalilleştirilmiş glıkanlar bölümü ise.

Şekil 2,
-Jel Glikomik için Şekil 2. Detay akış şeması. Her experimenŞekil 1 'de gösterilen Tal adımı ayrı ayrı gösterilmektedir. (A) jel destaining ve EtOAc çıkarma, (B) jel indirgeyici O bağlantılı glıkan serbest bırakılması için β-eliminasyon, ve doğrudan (C) permethylation ve faz bölüm. rakamın daha büyük bir versiyonunu görmek için lütfen buraya tıklayınız.

1. Jel Eksizyon ve Jel-türetilmiş Kontaminantların Kaldırma

  1. Işlemine başlamadan önce, Malzeme Listesi'nde yer kimyasallar ve reaktifler hazırlamak.
  2. Standart Tris-Glisin tampon sistemleri kullanarak, SDS-PAGE jeli üzerinde protein giderin. Leke CBB veya Gümüş Boyası ile ya proteinleri çözüldü. Genel olarak, gümüş lekeli jeller, O-bağlantılı glıkanların geri Coomassie ulaşılan kurtarma yaklaşık% 80-90 jelleri lekelendi.
  3. Elektroforezisten sonra, bir cam levha ve tüketim t jel yerleştirintemiz bir neşter veya ustura kullanılarak ilgi o bölge.
  4. O-glıkanların verimini artırmak bir cam levha üzerine, ilgi konusu jel bant transferi ve yaklaşık olarak 2 mm küpler halinde kesilerek çıkarılmış jel parçasını kesmek için. Glıkan iyileşme azalır çünkü Jel parçacıkları 1 mm'den küçük küpler kaçının. Paslanmaz çelik microspatula ile Üstü yivli bir cam tüp (13 x 100 mm) içine küçük jel parçaları aktarın.
  5. Örnek tüpü 25 mM amonyum bikarbonat (AMBIC, 3 NH 4 HCO) 1 ml, Teflon kaplı vidalı üst kapağı ile cam tüp kap ekleyin ve yavaşça 10 dakika bekledikten önce tüp hafifçe karıştırın. Jel parçaları müthiş önlemek için güçlü bir ajitasyon istihdam etmeyin.
  6. Dikkatle Pasteur cam pipet veya ekstra-uzun plastik ucu ile donatılmış bir pipet kullanarak cam tüp AMBIC çıkarın. Çökertilmesi ve AMBIC çözüm çıkarırken küçük jel parçaları transfer kaçının.
  7. Asetonitril (ACN) 1 ml ekleyincam tüp, kap, ve yavaşça 10 dakika standı icar önce tüp hafifçe karıştırın. Jel parçaları tamamen solvent ile kaplıdır emin olun. Gerekirse, tüp duvar kapalı ve pipet ile çözücü içine jel parçaları itin.
  8. Cam tüpten ACN Pipet ve parlak mavi renk kaybolana kadar tekrarlayın 1,5-1,7 adımları. Gerekirse, beş ardışık AMBIC / ACN yıkama az tekrarlayın. Gümüş lekeli jeller için, bir destain kiti kullanın. Jel parça ACN muntazam beyaz süre döndüğünde bir sonraki adıma geçin.
  9. , Cam tüp herhangi bir sıvıyı pipetle tüp Özetlemek, AMBIC 1 ml ekleyin ve 5 dakika bekletin.
  10. AMBIC çıkarın ve cam boru, etil asetat (EtOAc), 2 ml ilave ediniz. Alternatif ucu-üzerinde-uç çalkalama ya da gece boyunca 4 ° C'de Teflon kaplı bir kapakla ve yer ile Özeti tüpü 30 dakika her biri için, oda sıcaklığında üç kez EtOAc ile yıkanarak gerçekleştirin. Daha EtOAc yıkaması, kirleticilerin daha etkili kaldırılması.
  11. KaldırSon EtOAc yıkama ve H2O, 2 ml ile üç yıkama her birini yerine EtOAc'nin komple kaldırma sağlam indirgeyici β-eliminasyon reaksiyonu sağlayacaktır.
  12. H2O Pipet ve ACN'den 1 ml ile bir kez yıkanarak jel dihidrat.
    Not: Kurutma işleminden sonra, susuz jeller-jel β-ortadan kaldırılması için hazırdır. Susuz Jel parçaları, kullanılıncaya kadar -20 ° C'de muhafaza edilebilir.
  13. Bağımsız olarak jele tatbik edildiği geçici bellek ya da çözelti, herhangi bir aşamada yıkama işlemini durdurmak ve gece boyunca 4 ° C'de jel parçaları saklamak (AMBIC, ACN, H2O). Önümüzdeki 2 gün içinde her zaman örnek hazırlama yeniden başlatın.
  14. Standart proteomik yaklaşımlar ile protein kimliği destained ve susuz jel parçaları bir kısmını kullanın.

Indirgeyici β-Eliminasyon 2. In-jel O-glukanıdır Yayın

  1. Kullanılana kadar 4 ° C'de% 50 NaOH veya katı NaOH ve mağaza ile 1 M sodyum hidroksit (NaOH) içindeki bir stok çözelti hazırlayın. % 50 NaOH (ya da katı NaOH 4 g) ihtiva eden 5.2 ml alın ve 1 M NaOH solüsyonu yapmak üzere, 100 ml hacim ayarlayın. İndirgeyici β-eliminasyon reaksiyonları etkinlik kaybı olmaksızın 6 aya kadar 4 ° C'de saklanabilir 100 mM NaOH, ile, 1 M NaOH stok çözeltisi ile seyreltilir.
  • 100 mM NaOH içinde 2 M sodyum borohidrid (NaBH4) konur. 100 mM NaOH, 0.5 ml, NaBH4 38 mg eritin. Genel olarak, her bir örnek için borohidrür çözeltisi 0.5-1.0 ml kullanmak. Aşama 1 'de hazırlanan kurutuldu jel parçalarının miktarına reaksiyon çözeltisinin hacmi 1-2 kesilmiş jel parçalarının (adım 1.3) için borohidrür çözeltisi 0.5 mi kullanmak için beklemek değişir.
  • Hidratı giderilmiş jel parçaları, 100 mM NaOH, 500 ul ilave edin ve glıkan geri kazanımını artırmak bazik koşullar için jel dengeye getirilmesi amacıyla, buz üzerinde 3-5 dakika boyunca bekletin.
  • 1 M NaBH nihai konsantrasyonlarda elde edilen, 100 mM NaOH içinde 2 M, NaBH4 500 ul ekle
  • İnkübasyonun ilk saat esnasında, hafifçe tüpün her 15 dakikada karıştırılır. Bu jel parçaları parçalanabilir, çünkü güçlü ajitasyon kaçının. Iyi dengelenmiş bir inkübatör / fırın ya da bir ısıtma bloğu içinde, reaksiyonun gerçekleştirilmesi. Jel parçacıkları, reaksiyon çözeltisi ile kaplanmıştır emin olun.
  • Kuluçka veya ısıtma bloğundan numune tüpü kaldırma ve buz üzerine yerleştirerek reaksiyonu durdurun.
    Not: β-eliminasyon reaksiyonu 18 saat ilerlemesine izin verdikten sonra, tuz giderme işlemi, aynı gün içinde gerçekleştirilmelidir.
  • Katyon değişimli kromatografi ile 3. Tuzdan arındırma

    1. Buz üzerinde numune tüpü muhafaza aşırı ısı oluşumunu önlemek için de, yavaş yavaş baz nötralize etmek için% 10 asetik asit (AcOH) damla damla ilave edildi. Yavaşça AcOH'nin eklemeler arasında numune tüpü vorteks. Yavaş yavaş asit eklemek için dikkatli olun ve Additi gibi damla damlaasit kabarcıkların bir "volkan" üretecek. Gerekirse, kabarcıklar ortadan kaldırmak ve sonra akışının önlenmesi için tüp santrifüjleyin.
      1. Reaksiyon karışımı içinde sodyum büyük miktarda ortadan kaldırmak için, küçük bir katyon-değiştirme sütunundan (Dowex veya Ag-50W-X8 reçine H + biçimi) içinden, reaksiyon karışımına geçmesi.
      2. 1 M NaOH ile katyon değiştirme reçinesi yıkayın 1 M HCI reçine, analitik sınıftadır olsa bile, MS analizi müdahale işleme kirleticileri çıkarmak amacıyla kullanılmadan önce.
      3. 1 M NaOH içinde reçine daldırın ve kaptan kaba aktarma ile uzaklaştırın. Daha sonra 1 M HCI ekleme, su çıkarmak, de-iyonize edilmiş su ilave edilir.
    2. Reçine Yukarıdaki çözelti renksiz olana kadar bu adımları tekrarlayın. 4 ° C'de% 5 AcOH deiyonize su ve mağaza ile temizlenmiş reçine yıkayın.
    3. Küçük bir cam kolon, çizik ve pipet konik yaklaşık 1 cm uzunluğunda böylece seramik kesici kullanılarak Pasteur cam pipet ucu kırmak için. Cam yünü, bir fiş ayrı kadar dalga ve reçine, yatak için bir destek oluşturan ucuna doğru itin. Bir cam test tüpü üzerinde bir kelepçe veya clothespin ve yer ile pipet sütun sabitleyin.
    4. 1 ml metanol (MeOH) ve 3 ml% 5 AcOH ile boş pipet yıkayın. Girdap H +, Dowex ya AG50 katyon değiştirme reçine cıvık çamuru% 5 AcOH içinde depolanır ve bir Pasteur pipeti sütununda bir 1 ml yatak hacmi elde etmek için bulamacın yeterli aktarın.
    5. % 5 AcOH beş hacim kullanılarak sütun durulayın. Reçine parçacıkları bir görünüm için içinden akar ve reçine algılanırsa, sütun kullanmayın edin.
    6. Yeni bir vidalı kapaklı cam borunun (16 x 125 mm) ve yük numune üzerinde sütun. Yoluyla akışı toplamak ve aynı tüp içine,% 5 AcOH en az 3 hacim glikanları elüte.
    7. Parafilm ile tüp örtün ve bir iğne ile küçük bir delik açmak. -80 ° C'de ya da kuru buz üzerinde numune tüpü yerleştirin. Dondurulmuş sonra liyofilizasyon ile örnek kurutun. -20 ° 'de kurutuldu, malzemenin saklayınKullanılana kadar ° C.

    4. Borat Kaldırma

    1. MeOH içinde% 10 AcOH hazırlayın. Buzlu asetik asit, 10 ml alın ve metanol ile, 100 ml hacim ayarlayın. 6 aya kadar Teflon-kaplı bir kapakla bir cam şişe içerisinde, bu reaktif saklayın.
    2. Kurutulmuş, liyofilize örnek tüpü ve girdaba MeOH içinde% 10 AcOH 300 ul ekle. Bir N2 akımı altında buharlaştırma ile elde edilen trimetil borat çıkarın.
      Not: asidik koşullar altında, metanol ile borat tuzları karıştırma, uçucu bir bileşik olup, trimetil borat üretir.
    3. 37 ° C de N2 akımı altında kurutulur. Aşama 4.2 de tarif edildiği gibi kurutma işleminden sonra, MeOH içerisinde AcOH ayrı bir bölüntüsünün ilave edin. Nitrojen altında, 5 dakika (N2) altında, 37 ° C'de akışı için sıvıyı kurutun.
      1. Tekrar yeniden süspansiyon, kurutma en az 3 kez. Kullanılana kadar -20 ° C de kurumuş maddenin saklayın.

    5. C18 Temizlik-up

    1. Bir C18 kartuşu kolonu dengeyeACN üç hacim ve% 5 AcOH beş hacim ile (boyut 1 mi, 100 mg reçine). Hafif pozitif hava basıncı uygulanması ile dengeye çözümlerin geçişini hızlandırmak.
    2. Tuzdan arındırılmış ve borat-ücretsiz numune tüpüne% 5 AcOH'nin 500 ul ekleyin ve girdap tarafından çözülür.
    3. Dengelenmiş C18 kolonu üzerine yeniden süspansiyon haline getirildi örnek yükleyin ve bir cam vidalı somunlu bir tüpe (13 x 100 mm) içine doğru akışını toplamak. Zehir, O-glıkanlar, aynı tüp içine,% 5 AcOH 3 ml.
    4. , Tüp parafilm küçük bir iğne ile küçük delikler yapmak veya tüp kapağı gevşek kapalı PTFE-kaplı tapa kullanın ve -80 ° C'de veya kuru buz üzerinde örnek dondurmak. Liyofilizasyon ile ayrılması için kullanılabilir. Kullanılana kadar -20 ° C'de kurutuldu örnek saklayın.

    Permethylation 6. Taban hazırlanması

    NOT: sağlam permethylation ulaşmak NaOH bulamaç taze hazırlamak için. Permethylation reaksiyonları için kullanılan bütün cam yaygın temizlenmelidir.

    1. , Permethylation için temel reaktif hazırlamak temiz bir cam vidalı kapaklı bir tüp (13 x 100 mm),% 50 NaOH, 400 ul ekleyin. Susuz MeOH ve girdap 800 ul ekleyin.
    2. Ve beyaz bir çökelti oluşturmak üzere susuz dimetil sülfoksit (DMSO) ve vorteks 4 ml ilave edilir.
    3. Çökeltiyi pellet haline getirmek üzere, 1 dakika boyunca 600 x g'de santrifüjleyin. Süpernatant Pipet ve atın. Pelet susuz DMSO içerisinde fazladan bir 4 ml ilave edilir. Vortex.
    4. Adımı yineleyin 6.2 ve üç kez ya da hiç beyaz çökelti oluşana kadar 6.3 minimum.
    5. 3 mi susuz DMSO içinde topak taban çözülür ve yavaşça temiz bir Pasteur pipeti ile yukarı ve aşağı pipetleyerek karıştırın.
    6. Depolanan olamaz gibi aşağıdaki permethylation reaksiyon için hemen tabanını kullanın.

    Çıkış glıkanların 7. Permethylation

    1. C18 arıtıldı numunesi ve girdap veya süspansiyon haline getirmek için sonikasyon susuz DMSO içerisinde 200 ul ekle.
    2. Resusp 300 ul ekleörnek uçlu taban bulamaç hemen iyodometan 100 ul (Mel) ekleyin. Teflon astarlı kapakla boru mühürleyin ve kuvvetli bir şekilde girdap 5 dakika için karıştırın.
    3. , Permethylation reaksiyonu durdurmak buz ve vorteks% 5 AcOH'nin 2 ml ekleyin. Pipet çözüm yukarı ve aşağı 5 kat buharlaşma ile Mel kalan hacmini azaltmak için.
      NOT: AcOH solüsyonu nötralize ve Mel çıkarılması faz-bölme sırasında su fazına sülfatlanmış glıkanların ekstraksiyon verimini artırır.
    4. Diklorometan (DCM) ve vorteks 2 ml ilave edilir. Oda sıcaklığında 1 dakika boyunca 600 x g'de santrifüj sulu ve organik fazlar ayrıldı.
    5. Yeni bir cam boru (13 x 100 mm) içine üst tabaka (permetilatlı sülfatlanmış glıkanların çoğunluğu içeren sulu faz) aktarın.
    6. Organik faz ve vorteks H2O 2 ml ilave edilir. 600 x 1 dakika süreyle santrifüj, sulu ve organik fazların ayrılması ve köknar ile ikinci bir sulu faz birleştirmekst sulu faz (aşama 7.5).
    7. Adımı tekrar 7.6 ile 7.5 üç defa daha, fakat daha sonraki bölümlerinde ortaya çıkan sulu faz kaydetmek için bir ihtiyaç vardır.
    8. Alt tabaka (organik faz) mümkün olduğu kadar nihai üst tabaka (sulu faz) çıkarın ve temiz bir Pasteur pipeti kullanılarak, ayrı yeni bir cam tüp içine alt katman (organik faz) aktarın.
    9. 42 ° C de N2 akımı altında, organik faz kurutun.
    10. Kullanılana kadar -20 ° C'de Parafilm ile tüp ve mağaza örtün.

    Sulu Faz permetilatlı Sülfatlanmış O-glıkanların 8. C18 Temizleme

    1. ACN üç hacim ve% 5 AcOH beş hacim bir C18 kartuşu kolonu dengeye getirin.
    2. Toplanmış ve adımlar kolona 7.5 ve 7.6 kombine sulu fazlar yükleyin.
    3. Duyunun tuzunun giderilmesi amacıyla H2O ile 10 ml sütun yıkayın.
    4. Zehir permetilatlı sülfatlanmış 2 ml yeni bir cam tüp içine, O-glıkanlar% 50 ACN. Daha büyük oligosakaritlerde permetilatlı sülfatlanmış O-glıkanların geri kazanımını artırmak için% 85 ACN ile ek bir elüsyon kullanın.
    5. 42 ° C'de, azot akımı altında kuru yıkama sıvıları.
    6. MS analizi öncesinde 6 ay -20 ° C de kurumuş maddenin saklayın.

    Permetilatlı O-glıkanların 9. Kütle Spektrometre

    1. 210 ° C sıcaklıkta kılcal 0,40-0,60 ul / dakikalık bir şırınga akış oranında bir nanoelectrospray kaynağı kullanılarak uygun bir kütle spektrometresi içine doğrudan infüzyon ile permetilatlı O-glikanlar analiz edin. MS / MS ve bir iyon tuzağı enstrüman MS n CID tarafından parçalanma,% 30-40 çarpışma enerjisini geçerlidir.
    2. Negatif iyon kipi için, yeniden yapılandırmak permetilatlı sülfatlı, O-glıkanlar, metanol / 2-propanol / 1-propanol, 50 ul / 13 mM sulu amonyum asetat (16: 3: 3: 2 hacim itibarı ile). Pozitif iyon modu için, 1 mM sodyum hidro 50 ul / nötr siyalilleştirilmiş O-glikanlar permetilatlı tekrar oluşturmakmetanol / su içinde xide (1: 1).
    3. Bireysel O-glıkan yapılara 13,19 karakterize etmek MSn analiz için Xcalibur yazılım paketi sürüm 2.0 toplam iyon eşleme (TİM) ve nötr kayıp tarama (NL tarama) işlevini kullanın.

    Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

    Representative Results

    or Start trial to access full content. Learn more about your institution’s access to JoVE content here

    In-jel İndirgemeli β-Eleme Etil Asetat Tedavisinin Etkisi önce

    -Jel indirgeyici β-eleme kullanarak müsin sığır serbest permetilatlı O-bağlantılı glıkan numune temsili kütle spektrumu, Şekil 3 de gösterilmiştir. Jel parçalarının EtOAc yıkama etkin bir sonraki MS analizi 27 müdahale SDS içinde ve poliakril kirletici maddeleri ortadan kaldırır.

    Şekil 3,
    Önce-jel indirgeyici β-eleme poliakrilamid jel parçası Şekil 3. Etil asetat yıkama serbest glikanların algılanmasını artırır. Etil asetat, sığır alt çene musini gelen jel β-gidermede permetilatlı O-bağlantılı glıkanların kütle spektrumu ile yıkama olmadan (A), çok-dağılımlı bir ortak bir bolluk hakimdirhemen hemen tamamen O-bağlantılı glıkanların ilişkili MS sinyalleri örttüğü ntaminant. (B), yıkama, etil asetat ile jel parçası glıkanların duyarlı bir saptanmasına olanak tanıyan, kirletici tepe noktaları ortadan kaldırır. Kumagai 25 Modifiye.

    O-bağlantılı glıkan geri kazanımı küçük jel dilimlerinden Daha olan

    O-bağlantılı glıkanların-jel indirgeyici β-eleme ya küçük kesildi jel parçalarının (~ 2 x 2 mm) ya da büyük (~ 5 x 5 mm) kullanılarak, musin sığır alt çene serbest bırakıldı. Jel adet küçük ~ 2 x 2 mm verimli yıkama adımlarında kurtarıldı değildi daha. Ardından permethylation bir permetilatlı dış glıkan standart bilinen bir miktarının, (maltotri- ve maltotetrasaccharide, DP3 ve DP4) glıkan iyileşme 27 miktarlarının kolaylaştırmak için her bir oyuğa ilave edildi. Küçük jel parçaları, O-bağlantılı glıkanların iyileşme hemen hemen (büyük jel dilimlerinden fazla 10 kat daha fazla idiŞekil 4).

    Şekil 4,
    Küçük jel parçalarından Şekil 4. Glikan geri büyük parçalardan çok daha verimlidir. Küçük parçalar (~ 2 x 2 mm) daha büyük küpler (~ 5 x 5 mm), daha glıkan vermiştir. Barlar MS analizi önce yayımlanmış glıkan ilave edildi, bir dış standart (% 100 olarak ayarlanmış maltotrisaccharide DP3) için tespit sinyaline normalize tüm O-bağlantılı glıkan yapıların toplamı için nispi sinyal yoğunluklarının göstermektedir. Değerler n = 3, ortalama standart sapma değerleridir. Kumagai K 25 Modifiye.

    Faz Partition tarafından Sulfoglycans zenginleştirilmesi

    Bir permetilatlı sülfatlanmış glıkan standart (sülfo-le) bileşiği, sulu faz içinde geri kazanıldı. Inci serbest permetilatlı siyalilleştirilmiş glıkanlarE DCM safhasına bölündü glikoprotein (Şekil 5), musin. Sulu-organik bir bölme ile, her permetilatlı glıkanların geri kazanım, daha önce karakterize edilen C18 Sep-Pak temizleme yöntemi 27 ile karşılaştırılabilir düzeydedir. Faz bölüm yönteminin verimliliği ve sadeliği büyük örnek hacmi ve daha sonraki analitik yaklaşımlar kolaylaştırır.

    Şekil 5,
    Faz bölümü tarafından sülfo- ve sialo-glıkanların Şekil 5. Diferansiyel kurtarma. Sığır musin glikoproteini indirgeyici β-eleme tabi tutulmadan önce, bir sülfo-glikan standardına (sülfo-le) olarak bilinen bir miktarı ile tutturuldu edildi. Çıkış glıkanlar permetilatlı ve permethylation reaksiyon 1 'e ayarlandı: 1 su: DCM konulmuştur. Nihai organik ve sulu fazlar ayrıldı ve MS ile analiz edilmiştir. Glikan geri rel nicelleştirilmiştirMS analizden önce numunenin içine çivili edildi permetilatlı dış glukanıdır standartlarına ative. Organik (DCM) ve sulu içine Glikan geri kazanma (Su) fazlar% 100 olarak ayarlandı dış standart ile, nisbetle gösterilmektedir. Sulfoglycans organik faz içinde saptanamaz hale gelmiş ve sayısal sulu fazda iyileşti. Sonuçlar Üç bağımsız deneyin ortalama ± ortalamasını temsil etmektedir. Kumagai 25 Modifiye.

    Biyolojik örnekler In-derinlik Proteomik Başvuru ve Glycomic Analizleri

    İnsan tükürük proteinler SDS-PAGE ile ayrılmış ve Coomassie Brillant Blue (G-250) ile boyanmıştır. MW ~ 600 kDa bir moleküler ağırlığı yüksek olan protein jelden kesilip çıkarıldı ve jel parçasının bir bölümünün MUC5B 16,24 bu bant tanımlanan-jel triptik sindirimi ve LC-MS / MS tabanlı proteomik analizlerine tabi tutuldu ve . Jel parçanın geri kalanı-jel Redu tabi tutuldu ve O-glıkan analizi 27 ktif β-eliminasyonu. Aşağıdaki permethylation ve sulu-organik faz bölümü (su: DCM 1: 1), sulu ve organik fazda glıkanlar, NSI-MS ile analiz edilmiştir permetilatlı. Sülfatlı olmayan 3 HexNAc 2 Fuc 1 Hek O-glıkanlar organik fazdan geri kazanılmıştır ve permetilatlı sulfoglycans tüm örneğin hemen hemen izobarik sülfatlı olmayan sülfatlanmamış glikanların, tanımlanması ve karakterizasyonu kolaylaştırır sulu fazdan, elde edildi permetilatlı GalNAc-ol (m / z = 1606,8, [M + Na] +) ve (yani 3) 1 NeuAc 1 Fuc 1 Hek 2 HexNAc 1 GalNAc-ol (m / z = 1606,7; [M + 2Na-H] +) Sadece 0.1 kütle birimleri tarafından farklı ve fiziksel olarak faz bölümü (Şekil 6) tarafından iki türlerin ayrılması olmadan çözmek zor olacaktır.

    pload / 51.840 / 51840fig6highres.jpg "width =" 700px "/>
    Sulu-organik bölüm ayrılmış nötr ve sülfo-glikanlarında İzobarik karmaşıklık 6. Algılama Şekil. Tarafından jel β-eliminasyonu ve su müsin insan tükürük serbest permetilatlı O-glıkanların toplam iyon haritalama (TİM) analizi ile tespit ana iyonların elde MS 2 parçalanma desenler permethylation aşağıdaki DCM bölüm. M / z = 1608, (B) yaklaşık 2.8 kütle birimi penceresi DCM fazının TİM analizi (A), MS 2 su fazı TİM analiz için aynı kütle penceresinin MS 2 spektrumu. DCM-fazında, büyük fragman iyonları Hex 1 -O (m / z 1370,8), Fuc 1 Hek 3 HexNAc kaybı 2 + Na (1331,8), Fuc 1 kaybı Hex 1 -O (1196,7), kayıp tekabül Fuc 1 Hex 1 HexNAc 1 (1143,6), kayıp Hex 1 HexNAc 1 (969,5), kayıpFuc 1 Hex 2 HexNAc 1 -O (747,4), Fuc 1 Hex 1 HexNAc 1 + Na (660.4) ve Hex 1 HexNAc 1 + Na (486,3). Spektrumun sağında gösterildiği gibi, bu parça iyonlarının göre, Fuc 1 Hek 3 HexNAc 2 GalNAc-ol bir bileşimi ile, sülfatlı olmayan yapıların bir karışımı önerilmiştir. Bunun aksine, su fazı için önemli bir fragman iyonları SO3 Na (1486,8) NeuAc bölgesinin kaybı (1231,5), Fuc 1 Hek 1 -O (1196,7), NeuAc kombinasyonu kaybı kaybı kaybı ve SO3 Na (vardır 1111,8) ve NeuAc 1 kaybı -O (1009,4 Hex 1). 1 NeuAc 1 Fuc 1 Hex 2 HexNAc 1 GalNAc-ol önerilmektedir - bir kompozisyon (SO 3) ile sülfatlı yapıların bir karışımı. MS 2 yorumlayarak faz bölümü ile nötr ve sulfoglycans fiziksel ayrımı olmaksızın, bu tür karışımların spektrumları önemli ölçüde daha fazla challenging. Kumagai 25 Modifiye. rakamın daha büyük bir versiyonunu görmek için lütfen buraya tıklayınız.

    Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

    Materials

    Name Company Catalog Number Comments
    Water, deionized water Sigma-Aldrich  270733-4L CHROMASOLV, for HPLC
    Acetic acid, Glacial Fisher A38-500 Certified ACS ≥99.7% w/w
    Methanol Sigma-Aldrich  34860-4L-R CHROMASOLV, for HPLC, ≥99.9%
    Ammonium bicarbonate Fluka 09830-500G BioUltra, ≥99.5% (T), Step 1
    Acetonitrile Sigma-Aldrich  34998-4L CHROMASOLV Plus, for HPLC, ≥99.9%, Step 1
    Ethyl acetate Fluka 34972-1L-R LC-MS CHROMASOLV, Step 1
    Sodium borohydride Aldrich 213462-25G ReagentPlus, 99%, Step 2
    Iodomethane Sigma-Aldrich  289566-100G ReagentPlus, 99.5%,  Step 6.  Store at 4 °C until use.  Sit at room temperature before use.
    Sodium hydroxide solution, 50% w/w Fisher SS254-1 Certified, Step 6
    Dimethyl sulfoxide, anhydrous Sigma-Aldrich  276855-1L Anhydrous, ≥99.9%, Step 6
    Methanol, anhydrous Sigma-Aldrich  322415-100ML Anhydrous, 99.8%, Step 6
    Dichloromethane Sigma-Aldrich  34856-4L CHROMASOL®, for HPLC, ≥99.8%, contains amylene as stabilizer, Step 7
    Dowex 50WX8 hydrogen formhydrogen form 100-200 mesh Sigma-Aldrich  217506-500G Step 3
    AG 50W-X8 Resin  Bio-Rad 142-1441 Step 3
    BAKERBOND spe 1 ml x 100 mg Solid Phase Extraction Column, PP, Octadecyl (C18) Reverse Phase JT Baker JT-7020-01 Step 5 and 8
    7.5% Mini-PROTEAN TGX Precast Gel  Bio-Rad Step 1
    Bio-Safe Coomassie Stain  Bio-Rad 161-0786 G-250, Step 1
    Silver Stain Kit for Mass Spectrometry Pierce 24600 Step 1
    Oligosaccharides Kit (Maltotriose, Dp3: R474140) Supelco  47265
    Oligosaccharides Kit (Maltotetraose, Dp4: R474135) Supelco  47265
    Disposable Pasteur Pipets, Glass, Short Tip VWR 14673-010 Wash before use
    PYREX 13 x 100 mm Disposable Round Bottom Threaded Culture Tubes Corning 99447-13 Wash before use
    PYREX 16 x 125 mm Disposable Round Bottom Threaded Culture Tubes Corning 99447-16 Wash before use
    Phenolic Caps/Closures with PTFE-Faced Rubber Liner Kimble 45066C-13 Wash before use
    Phenolic Caps/Closures with PTFE-Faced Rubber Liner Kimble 45066C-15 Wash before use
    Hamilton HPLC syringe HAMILTON 81265 volume 500 μl, needle size 22 G
    Hamilton HPLC syringe HAMILTON 81165 volume 250 μl, needle size 22 G
    Hamilton HPLC syringe HAMILTON 81065 volume 100 μl, needle size 22s G
    Hamilton HPLC syringe HAMILTON 80965 volume 50 μl, needle size 22s G
    Hamilton Calibrated Syringes HAMILTON 80300 volume 10 μl, needle size 26s G
    Petri Dish Glass 100 mm x 15mm GSC INTERNATIONAL INC 1500-4 Wash before use, Step 1
    Bard-Parker Surgical Blades Fisher 371310 Step 1
    Reacti-Therm Heating/Stirring Module Pierce 18870 Step 1, 4 and 7
    Heating Blocks Fisher 125D Step 2
    Pyrex fiber glass wool borosilicate pore size 8 μm Aldrich CLS3950 Step 3
    Fused Silica CutterTubing cutter alltech 3194 Step 3
    Multi-tube vortexers  VWR 444-7063 Step 6
    Lyophilizer 25EL Freezemobile Virtis 25EL
    Centrifuge VWR Clinical 50
    LTQ Orbitrap Discovery Thermo Fisher Scientific

    DOWNLOAD MATERIALS LIST

    References

    1. Varki, A. Biological roles of oligosaccharides: all of the theories are correct. Glycobiology. 3, (2), 97-130 (1993).
    2. Ohtsubo, K., Marth, J. D. Glycosylation in cellular mechanisms of health and disease. Cell. 126, (5), 855-867 (2006).
    3. Moremen, K. W., Tiemeyer, M., Nairn, A. V. Vertebrate protein glycosylation: diversity, synthesis and function. Nat. Rev. Mol. Cell Biol. 13, (7), 448-462 (2012).
    4. Lowe, J. B., Marth, J. D. A genetic approach to Mammalian glycan function. Annu. Rev. Biochem. 72, 643-691 (2003).
    5. Yan, A., Lennarz, W. J. Unraveling the mechanism of protein N-glycosylation. J. Biol. Chem. 280, (5), 3121-3124 (2005).
    6. Washburn, M. P. Utilisation of proteomics datasets generated via multidimensional protein identification technology (MudPIT). Brief Funct. Genomic Proteomic. 3, (3), 280-286 (2004).
    7. Rosenfeld, J., Capdevielle, J., Guillemot, J. C., Ferrara, P. In-gel digestion of proteins for internal sequence analysis after one- or two-dimensional gel electrophoresis. Anal. Biochem. 203, (1), 173-179 (1992).
    8. Hellman, U., Wernstedt, C., Gonez, J., Heldin, C. H. Improvement of an 'In-Gel' digestion procedure for the micropreparation of internal protein fragments for amino acid sequencing. Anal. Biochem. 224, (1), 451-455 (1995).
    9. Morelle, W., Canis, K., Chirat, F., Faid, V., Michalski, J. C. The use of mass spectrometry for the proteomic analysis of glycosylation. Proteomics. 6, (14), 3993-4015 (2006).
    10. Mortz, E., Sareneva, T., Haebel, S., Julkunen, I., Roepstorff, P. Mass spectrometric characterization of glycosylated interferon-gamma variants separated by gel electrophoresis. Electrophoresis. 17, (5), 925-931 (1996).
    11. Kuster, B., Wheeler, S. F., Hunter, A. P., Dwek, R. A., Harvey, D. J. Sequencing of N-linked oligosaccharides directly from protein gels: in-gel deglycosylation followed by matrix-assisted laser desorption/ionization mass spectrometry and normal-phase high-performance liquid chromatography. Anal. Biochem. 250, (1), 82-101 (1997).
    12. Kuster, B., Mann, M. 18O-labeling of N-glycosylation sites to improve the identification of gel-separated glycoproteins using peptide mass mapping and database searching. Anal. Chem. 71, (7), 1431-1440 (1999).
    13. Aoki, K., et al. The diversity of O-linked glycans expressed during Drosophila melanogaster development reflects stage- and tissue-specific requirements for cell signaling. J. Biol. Chem. 283, (44), 30385-30400 (2008).
    14. Kozak, R. P., Royle, L., Gardner, R. A., Fernandes, D. L., Wuhrer, M. Suppression of peeling during the release of O-glycans by hydrazinolysis. Anal. Biochem. 423, (1), 119-128 (2012).
    15. Schulz, B. L., Packer, N. H., Karlsson, N. G. Small-scale analysis of O-linked oligosaccharides from glycoproteins and mucins separated by gel electrophoresis. Anal. Chem. 74, (23), 6088-6097 (2002).
    16. Thomsson, K. A., Schulz, B. L., Packer, N. H., Karlsson, N. G. MUC5B glycosylation in human saliva reflects blood group and secretor status. Glycobiology. 15, (8), 791-804 (2005).
    17. Taylor, A. M., Holst, O., Thomas-Oates, J. Mass spectrometric profiling of O-linked glycans released directly from glycoproteins in gels using in-gel reductive β-elimination. Proteomics. 6, (10), 2936-2946 (2006).
    18. Anumula, K. R., Taylor, P. B. A comprehensive procedure for preparation of partially methylated alditol acetates from glycoprotein carbohydrates. Anal. Biochem. 203, (1), 101-108 (1992).
    19. Aoki, K., Perlman, M., Lim, J. M., Cantu, R., Wells, L., Tiemeyer, M. Dynamic developmental elaboration of N-linked glycan complexity in the Drosophila melanogaster embryo. J. Biol. Chem. 282, (12), 9127-9142 (2007).
    20. Domon, B., Costello, C. E. A Systematic Nomenclature for Carbohydrate Fragmentations in Fab-Ms Ms Spectra of Glycoconjugates. Glycoconj. J. 5, (4), 397-409 (1988).
    21. Ashline, D., Singh, S., Hanneman, A., Reinhold, V. Congruent strategies for carbohydrate sequencing. 1. Mining structural details by MSn. Anal. Chem. 77, (19), 6250-6262 (2005).
    22. Lapadula, A. J., et al. Congruent strategies for carbohydrate sequencing. 3. OSCAR: an algorithm for assigning oligosaccharide topology from MSn data. Anal. Chem. 77, (19), 6271-6279 (2005).
    23. Ashline, D. J., et al. Carbohydrate structural isomers analyzed by sequential mass spectrometry. Anal. Chem. 79, (10), 3830-3842 (2007).
    24. Thomsson, K. A., et al. The salivary mucin MG1 (MUC5B) carries a repertoire of unique oligosaccharides that is large and diverse. Glycobiology. 12, (1), 1-14 (2002).
    25. Yu, S. Y., Wu, S. W., Hsiao, H. H., Khoo, K. H. Enabling techniques and strategic workflow for sulfoglycomics based on mass spectrometry mapping and sequencing of permethylated sulfated glycans. Glycobiology. 19, (10), 1136-1149 (2009).
    26. Yu, S. Y., et al. Priming mass spectrometry-based sulfoglycomic mapping for identification of terminal sulfated lacdiNAc glycotope. Glycoconj J. 30, (2), 183-194 (2013).
    27. Kumagai, T., Katoh, T., Nix, D. B., Tiemeyer, M., Aoki, K. In-gel β-elimination and aqueous-organic partition for improved O- and sulfoglycomics. Anal. Chem. 85, (18), 8692-8699 (2013).
    Kütle spektrometresi ile In-jel Geliştirilmiş İndirgemeli β-Eleme Kapsamlı O-bağlı ve için Sulfo-Glikomik
    Play Video
    PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

    Cite this Article

    Nix, D. B., Kumagai, T., Katoh, T., Tiemeyer, M., Aoki, K. Improved In-gel Reductive β-Elimination for Comprehensive O-linked and Sulfo-glycomics by Mass Spectrometry. J. Vis. Exp. (93), e51840, doi:10.3791/51840 (2014).More

    Nix, D. B., Kumagai, T., Katoh, T., Tiemeyer, M., Aoki, K. Improved In-gel Reductive β-Elimination for Comprehensive O-linked and Sulfo-glycomics by Mass Spectrometry. J. Vis. Exp. (93), e51840, doi:10.3791/51840 (2014).

    Less
    Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
    View Video

    Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

    Waiting X
    simple hit counter